01 - Doutorado - Patologia Experimental
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Item Alteração neurológica na infecção experimental murina por Candida parapsilosis e caracterização de antígenos solúveisSilva, Paula Leonello Álvares e; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Tatibana, Berenice Tomoko; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Ono, Mário AugustoResumo: Candida parapsilosis é um importante patógeno associado a infecções sanguíneas mas estudos sobre virulência e patogenicidade são escassos Considerando que estudo evidenciou alteração comportamental em camundongo infectado, avaliou-se efeito imunopatológico no decorrer de infecção sistêmica em camundongos, aliada a caracteriazação parcial de fator hemolítico de C parapsilosis Grupos de camundongo SWISS e BALB/c foram infectados por via endovenosa (1x18 leveduras/animal), sendo o primeiro por 56 dias e o segundo durante 7, 14, 28 e 56 dias, tendo como controle o PBS Foram analisadas: alterações comportamentais determinando-se número de giros/5min, detecção de células de Purkinje por imunofluorescência (anti-calbindin), contagem de células Purkinje por histopatologia, análise de apoptose utilizando anti-ligante de Fas por imunohistoquímica, no cerebelo de camundongos infectados durante 56 dias Determinou-se também antigenemia por CFU e ELISA CAPTURA, níveis de citocinas (INF-?, IL- 4, IL-17 e IL-1), expressão e atividade de indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO) no cerebelo de camundongos infectados durante 7, 14, 28 e 56 dias No decorrer de infecção foi avaliada também respostas imune humoral (ELISA), celular (DTH) anti “cell free antigen” (CFA) de C parapsilosis e citocinas circulantes (INF-?, IL- 4, IL-17 e IL-1) Para a caracterização de fator hemolítico, foi avaliada a atividade lítica de eritrócitos de camundongos utilizando CFA na forma nativa e aquecida (56°C, 1 h) e as frações de CFA obtidas por gel filtração (Sephadex G-1/12) e por filtração em Amicon (1k e 5k) Os níveis de carboidratos totais, capacidade de ligação à ConA e de reatividade aos anticorpos específicos (anti-eritrocito autólogo sensibilizado com CFA) foram determinados em frações de gel filtração Além disso, as frações foram analisadas por western blotting, investigada a capacidade de anticorpos neutralizarem a atividade hemolítica e foram determinados os níveis de IgG anti-fração hemolítica em camundongos infectados com C parapsilosis Os resultados demonstraram diminuição de células de Purkinje (p<,5) e correlação significativa entre a diminuição dessas células e o aumento no número de giros (r= 9876) e reação com anti- 12 ligante de Fas foi negativa, no cerebelo Detectou-se aumento significativo em CFU (7 e 14 dias) (p<,5), de todas as citocinas (7 dias) (p<,5) e expressão de IDO (7>14>28 dias) (p<,5) ou de atividade de IDO (7,14 dias) (p<,5) no cerebelo, em relação ao controle Além disso, níveis elevados de anticorpos IgG (p <,5) ou DTH (p <,5) a CFA (p <,5) (28 e 56 dias) e de níveis séricos de citocinas INF-? (7 e 14 dias) (p<,5), IL-1 (56 dias) (p<,5) e IL-17 (56 dias) (p<,5) foram detectados no decorrer de infecção de camundongos Concluímos pelos resultados que as respostas imunes especificas e modulação de citocinas devem participar na diminuição de carga fúngica no cérebro, mas por outro lado devem apresentar efeito imunopatológico, possivelmente com participação de IDO levando a diminuição quantitativa de células Purkinje no cerebelo e como consequência induzindo alteração comportamental dos camundongos infectados, o que requer estudos adicionais Em relação ao fator hemolítico, concluímos que o fungo C parapsilosis apresenta fator hemolítico de alta MM (~ 28kDa e ~ 3kDa), é termoestável e apresenta a capacidade de induzir resposta imune no decorrer de infecção e, se essa resposta específica participa na defesa, requer estudos adicionaisItem Alterações temporais de marcadores sistêmicos inflamatórios e oxidativos em dois modelos experimentais envolvendo exercício em humanos saudáveis e com síndrome metabólicaAlves, Thâmara; Guarnier, Flávia Alessandra [Orientador]; Cecchini, Rubens; Ramos, Solange de Paula; Venâncio, Emerson José; Luiz, Rodrigo CabralResumo: Após a realização de uma sessão de exercício não habitual, são observados sinais e sintomas de processo inflamatório local, como dor muscular tardia, edema, e perda de função (redução de força muscular e amplitude de movimento) Alguns autores utilizam, além desses sinais e sintomas, a quantificação sistêmica de citocinas proinflamatórias e marcadores de estresse oxidativo, a fim de avaliar a presença e/ou magnitude do dano muscular gerado por exercício O tipo de contração utilizada, preferencialmente, nesses estudos, é a excêntrica, que notadamente promove danos mais expressivos em miofibrilas, em virtude do alongamento das fibras durante a contração No entanto, a associação entre os parâmetros sistêmicos supracitados e a ocorrência de inflamação local induzida por exercício não é completamente elucidada na literatura O objetivo do presente estudo foi investigar se existe relação entre dano muscular gerado por exercício não habitual e a presença de marcadores sistêmicos de inflamação e estresse oxidativo Para isso, sete adultos jovens (idade: 25,7 ± 5,7 anos; massa corpórea: 76,3 ± 14,4 kg; altura: 176, ± 8, cm; IMC: 2476 ± 489 kg/m2) realizaram uma sessão aguda de exercício pliométrico (5 séries de 2 saltos em profundidade) Amostras de sangue e informações como dor muscular, limiar de dor à pressão, circunferência da coxa e salto vertical foram coletadas antes, imediatamente após, ,5; 24, 48 e 72 horas após o protocolo de exercícios Adicionalmente, foi realizado teste de contração isométrica voluntária máxima uma semana antes da realização do protocolo, 24, 48 e 72 horas após o mesmo As amostras de sangue foram utilizadas para análise de marcadores sistêmicos de inflamação normalmente usados na literatura corrente (TNF-a, IL-6 e IL-1) e parâmetros de avaliação do balanço redox (quimioluminescência estimulada por tert-butil, consumo de oxigênio, conteúdo de proteínas carboniladas, produtos avançados de oxidação de proteínas, e catalase) O protocolo de exercícios foi capaz de gerar dano muscular significante, em virtude do aumento da percepção de dor [aumento significante às 24 (P=,3), 48 (P=,4) e 72 horas (P=,15) após o exercício, em comparação ao momento basal] e perda de função [o salto vertical apresentou diminuição significante às 48 horas após a sessão (P=,3) e a contração isométrica máxima foi menor às 24 (P=15) e 48 horas (P=3), em comparação ao momento pré-exercício] Apesar de terem sido observados sinais de dano muscular induzido por exercício, os níveis sistêmicos das citocinas inflamatórias analisadas e os parâmetros de avaliação de estresse oxidativo não foram modificados ao longo do período de avaliação pós-exercício Isso mostra que o dano muscular induzido por exercício não é necessariamente acompanhado por aumento sistêmico de citocinas inflamatórias e marcadores de estresse oxidativo, mostrando que é necessário ter cautela quando estas variáveis são utilizadas para avaliar a presença e/ou magnitude do dano muscular induzido por exercícioItem Análise da produção de anticorpos IgY das características histológicas do baço e da medula óssea de galinhas poedeiras inoculadas com venenos de serpentesAndrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Loyola, Wagner; Ramos, Solange de Paula; Itano, Eiko Nakagawa; Pavanelli, Wander RogérioResumo: Acidentes ofídicos são causados principalmente por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e tratados pela administração de antissoro de mamíferos Como alternativa a este procedimento, a utilização de anticorpos IgY antiveneno produzidos em galinhas poedeiras tem sido avaliada nos últimos anos Neste trabalho foram realizados dois experimentos No primeiro experimento, foi investigada a participação do baço e da medula óssea na produção de anticorpos IgY em galinhas poedeiras white leghorn (Gallus gallus domesticus) imunizadas com veneno crotálico Amostras de soro e gema foram coletadas durante o experimento, para análise da produção de anticorpos IgY Ao final deste, o baço e a medula óssea dos animais foram coletados e submetidos à análise histológica Os resultados mostraram um aumento dos anticorpos IgY crotálico no soro e na gema, a partir do 32º dia após a primeira imunização Estes níveis permaneceram elevados à medida que foram administradas doses de reforço do veneno usado como antígeno A inoculação de veneno crotálico em galinhas poedeiras induziu a produção de anticorpos IgY, principalmente na polpa branca perielipsoidal do baço e também no espaço extravascular da medula óssea No segundo experimento, galinhas poedeiras foram imunizadas com venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e observadas durante 367 dias Os anticorpos IgY antiveneno foram coletados no soro e na gema dos ovos e avaliados segundo os seguintes parâmetros: níveis, avidez, padrão de reconhecimento antigênico e eficácia Os níveis de anticorpos IgY antibotrópico anticrotálico produzidos aumentaram significativamente após a segunda imunização e assim permaneceram até o final do experimento Índices significativamente elevados de avidez foram observados para anticorpos IgY antibotrópico no 142º dia e para anticorpos IgY anticrotálico no 232º dia após a primeira imunização Os anticorpos IgY antibotro pico reconheceram antí genos de massa molecular de 25 kDa e 5 kDa, enquanto os anticorpos IgY anticrota lico reconheceram principalmente antí genos de massa molecular de 14 kDa e 3 kDa Os antí genos foram mais bem reconhecidos ao final do perí odo experimental Utilizando amostras de soluções aquosas de anticorpos com concentração proteica de 15 mg/ml verificou-se que a solução contendo IgY antibotrópico apresentou eficiência 29µl/3DL5 e potência ,37mg/ml As amostras de solução aquosa contendo anticorpos IgY anticrotálico apresentaram eficiência 246µl/4DL5 e potência de ,829 mg/ml A produção de anticorpos IgY antibotrópico e anticrotálico pôde ser melhorada mediante administração de sucessivas doses dos venenos durante período de imunização superior a 6 meses, afim de se atingirem níveis de anticorpos e índices de avidez mais elevados A avidez elevada e a maior concentração dos anticorpos IgY antiveneno permitiram a neutralização de componentes tóxicos dos venenos inoculados, impedindo seus efeitos letais, sugerindo que estes anticorpos tenham aplicabilidade no tratamento de acidentes ofídicosItem Análise da reatividade de IgG/IgG2 a epítopos de carboidratos de espécies de Paracoccidioides e detecção de casos de Paracoccidioidomicose infecção na população de Guarapuava, PRVidal, Adriane Lenhard; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson José; Marquez, Audrey de Souza; Tatibana, Berenice TomokoResumo: Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelos fungos termodimórficos Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidiodies lutzii, sendo restrita a América Latina e endêmica no Brasil Acredita-se que a infecção ocorra pela inalação de propágulos fúngicos quando o solo é revolvido A PCM pode ser dividida em: (1) PCM infecção, sem sintomas, mas com reação positiva aos antígenos de Paracoccidioides spp, com prevalência muito variável entre regiões; e (2) PCM doença, classificada em (2a) PCM aguda, condição mais grave que ocorre em crianças e jovens ou (2b) PCM crônica, que ocorre em adultos e soma aproximadamente 9% dos casos A presente pesquisa objetivou: (a) avaliar a reatividade de IgG/IgG2 de pacientes crônicos aos epítopos de carboidrato de Paracoccidioides spp; (b) avaliar epidemiologicamente os casos de PCM infecção em Guarapuava, PR, Brasil A investigação dos epítopos de carboidrato foi feita por immunoblot (IB) de cell free antigens (CFA) de P brasiliensis B339 (anteriormente espécie S1), Paracoccidioides americana LDR3 (anteriormente P brasiliensis PS2) e P lutzii LDR2, tratados ou não com metaperiodato de sódio (SMP) IgG de coelho anti-P brasiliensis Pb18 e IgG/IgG2 de um pool de soros de pacientes com PCM doença reconheceram principalmente antígenos de alta massa molecular (hMM, >15 kDa), gp7 e gp43, sendo esta última não detectada em P lutzii LDR2 A reatividade aos antígenos diminuiu com o tratamento com SMP Conclui-se que não foi possível detectar gp43 em P lutzii LDR2 e, como P brasiliensis, seus principais antígenos apresentam epítopos de carboidrato reconhecidos pelos soros de pacientes com PCM No levantamento epidemiológico sobre PCM infecção, 359 soros foram analisados por ELISA para detecção de IgG contra CFA de P brasiliensis B339, P americana LDR3 e P lutzii LDR2 Gp43 de B339 serviu de teste confirmatório Estes antígenos foram também testados após tratamento com SMP para redução de reações cruzadas Reatividade em ELISA: CFA/SMP-CFA em geral 37,3/17,8%, B339 25,3/14,5%, LDR3 24,5/1,4%, LDR2 8,3/5,8%; gp43/SMP-gp43 7,2/4,7% Houve soros reagentes para mais de uma espécie IB de 37 soros selecionados demonstrou diferentes padrões de reconhecimento de gp43, gp7 e hMM Residência em zona rural e profissões relacionadas ao manejo do solo foram identificados como fatores de risco P brasiliensis parece ser a espécie prevalente na área, mas 21 soros de pessoas que declararam ter vivido apenas na região foram reagentes com antígenos de P lutzii LDR2 IgG anti-gp7 e -hMM foram avaliados em amostras reagentes, mas com baixa reatividade: gp7/hMM em geral 6,4/6,7% O uso de SMP ou antígenos purificados podem não ser adequados para levantamentos sobre PCM infecção na região avaliada, portanto, recomenda-se o uso de CFA-ELISA Apesar de Guarapuava ser uma cidade de economia agrícola e estar localizada em região endêmica de PCM, a baixa prevalência para PCM infecção era esperada, considerando-se que a região teve relatos anteriores de menor endemicidade de PCM doença do que outras áreas do Paraná, mas as características gerais encontradas assemelham-se à outros trabalhos publicadosItem Análise de polimorfismos genéticos das glutationa-S-transferases GSTM1 e GSTT1 e NAD(P)H quinona oxidoredutase (NQO1) na leucemia linfóide aguda infantojuvenil : suscetibilidade e prognósticoFujita, Thiago Cezar; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Oliveira, Karen Brajão de; Ono, Mario; Amarante, Marla Karine; Losi-Guembarovski, Roberta; Oliveira, Carlos Eduardo Coral de [Coorientador]Resumo: A leucemia é a forma mais frequente de câncer em crianças e adolescentes com menos de 14 anos de idade, representando cerca de 31% das doenças malignas antes dos 15 anos de idade A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica caracterizada por um acúmulo excessivo de células progenitoras imaturas linfoides no sangue e na medula óssea Trata-se de doença heterogênea em relação as alterações genéticas, resposta ao tratamento e prognóstico Embora a sobrevida global dos pacientes com LLA na infância após a quimioterapia tenha melhorado ao longo dos anos, atingindo taxas de cura de 8%, muitos estudos estão sendo desenvolvidos na tentativa de melhorar o diagnóstico e a eficácia dos protocolos terapêuticos atuais As glutationas S-transferases (GSTs), como como GSTM1 e GSTT1 e a NAD (P) H quinona oxidoredutase 1 (NQO1) são enzimas envolvidas na fase II das reações de detoxificação As quinonas são uma classe de compostos orgânicos derivados de hidrocarbonetos aromáticos, encontrados em vários sistemas biológicos Envolvida no metabolismo das quinonas, a enzima NQO1 é uma redutase que protege contra os efeitos tóxicos dos medicamentos anticâncer O gene NQO1 possui um polimorfismo rs18566 (C69T), o que leva a uma baixa atividade enzimática Como a enzima codificada por esse gene realiza uma etapa importante na homeostase celular, fica claro que a ausência ou diminuição de suas atividades podem levar a um aumento na toxicidade e suscetibilidade ao desenvolvimento de neoplasias malignas, como a LLA Os genes GSTM1 e GSTT1 têm um polimorfismo que causa a exclusão homozigótica do gene e leva a atividade enzimática alterada Assim, o presente estudo avaliou os polimorfismos nos genes NQO1, GSTT1 e GSTM1 em pacientes com LLA e controles livres de neoplasia e analisou os níveis plasmáticos de GST no risco de progressão e resposta ao tratamento Amostras de sangue periférico de 74 pacientes com diagnóstico confirmado e 115 controles tiveram seus DNAs genômicos extraídos e amplificados por metodologia baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR) para o polimorfismo do NQO1 O estudo caso-controle não indicou associação entre a presença das variantes polimórficas e a suscetibilidade a LLA ou sobrevida (OR: 83, CI95%: 5-139) No entanto, este polimorfismo foi correlacionado com a recidiva na LLA (p = ,3) No outro estudo, 64 pacientes com LLA e 68 controles foram analisados quanto aos polimorfismos dos genes GSTT1 e GSTM1 e os níveis plasmáticos de GST Ambos os polimorfismos não foram associados à suscetibilidade (GSTM1OR: 7, CI95%: 35 - 143; GSTT1 OR: 112, CI95%: 47-265) ou risco de recidiva de LLA e seus diferentes genótipos não alteraram os níveis plasmáticos de GST Entretanto, verificou-se aumento da concentração de GST na LLA em relação ao grupo controle (p<,1), mas não foi encontrada associação dos níveis plasmáticos de GST com os parâmetros analisados Assim, nas amostras analisadas, o gene NQO1 foi apontado como um possível candidato a marcador molecular de prognóstico ou progressão para a oncogênese da LLA, e os níveis aumentados de GST no plasma de pacientes com LLA sugerem um possível envolvimento no tratamentoItem Análise de polimorfismos genéticos, expressão gênica e metilação da região promotora do fator de transcrição FOXP3 : implicações na patogênese de subtipos agressivos do câncer de mamaHirata, Bruna Karina Banin; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Oda, Julie Massayo Maeda; Amarante, Marla Karine; Losi-Guembarovski, Roberta; Victorino, Vanessa Jacob; Oliveira, Karen Brajão de [Coorientadora]Resumo: O grau de heterogeneidade molecular e celular no câncer de mama e o grande número de eventos genéticos envolvidos no controle do crescimento celular, diferenciação, proliferação e metástase dependem da interação tumor-hospedeiro O câncer de mama consiste em um microambiente complexo que inclui, além das células neoplásicas e o estroma circundante, células do sistema imunológico As células T reguladoras (Tregs) são importantes na supressão de resposta imune efetora e desta forma podem contribuir para a tumorigênese Inicialmente acreditava-se que a proteína forkheadbox 3 (FOXP3) fosse exclusiva dessas células, no entanto alguns estudos têm encontrado expressão deste fator de transcrição também em células epiteliais, inclusive de mama, onde pode atuar como um gene supressor tumoral Sabe-se que polimorfismos genéticos podem modificar funcionalmente ou quantitativamente o FOXP3 Por outro lado, estudos tem mostrado que a regulação epigenética, como a metilação do DNA, é crucial para o controle de expressão do locus FOXP3 O presente estudo teve por objetivo analisar as variantes alélicas g143A>G (rs2232365) e g848A>C (rs3761548) entre pacientes com câncer de mama e mulheres livres de neoplasia mamária, o perfil de metilação da região promotora do gene, bem como sua expressão gênica O genótipo AA do polimorfismo g143A>G foi associado com maior chance de desenvolvimento do câncer de mama (p=,46) Enquanto o genótipo GG foi correlacionado com maior Ki-67 (p=,19) no subtipo HER2-superexpresso (HER2+) e estadiamento TNM mais avançado no subtipo triplo-negativo (TN) (p=32) O genótipo AA do polimorfismo g848A>C foi correlacionado com maior Ki-67 (p=18) e menor grau histológico no subtipo HER2+ (p=26) O haplótipo GA foi correlacionado com menor grau histológico (p=9) e maior Ki-67 (p=36) no subtipo HER2+ e maior estadiamento em TN (p=44), enquanto o haplótipo AC foi correlacionado com menor Ki-67 (p=5) e estadiamento (p=27), nos subtipos HER2+ e TN, respectivamente Além disso, o haplótipo AC foi correlacionado com maior expressão de RNAm de FOXP3 (p=39) O subtipo Luminal B HER2+ (LB) apresentou 2,6 vezes menos expressão de RNAm de FOXP3 comparado ao controle, enquanto o TN e HER2+ apresentaram uma expressão ligeiramente maior (1,6 e 1,8 vezes, respectivamente) A expressão de RNAm de FOXP3 não foi correlacionada com os parâmetros prognósticos das pacientes Não houve diferença do perfil de metilação entre os tumores benignos, carcinoma ductal in situ e invasivo (p=96), assim como não houve diferença entre o tecido tumoral e normal adjacente (p=63) O perfil de metilação também não foi correlacionada com a expressão de RNAm e proteica de FOXP3, bem como com parâmetros prognósticos Foi observada correlação significativa entre a expressão proteica citoplasmática de FOXP3 em células tumorais de mama com maior comprometimento de linfonodos (p=1) e uma tendência de correlação entre o infiltrado de células mononucleares FOXP3-positivas com maior grau histológico (p=68) Nossos resultados sugerem que no tumor de mama o perfil de metilação de FOXP3 não está unicamente relacionado com a regulação transcricional deste gene, podendo outros mecanismos estar envolvidos, como polimorfismos genéticos, uma vez que o haplótipo AC dos polimorfismos estudados mostrou correlação com a expressão gênica Além disso, este haplótipo foi correlacionado com menor índice de proliferação celular Ki67 e estadiamento, indicando que o RNAm de FOXP3 aumentado no tumor pode conferir melhor prognóstico No entanto, ao analisar a expressão proteica, observamos que quando localizado no citoplasma da célula tumoral o FOXP3 pode estar correlacionado à pior prognóstico, como comprometimento de linfonodos Desta maneira, sua influência no prognóstico pode depender da sua localização, assim como do subtipo tumoral de mamaItem Análise dos polimorfismos rs1801157 na região 3'UTR da quimiocina CXCL12 e rs1042522 no códon 72 do gene TP53 : implicações na patogênese da Leucemia Linfóide AgudaPerim, Aparecida de Lourdes; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Oliveira, Jaqueline Carvalho de; Breganó, José Wander; Losi-Guembarovski, Roberta; Custodio, Luiz Antônio; Fungaro, Maria Helena Pelegrinelli [Coorientadora]Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é caracterizada pela proliferação de células precursoras hematopoiéticas da linhagem linfóide na medula óssea É a neoplasia mais comum na infância e sua etiologia é ainda desconhecida O diagnóstico e a classificação das leucemias agudas baseiam-se na análise morfológica, na citoquímica e na imunofenotipagem celular Nos últimos anos, tem se verificado avanços no tratamento da LLA na infância, com mais de 8% de remissão No entanto, ainda são necessários marcadores adicionais para melhorar o prognóstico e o tratamento dos pacientes, especialmente nos casos onde ocorrem recidivas e resistência a quimioterapia convencional Nas células hematopoiéticas saudáveis, citocinas e quimiocinas podem proporcionar o estímulo para a proliferação, sobrevivência, auto-renovação e diferenciação O CXCL12 é um membro da família CXC de quimiocinas o qual se liga ao receptor CXCR4 e desempenha importante função na disseminação de tumores sólidos e também de doenças hematopoiéticas É conhecido que TP53, um gene supressor tumoral, atua na regulação do desenvolvimento e do crescimento celular, o qual codifica uma fosfoproteína com importante papel no reparo do DNA e na apoptose, consequentemente prevenindo a carcinogênese Tem sido verificado que os polimorfismos rs181157 na região 3´UTR da quimiocina CXCL12 e rs142522 no códon 72 do gene TP53 podem contribuir para a suscetibilidade e prognóstico do câncer por afetarem processos importantes como regulação metastática e supressão tumoral Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos verificar a frequência destes polimorfismos em uma amostra de 54 pacientes portadores de LLA e 58 controles livres de neoplasia, de mesma faixa etária, num estudo de associação do tipo caso controle, bem como correlacionar a presença de ambos os polimorfismos com o parâmetro prognóstico alto e baixo risco Os polimorfismos genéticos foram analisados por metodologias baseadas na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e a análise estatística utilizando-se o cálculo da Odds Ratio (OR) com Intervalo de Confiança a 95% (IC=95%) O estudo caso-controle indicou associações positivas para ambos os genes analisados: CXCL12: OR = 244; IC95%=15–564 e TP53: OR = 22; IC95%=13–47 Além disso, quando as duas variantes genéticas foram analisadas em conjunto, aumentaram significantemente em mais de cinco vezes o risco de desenvolver LLA (OR = 524; IC95%=139–1975) O parâmetro prognóstico alto e baixo risco foi avaliado em relação à presença das variantes genéticas, porém os resultados não indicaram uma significância estatística (OR=,56; IC95%=,15-2,11) Os polimorfismos analisados nos genes CXCL12 e TP53 se mostraram candidatos a marcadores de suscetibilidade para a LLA, especialmente quando ambos os genótipos de risco foram herdados pelo mesmo indivíduoItem Análise quantitativa de ocratina A (OTA) em plasma humano por ensaio imunoenzimático, e efeito citotóxico in vitro de OTA e FB1 em linhagem celular Jurkat e P3U1Rigobello, Fabiana Felipin; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Marquez, Audrey de Souza; Ono, Elisabete Yurie Sataque; Venâncio, Emerson José; Kwasniewski, Fábio Henrique; Hirooka, Elisa Yoko [Coorientadora]Resumo: Micotoxinas são metabólitos secundários de fungos pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium e são contaminantes naturais de alimentos no Brasil Ocratoxina A (OTA) e Fumonisina B1 (FB1) são classificados como possível carcinógenos para humanos e animais (grupo 2B) Esta pesquisa objetivou introduzir metodologia de ELISA para analisar e quantificar a presença de OTA em plasma humano e avaliar o efeito de OTA e FB1 in vitro em linhagem celular P3U1 e Jurkat Na primeira etapa do trabalho: (1) investigou-se a presença de OTA no plasma de pacientes por ELISA competitivo indireto usando anticorpos monoclonais (AcM) anti-OTA; (2) determinou-se a estimativa de ingesta diária de OTA por estes pacientes e; (3) avaliou-se a correlação da presença de OTA com marcadores plasmáticos de lesão hepática e renal Os resultados obtidos demonstraram que OTA foi detectada em 55% das amostras (733,6 ± 296,4 pg/mL, máximo 1584,6 pg/mL), com uma estimativa de ingesta diária de 983,1-1445,3 pg/kg de peso corporal Não houve correlação entre os níveis de OTA e parâmetros bioquímicos (AST, ALT, ureia e creatinina) Na segunda etapa, avaliou-se: (1) o efeito citotóxico de OTA e FB1, individualmente ou em associações, sobre linhagens celulares P3U1 e Jurkat, através do método de brometo de [3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (MTT) e dosagem de lactato desidrogenase (LDH) e; (2) a interação de AcM anti-OTA em células tratadas com OTA por imunocitoquímica A viabilidade das células foi reduzida com exposição à 9 µg/mL de micotoxinas após 24 h, sendo que OTA reduziu a viabilidade de P3U1 e Jurkat de forma semelhante, e FB1 somente de célula Jurkat O uso associado de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxico sobre as células Os métodos de MTT e LDH apresentaram forte correlação nas células Jurkat (r = ,749) e P3U1 (r = ,931) Imunocitoquímica confirmou a diminuição da viabilidade celular de Jurkat e P3U1 tratadas com OTA, bem como aumento de grânulos intracelulares marcados com substrato peroxidase e destruição da membrana plasmática com liberação do citosol, indicando a presença de OTA nestas células Conclui-se que pessoas no Brasil estão contaminadas por OTA, porém o nível de contaminação está abaixo do limite tolerável divulgado por órgãos internacionais, e possivelmente esse é o motivo pelo qual não se observou correlação entre os níveis plasmáticos de OTA e parâmetros bioquímicos de lesão hepática e renal Conclui-se com os resultados in vitro que a presença de OTA induz citotoxicidade, mas nas condições estudadas, a associação de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxicoItem Anticorpos e imunocomplexos aos antígenos dentinários em ratos e anticorpos salivares e resposta linfoproliferativa para frações de dentina humana associados à reabsorção dentária no tratamento ortodônticoCosta, Tânia Maris Pedrini Soares da; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Hidalgo, Mirian Marubayashi; Lima, Carlos Eduardo Oliveira; Marquez, Audrey de SouzaResumo: O potencial imunogênico da dentina tem sido atribuído a antígenos que estariam presentes na dentina, os quais poderiam ser expostos ao sistema imune durante os processos de reabsorção radicular como consequência do tratamento ortodôntico Este estudo teve como objetivo investigar em modelo animal, a resposta imune humoral sistêmica e local aos antígenos dentinários, a formação de imunocomplexos e os níveis séricos de antígenos dentinários solúveis; e em humano, os níveis de IgG salivar, a resposta linfoproliferativa à frações de dentina humana e a correlação entre os dados encontrados Em modelo experimental, quarenta ratos Wistar machos escolhidos aleatóriamente foram submetidos ao movimento de inclinação mesial do primeiro molar superior direito, por aplicação de uma força ortodôntica de 55 cN por 3, 7, 14 e 21 dias ou deixado sem tratamento (controle) Após cada periodo experimental, amostras de saliva, sangue e a maxila direita de cada animal foram coletadas para análise O estudo humano constituiu-se de 3 grupos Grupo I, formado por pacientes adolescentes (n=1) onde amostras de saliva foram coletadas em 4 periodos: antes (T), 3 (T3), 6 (T6) e 12 (T12) meses de tratamento ortodôntico, para análise dos níveis de reatividade da IgG salivar para as frações FI, FII ou FIII de extrato dentinário humano No grupo II (n=3), amostras de soro e células mononucleares do sangue periférico de pacientes adolescentes com 6 meses de tratamento ortodôntico foram coletadas para análise dos níveis de IgG sérica e resposta linfoproliferativa às frações de extrato dentinário humano FI ou FIII No terceiro grupo (n=16), voluntários adolescentes que nunca haviam se submetido à tratamento ortodôntico e sem sinais radiográficos de reabsorção radicular, serviram de controle para o segundo grupo de estudo O extrato dentinário total foi obtido à partir de incisivos de rato Wistar ou de dentes terceiros molares humano, respectivamente, sendo que em humano o extrato dentinário foi submetido à cromatografia de gel filtração, Sephadex G-12-15 A reabsorção radicular foi avaliada por análise histopatológica em microscópio óptico em modelo animal e através do método de subtração radiográfica digital dos incisivos superiores, em humano Os níveis de anticorpos, imunocomplexos e antígenos dentinários solúveis no soro foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA) Para o estudo da resposta linfoproliferativa, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humano estimuladas com frações dentinárias foram analisadas por ensaio MTT Níveis mais elevados de IgG sérica em ratos foram detectados em 14 e 21 dias em relação ao controle (p < 5) No entanto, em saliva foram detectados um aumento dos níveis de IgG salivar em 3 e 7 dias em comparação com o controle (p < 1) e uma diminuição de seus níveis em 21 dias em relação a 3 e 7 dias (p < 5) Níveis mais elevados de imunocomplexos no soro foram detectados em 14 e 21 dias (p < 1) e na saliva em 14 dias (p < 5) em relação ao controle, com uma diminuição em 21 dias em relação à 14 dias (p < 5) No grupo I humano foi observado uma maior reactividade da IgG salivar para a fração FII em relação à FIII em T6 e T12 (P < 5) e no grupo II houve uma correlação positiva significante entre proliferação de linfócitos e níveis de IgG sérica para a fração III (r = 58) Em conclusão, houve imunomodulação na resposta de anticorpos IgG salivar a antígenos dentinários durante o tratamento ortodôntico em ratos que diferem secreção sistêmica, da externa (saliva) Os níveis de imunocomplexos em soro ou saliva tem potencial para servir de marcadores biológicos, por indicar a fase ativa da reabsorção radicular Em humanos, mudança na reatividade IgG salivar para FII no decorrer do tratamento ortodôntico também sugerem o potencial desses anticorpos como marcadores biológicos para a detecção precoce da reabsorção radicularItem Antigenúria, níveis de anticorpos específicos e análise histopatológica de pulmões em ratos experimentalmente infectados com Paracoccidioides lutzii e Paracoccidioides brasiliensisChiyoda-Rodini, Franciele Ayumi Semencio; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Lenhard-Vidal, Adriane; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson JoséResumo: Paracoccidioides brasiliensis e a nova espécie Paracoccidioides lutzii são os agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), importante micose sistêmica amplamente distribuída na América Latina A glicoproteína Gp43, é o principal fator de virulência e é considerada padrão ouro no diagnóstico de P brasiliensis Porém tal glicoproteína é expressa em níveis não detectáveis em isolados de P lutzii, além disso, os dados relativos ao desenvolvimento da doença por PCM devido a esses fungos são escassos No presente estudo, comparou-se o efeito da infecção em ratos pelo fungo P lutzii (LDR2), não produtor de gp43 e por P brasiliensis (Pb18) Grupos de 5 ratos Wistar infectados (3x16 leveduras, iv) e grupo controle inoculado com PBS, foram eutanasiados 14, 28 e 56 dias após a infecção As amostras de urina foram analisadas por eletroforese, imunotransferência (IB) e a concentração de antígenos urinários totais e de gp7 determinados por ensaio imunoenzimático competitivo indireto (icELISA), utilizando anticorpos policlonais antiCFA de P lutzii e anti-CFA de P brasiliensis e anticorpo monoclonal anti-gp7, respectivamente Os níveis séricos de anticorpos IgG foram avaliados por ELISA e análise histológica de pulmão por coloração com Grocott Por eletroforese e IB, observou-se perfil distinto de bandas de antígenos entre as infecções por P lutzii e P brasiliensis Por icELISA, os níveis urinários de antígenos totais (CFA) foram significativamente maiores em ratos infectados por P brasiliensis em relação ao P lutzii, em todos os períodos analisados (P<5) Houve aumento em níveis de gp7 em todos os períodos analisados para ambos os grupos infetados, em relação ao grupo controle (p<5), porém em 28 dias de infecção o nível foi maior em infectado por P lutzii (p<5) Níveis séricos elevados de anticorpos IgG foram detectados em ambos, porém significativamente mais elevado em infectados por P brasiliensis (p<5) Pela análise histológica foi observada a presença de fungos em todos os 8 períodos em ambos os grupos, todavia em maior quantidade em animais infectados por P brasiliensis Pb18 Em conclusão, P lutzii (LDR2) possivelmente induz a PCM doença controlada, menos grave que a induzida por P brasiliensis em ratos, o que requer mais estudos Este estudo evidenciou pela primeira vez os principais antígenos P lutzii presentes em urinas de ratos infectados com P lutzii (LDR2)Item Associação das variantes dos genes tgfb1 (rs1800470 e rs1800469) e il10 (rs1800782) com parâmetros clínicos e laboratoriais em pacientes com artrite reumatoideIriyoda, Tatiana Mayumi Veiga; Simão, Andréa Name Colado [Orientador]; Reiche, Edna Maria Vissoci; Costa, Neide Tomimura; Poli, Regina Célia; Oliveira, Sayonara Rangel deResumo: Introdução: Na artrite reumatoide (AR) existe um desequilíbrio entre vias inflamatórias e regulatórias, com predomínio das respostas imunes mediadas por células Th1 e Th17 em detrimento das respostas imunes mediadas pelas células Th2 e T reguladoras Diferentes variantes genéticas podem afetar os níveis de expressão das citocinas e, dessa forma, desempenhar um papel na suscetibilidade e no curso da doença Objetivo: Avaliar a associação entre as variantes +869 T>C (rs1847) e -59 C>T (rs18469) do TGFB1 e -592 C>A (rs18782) do IL1 com suscetibilidade à AR, atividade da doença, presença de autoanticorpos e níveis plasmáticos de citocinas Metodologia: O estudo incluiu 262 pacientes com AR e 168 indivíduos saudáveis (grupo controle), de ambos os sexos, com idade entre 18 a 7 anos A atividade da doença foi determinada pelo escore DAS28 e os pacientes classificados em dois diferentes grupos: remissão/leve (DAS28<3,2) e moderada/grave (DAS28=3,2) Foram determinados os autoanticorpos Fator Reumatoide (FR) e anti-peptideo citrulinado cíclico (anti-CCP), a interleucina (IL)-1 e o fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-ß1) A variante -592 C>A do IL1 foi genotipada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e o polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) As variantes +869 T>C e -59 C>T do TGFB1 foram avaliadas por PCR em tempo real (qPCR) pelo método de TaqMan® Os valores de p foram ajustados para variáveis confundidoras como idade, sexo, etnia, índice de massa corporal, tabagismo e medicamentos utilizados no tratamento da AR Resultados: As variantes +869 T>C e -59 C>T do TGFB1, independentemente ou em combinação haplotípica, não foram associadas com a suscetibilidade à AR Pacientes com o genótipo TT da variante -59 C>T do TGFB1 apresentaram maior chance de apresentar DAS28=3,2 (OR 2,58, 95% CI 1,4–6,42, p=,41) do que os portadores dos demais genótipos Não foi observada associação entre as variantes genéticas e os níveis plasmáticos de TGF-ß1 no grupo AR como um todo; porém, a presença do genótipo CC da variante +869 T>C do TGFB1 no subgrupo de pacientes com FR ou anti-CCP positivo foi associada com baixos níveis de TGF-ß1 (p=,32 e p=,39, respectivamente) Pacientes com elevados títulos de FR (>9 U/mL) e presença do alelo C da variante +869 T>C do TGFB1 demonstraram maior frequência de DAS28=3,2 (p=,37) Quanto à variante -592 C>A do IL1, não foi observada associação com suscetibilidade à AR, DAS28 e níveis plasmáticos de IL-1 No entanto, pacientes com o genótipo AA da variante -592 C>A do IL1 apresentaram maior chance de apresentar FR positivo (OR 2,78, 95% CI 1,15–6,67, p=,22) Conclusão: Nossos resultados sugerem que as variantes TGFB1 +869 T>C e TGFB -59 C>T podem predizer a atividade de doença em diferentes subgrupos de pacientes com AR, de acordo com a positividade do FR A variante IL1 -592 C>A foi associada à presença de FR, independentemente da atividade da doença e outros fatores confundidores e, portanto, pode ajudar na identificação precoce de pacientes com um curso de doença mais grave e que podem se beneficiar de uma abordagem terapêutica individualizadaItem Associação das variantes genéticas do FOXP3 (rs2232365/rs3761548) e do TGFB1 (rs1800470/rs1800469) com parâmetros clínicos e laboratoriais do lúpus eritematoso sistêmicoStadtlober, Nicole Perugini; Simão, Andréa Name Colado [Orientador]; Reiche, Edna Maria Vissoci; Amarante, Marla Karine; Costa, Neide Tomimura; Flauzino, TamiresResumo: Introdução: O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune inflamatória crônica, caracterizada por alterações na resposta imune inata e adaptativa Variantes genéticas têm demonstrado alterar as respostas imunes e influenciar na suscetibilidade e gravidade da doença Objetivo: Avaliar a associação das variantes genéticas -924 A>G (rs2232365) e -3279 C>A (rs3761548) do FOXP3 e +869 T>C (rs1847) e -59 C>T (rs18469) do TGFB1, com a suscetibilidade e parâmetros clínicos e laboratoriais do LES Métodos e sujeitos: O estudo incluiu 23 pacientes com LES e 166 controles A atividade da doença foi determinada pelo índice de atividade da doença do LES (SLEDAI) e valores = 6 foram usados como parâmetro para classificar doença ativa e <6 para doença inativa As variantes do FOXP3 foram determinadas pela reação em cadeia da polimerase e polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição (PCR-RFLP) e as variantes do TGFB1 por PCR qualitativa (qPCR) Os níveis plasmáticos de TGF-ß1 foram determinados pelo ensaio imunofluorimétrico por microesferas para a plataforma Luminex Resultados: Foram demonstrados em dois artigos: no primeiro, o genótipo FOXP3 -3279 AA [OR 2,65, IC 95% (1,7–6,564), p=,35] e o alelo A [OR 2,644, IC 95% (1,14–6,333), p=,29] foram associados ao LES Pacientes com o genótipo FOXP3 -3279 CA+AA apresentaram menor frequência de nefrite (p=,38) E pacientes com o genótipo FOXP3 -924 AA apresentaram maior frequência de anti-dsDNA (p=,12) e antiU1RNP (p=,36) O haplótipo A/A (rs2232365/rs3761548) foi associado ao LES (OR 3,729, IC 95% 1,6–13,82, p=,49) enquanto que o haplótipo G/C conferiu proteção [OR ,598, IC 95% (376–952), p=,3] Pacientes com haplótipo GCGC apresentaram níveis plasmáticos de TGF-ß1 mais elevados (p=,12) do que pacientes com outros haplótipos E pacientes com haplótipo A/C (no modelo genético dominante) apresentaram maior score SLEDAI (p=,24) e no modelo genético recessivo, maior frequência de anti-dsDNA (p=,38), anti-U1RNP (p=,29) e nefrite (p=,49) No segundo artigo, o genótipo TGFB1 +869 CC foi associado à suscetibilidade ao LES [OR 1,71, IC 95% (1,2-2,866), p=,42] e à redução dos níveis plasmáticos de C4 (p=,4) e TGF-ß1 (p=,44) O genótipo TGFB1 -59 TT foi associado a níveis diminuídos de C4 (p=,32) Pacientes com genótipo TGFB1 +869 TC+CC e presença de anti-dsDNA apresentaram níveis plasmáticos de TGF-ß1 mais baixos do que TT (p=,4) Por outro lado, pacientes com genótipo TGFB1 +869 TC+CC e ausência de anti-dsDNA apresentaram níveis plasmáticos de TGF-ß1 mais elevados (p=,44) Conclusão: Do FOXP3 os resultados demonstraram que a herança de pelo menos um alelo A de cada variante (rs2232365/rs3761548) aumenta à suscetibilidade ao LES, atividade da doença e presença de nefrite; e a variante TGFB1 +869 T>C pode ser utilizada como um marcador genético para suscetibilidade ao LES, enquanto que ambas as variantes estão associadas com menores níveis de C4, um dos parâmetros laboratoriais de atividade da doença Além disso, os níveis plasmáticos de TGF-ß1 podem ser modulados pela interação entre o alelo TGFB1 +869 C, em homozigose ou heterozigose, e a presença de anti-dsDNA Nosso estudo demonstra que a investigação das bases genéticas nas doenças autoimunes pode favorecer o entendimento da imunologia no processo fisiopatológico e sugerir novos rumos na pesquisa terapêuticaItem Atividade anti-leishmania do ácido caurenóico e da trans-chalcona : efeito imunomodulador e mecanismo de açãoSapla, Milena Menegazzo Miranda; Pavanelli, Wander Rogério [Orientador]; Nakamura, Celso Vataru; Nakazato, Gerson; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Verri Junior, Waldiceu AparecidoResumo: Leishmanioses são doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania que exibem amplo espectro de apresentação clínica incluindo diferentes formas cutâneas e a forma visceral Essa diversidade de manifestações é atribuída principalmente à diferença entre as espécies do parasito, o estado imunológico do hospedeiro O tratamento atual da leishmaniose se baseia na eliminação das formas intracelulares, no entanto os fármacos disponíveis apresentam: eficácia variável, alto custo, dificuldade de administração e podem provocar graves efeitos colaterais Sendo assim, é cada vez mais necessário a busca por novos compostos que possam ser uma alternativa terapêutica para o tratamento da leishmaniose O ácido caurenóico (AC) e trans-chalcona (TC) são moléculas químicas isoladas de diferentes fontes naturais, e apresentam diversas propriedades biológicas, dentre elas: anti-inflamatória, antimicrobiana e antioxidante Entretanto, não existem estudos que tenham verificado o efeito dessas moléculas sobre protozoários de Leishmania visando elucidar os principais mecanismos de ação e propriedades imunomoduladoras envolvidas Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do AC e TC sobre Leishmania amazonensis, bem como os mecanismos de morte envolvidos na eliminação do parasito Previsões in silico mostraram que TC apresenta bom potencial para fármaco com alta biodisponibilidade oral e absorção intestinal Para verificar a ação das moléculas sobre formas promastigotas, foram utilizados AC nas concentrações de 1-9 µM e TC em 2-12µM A partir dos resultados obtidos, observou-se que ambos os tratamentos promoveram a eliminação das formas promastigotas TC induziu morte por mecanismos apoptose-like tardio, devido à produção de espécies reativas de oxigênio, despolarização mitocondrial, exposição de fosfatidilserina e permeabilização da membrana do parasito Em relação a ação antiamastigota intracelular, AC induziu perfil pró-inflamatório nos macrófagos infectados, com aumento nos níveis de óxido nítrico (NO), dependente de cNOS Além disso, o AC induziu o aumento na produção de IL-1ß e expressão do componente ativador de inflamassoma NLRP12 Esses resultados demonstram a capacidade leishmanicida de AC sobre amastigotas intracelulares por um mecanismo NLRP12 / IL-1ß / cNOS / NO Já o tratamento com TC promoveu a redução na produção de citocina inflamatória (TNF-a) e regulatórias (IL-1 e TGF-ß) e das espécies reativas de oxigênio e NO O tratamento com TC ainda induziu a expressão do fator nuclear eritróide 2 (Nrf2), responsável pela proteção celular em relação ao estresse oxidativo, modulando assim os níveis de ferro ligado a transferrina, colaborando para a eliminação do parasito Com base nos dados obtidos, podemos inferir que ambos os compostos apresentam atividade anti-leishmania e imunomoduladora, sendo AC e TC moléculas promissoras para o desenvolvimento futuro de uma terapia eficaz e não tóxica para o tratamento da leishmanioseItem Avaliação da exposição humana à aflatoxina B1 e M1 em lactantes e infantes e efeito imunotoxicopatológico de aflatoxina B1 em camundongos C57Bl/6Ishikawa, Angélica Tieme; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Elisabete Yurie Sataque; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Costa, Marcio Carvalho da; Venâncio, Emerson JoséResumo: A exposição humana e animal às aflatoxinas (AFs), por meio de alimentos e rações contaminados, é um problema mundial devido ao seu potente efeito carcinogênico, hepatotóxico e imunossupressivo A identificação do padrão de dieta, frequência de consumo, bem como determinação de níveis de metabólitos de AFs, como por exemplo aflatoxina M1 (AFM1), permitem fazer predições das relações entre dieta e saúde humana Dessa forma, considerando a maior vulnerabilidade de infantes às micotoxinas, um questionário de frequência de consumo alimentar foi aplicado em mães lactantes (n = 93, Norte do Estado do Paraná, Brasil), visando avaliar o consumo de alimentos comumente contaminados com aflatoxina B1 (AFB1) e AFM1, assim como foi estimada a exposição de infantes à AFM1 em amostras de leite materno (BM) e leite em pó infantil (IPM) comercial A média de consumo por mães lactantes foi de 2,73 g de milho/pessoa/dia e ,79 g de amendoim/pessoa/dia, consumo considerado abaixo da média da América Latina A extração de AFM1 em BM (n = 94) e IPM (n = 16) foi realizada em coluna de imunoafinidade (CIA) homemade e à contaminação avaliada por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) (BM, LOD: ,4 ng/g, LOQ: ,21 ng/g; IPM, LOD: ,3 ng/g, LOQ: ,16 ng/g) A AFM1 foi detectada em 5,3% e 43,8% das amostras de BM e IPM, com níveis médios de ,3 ng/g e ,11 ng/g, respectivamente Todas as amostras de IPM apresentaram níveis de AFM1 abaixo daqueles estabelecidos pela legislação Brasileira (5 ng/g) Consequentemente, a ingestão diária estimada (EDI) de AFM1 por infantes ( a 12 meses) apresentaram valores baixos (,19 a ,347 ng/kg peso corpóreo/dia) Em paralelo, os efeitos imunotoxicopatológicos de AFB1 foram investigados em camundongos C57Bl/6 (n = 5 cada grupo) utilizando uma única dose subclínica (44, 442 e 663 µg/kg de peso corpóreo, p c) administrado via gavagem Cinco dias após a exposição de AFB1, os seguintes parâmetros foram avaliados: a) função hepática por meio de análise de níveis séricos bioquímicos (ALT, ?-GT, proteína total) e histopatologia do fígado; b) resposta linfoproliferativa de células de baço aos mitógenos concanavalina A (ConA) e lipopolissacarídeo (LPS) por teste de MTT, níveis de citocinas hepáticas (IL-4, IFN-? e IL-17) por ELISA e contagem de células da medula óssea e, c) possível interferência de AFB1 na comunidade bacteriana fecal pelo sequenciamento em Ilumina MiSeq Todos os animais experimentais tratados mostraram alterações histológicas no fígado, porém com score significativo apenas na dose de 663 µg de AFB1/kg de p c e nesta dose foi detectado up-regulação significativa de níveis de IL-4 e IFN-? em fígado (p < ,5), todavia os parâmetros séricos bioquímicos permaneceram normais Nas doses de 442 e 663 µg/kg de p c houve uma supressão significativa na resposta linfoproliferativa a ConA, e aumento na contagem de leucócitos e neutrófilos, e na dose de 663 µg/kg de p c aumento de eritrócitos e megacariócitos na medula óssea O tratamento com 663 µg de AFB1/kg de p c aumentou a abundância relativa da família de bactérias Lachonospiraceae (p < ,5) Pelos resultados obtidos concluímos que as mães lactantes no Norte do Estado do Paraná apresentam menor consumo de alimentos comumente contaminados com AFB1 do que o consumo médio da América Latina e que a exposição de infantes à AFM1 na região é baixa Adicionalmente, uma única dose oral subclínica de AFB1 pode induzir lesões no fígado, imunomodulação e possível mudança na microbiota intestinal em camundongos C57BL/6 O estudo pode contribuir para melhor entendimento da necessidade do contínuo controle da qualidade de ração e alimento para minimizar o risco à saúde, especialmente a dos infantes Além disso, os efeitos sistêmicos de doses subclínicas de AFB1 devem ser explorados para maior compreensão da ação desta micotoxina, principalmente na avaliação da composição da microbiota intestinalItem Avaliação da infecção por Paracoccidioides brasiliensis e Leishmania sp. em animais silvestres de pequeno porteSbeghen, Mônica Raquel; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Tatibana, Berenice Tomoko; Itano, Eiko Nakagawa; Fertonani, Luciane Holsback Silveira; Watanabe, Maria Angelica EharaResumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é a principal micose sistêmica prevalente na América Latina, causada pelos fungos termo-dimórficos Paracoccidioides brasiliensis e P lutzii Considerando que o habitat destes fungos na natureza permanece indefinido, animais silvestres podem ser úteis como indicadores da presença de Paracoccidioides sp no ambiente Outra doença endêmica no estado do Paraná é a leishmaniose tegumentar americana (LTA) A LTA é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania e os animais silvestres podem ser hospedeiros e reservatórios biológicos destes patógenos O objetivo deste estudo foi avaliar a infecção de mamíferos silvestres de pequeno porte por P brasiliensis e Leishmania sp em uma área endêmica para PCM e LTA Os mamíferos silvestres (n=38) foram capturados por meio de armadilhas, em uma Reserva Nacional do Patrimônio Natural (RPPN) no município de Mauá da Serra-PR e a infecção por P brasiliensis e Leishmania sp foi avaliada por meio de métodos sorológicos (ELISA e imunodifusão), reação em cadeia da polimerase (Nested-PCR), cultura e exame histopatológico Os animais utilizados para investigação da infecção por P brasiliensis e Leishmania sp foram: Akodon sp (n=12), Thaptomys nigrita (n=8), Euryoryzomys russatus (n=7), Oligorizomys nigripes (n=3), Monodelphis sp (n=3), Sooretamys angouya (n=2), Abrawayaomys angouya (n=1), Abrawayaomys ruschii (n=1) e Akodontinae sp (n=1) Além destes animais, um tatu atropelado Dasypus novemcinctus foi avaliado quanto à infecção por Leishmania sp A análise das amostras de soro por ELISA demonstrou uma positividade de 237% (n=9) para gp43 de P brasiliensis e 36,8% (n=14) para antígeno bruto de Leishmania sp Amostras de coração e fígado de um O nigripes apresentaram positividade para P brasiliensis na PCR e o animal também apresentou positividade para o fungo no ELISA O exame histopatológico, a imunodifusão e a cultura foram negativos P brasiliensis Amostras de tecidos de Dasypus novemcinctus (baço), Akodon sp (fígado) e de Thaptomys nigrita (baço) apresentaram positividade para Leishmania sp na PCR e estes mesmos animais também apresentaram positividade para Leishmania sp no teste de ELISA Estes dados sugerem que mamíferos silvestres de pequeno porte são reservatórios de P brasiliensis e Leishmania spItem Avaliação do frutoligossacarídeo inulina : toxicidade e efeitos na expressão gênica do fator de transcrição FOXP3 e TGFBGualtieri, Karina de Almeida; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Sforcin, José Maurício; Ariza, Carolina Batista; Oliveira, Gabriela Gonçalves de; Amarante, Marla Karine; Suzuki, Karen Brajão de Oliveira [Coorientadora]Resumo: A identificação de componentes da dieta, a compreensão de seus mecanismos de ação, bem como seu desenvolvimento e utilização na alimentação humana são alguns dos objetivos junto a ciência dos alimentos funcionais a-D-glucopiranosil-[a-D-fructofuranosil](n-1)-D-fructofuranoside, comumente conhecida como inulina, é um polissacarídeo de origem vegetal natural, com uma gama diversificada de aplicações alimentares e farmacêuticas Oligossacarídeos do tipo inulina são considerados como prebióticos, por suas propriedades não digeríveis dos hidratos de carbono, encontradas em muitos vegetais, frutos e cereais Embora a literatura indique que a inulina é um alimento funcional, eficaz e promissor, estudos ainda são necessários para elucidar o seu potencial na modulação da imunidade sistêmica e seu papel na prevenção de doenças crônicas Nos últimos anos tornou-se evidente que uma subpopulação de células T, denominadas células T reguladoras (Tregs), desempenham papel importante na manutenção da tolerância a auto-antígenos, sendo o fator de transcrição FOXP3 um marcador desse tipo celular e ainda podem ser induzidas por uma citocina denominada fator de transformação do crescimento-ß (TGF-ß) Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar se a inulina possui efeito tóxico in vivo, e também avaliar seu efeito sobre a expressão, in vitro, do TGFB e FOXP3 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) Os resultados mostraram que a inulina não induziu qualquer lesão hepática ou renal e alterações nos parâmetros séricos, exceto para o nível de ALT Não houve influência significativa da inulina junto às alterações histológicas, sugerindo outra causa para a alteração de ALT, concluindo assim, que frutanos do tipo inulina não têm efeito significativo sobre transaminases séricas, valores de MDA ou análises histopatológicas in vivo As análises in vitro mostraram que não houve diferença nos níveis de TGF-ß no sobrenadante de cultura de células, porém foi possível detectar, por PCR em tempo real, o aumento de expressão de FOXP3 e uma tendência ao aumento de TGFB nas células tratadas com inulina Embora a inulina represente uma potencial fonte como composto seletivo e de efeitos farmacológicos e imunologógicos, sua utilidade na terapêutica revela um aspecto da investigação científica e abre perspectivas para pesquisas futurasItem Avaliação in vitro da atividade antitumoral do ácido grandiflorênico e tioidantoínas sob as linhagens celulares MCF-7, HuH7.5 e A549Fagundes, Tatiane Renata; Pavanelli, Wander Rogério [Orientador]; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Seiva, Fábio Rodrigues Ferreira; Miranda-Sapla, Milena Menegazzo; Panis, Carolina [Coorientadora]Resumo: O câncer é a segunda principal causa de morte no mundo, e estima-se qye seja responsável por 9,6 milhões de mortes em 218 Dentre os fatores limitantes do tratamento dos tumores malignos com medicamentos é a resistência e a baixa eficácia das terapias disponíveis, além dos efeitos colaterais que se estendem também a todo tipo celular em divisão As tioidantoínas são compostos sintéticos que apresentam efeitos biológicos, tais como: antiparasitários, antivirais, antitumorais, antioxidantes, anti-inflamatória O ácido grandiflorênico é um diterpeno, extraído da parte aérea da planta Sphagneticola trilobata, e já descrito por suas ações anti-inflamatórias, antileishmanicida, antibacteriana e antitumoral Considerando novas abordagens para o tratamento do câncer, pesquisamos o efeito desses compostos nas linhagens celulares tumorais de mama (MCF-7), de pulmão (A549) e de fígado (HuH75), bem como os prováveis mecanismos de morte envolvidos As tioidantoínas foram testadas em diferentes concentrações (25, 5 e 1 µM), através de ensaios de citotoxicidade pelo MTT, vermelho neutro e azul de tripan, sob as celulas MCF-7 e hemácias ovinas A avaliação do volume celular e análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo, e análises de fluorescência para determinação do mecanismo de morte induzido pelas tioidantoínas Três experimentos independentes foram realizados, cada um em triplicata O tratamento com as tioidantoínas promoveu a morte das células tumorais de mama MCF-7, porém não causou hemólise em hemácias ovinas O efeito citotóxico resultou no aumento da produção de ROS, e parada do ciclo celular na fase G1/G, com redução do volume celular, perda de integridade de membrana, despolarização mitocondrial e aumento da fluorescência para anexina, indicando morte celular por apoptose, e aumento da formação de vacúolos autofágicos O GFA in vitro foi avaliado quanto à citotoxicidade através do teste de avaliação mitocondrial do MTT, vermelho neutro e azul de tripan, nas linhagens tumorais MCF-7 (câncer de mama), A549 (câncer de pulmão) e HuH75 (câncer de fígado) A avaliação do volume celular foi realizada por citometria de fluxo, e análises de fluorescência para determinação do mecanismo de morte, através da exposição de fosfatidilserina, integridade de membrana, e formação de vacúolos autofágicos Foi avaliada ainda a possível indução da formação de espécies reativas de oxigênio por fluorescência O tratamento com GFA inibiu significativamente a proliferação celular nas três linhagens estudadas, que foi acompanhada de diminuição do volume celular, principalmente na concentração de 4 nM A avaliação dos mecanismos de morte mostrou que os tratamentos aumentaram: a produção de ROS, a exposição de folfatidilserina, a despolarização de membrana mitocondrial, e formação de vacúolos autofágicos Observamos que os compostos estudados se mostraram citotóxicos para as linhagens tumorais, alcançando uma indução de apoptose e autofagia nessas células, em proporções maiores que nas células normais testadas, demonstrando que os dois compostos, devem ser melhores estudados como candidatos à terapia antineoplásicaItem Avaliação in vitro do efeito das isoflavonas genisteína e daidzeína no metabolismo de xenobióticos, ciclo celular e antimutagenicidade/mutagenicidadeLepri, Sandra Regina; Mantovani, Mário Sérgio [Orientador]; Salvadori, Daisy Maria Fávero; Vicentini, Verônica Elisa Pimenta; Mazzuco, Tânia Longo; Watanabe, Maria Angélica EharaResumo: Genisteína e daidzeína, as principais isoflavonas de soja, são moléculas de baixo peso molecular com amplo espectro de atividades biológicas Muitos estudos sugerem que estas isoflavonas tem ação protetora contra várias doenças crônicas incluindo câncer Estas moléculas podem exercer seus efeitos através de múltiplos mecanismos que entre outros destacam-se: atividade antioxidante, inibição de crescimento de células neoplásicas, regulação do ciclo celular e apoptose, modulação de enzimas do metabolismo de xenobióticos (fase I e II) e modulação de várias vias de sinalização celular No presente trabalho avaliamos os efeitos das isoflavonas genisteína e daidzeína sobre três linhagens de células tumorais: hepatoma de rato (HTC), hepatoma humano (HepG2) e carcinoma de cólon humano (HT29) Os parâmetros avaliados tiveram foco sobre atividade antiproliferativa (HTC, HepG2 e HT29), efeitos genotóxicos e antigenotóxicos (HTC), atividade sobre modulação de enzimas do metabolismo de xenobióticos (HTC, HepG2) e efeito sobre a via de sinalização celular Wnt/ß-catenina (HT29) Os principais resultados obtidos no presente trabalho foram: (i) Em HTC, o ensaio do micronúcleo mostrou que nenhuma das isoflavonas utilizadas teve efeito genotóxico Genisteína a 1 µM apresentou efeito antimutagênico quando associada aos agentes de danos ao DNA de ação direta (DXR) e indireta (2AA) Os níveis de GST mRNA não foram diferencialmente modulados por genisteína ou daidzeína (ii) Em HepG2, genisteína e daidzeína (1 a 1 µM) inibiram crescimento celular de forma dose e tempo dependente Resultados através de PCR em tempo real mostraram que a suplementação com 5 µM de genisteína causou uma redução na expressão de CYP1A1 enquanto a daidzeína promoveu aumento de expressão nas duas concentrações testadas (1 e 5 µM) Os níveis de GST mRNA não foram diferencialmente modulados por genisteína ou daidzeína (iii) Em HT29, genisteína inibiu proliferação celular em concentrações de 25 a 1 µM Daidzeína somente inibiu proliferação na concentração mais alta (1 µM) Genisteína (5 µM) reduziu significativamente a expressão do gene CTNNBIP1(ß-catenin) e não interferiu na expressão de APC (Adenomatous polyposis coli) ou BIRC5 (survivina) Daidzeina não interferiu na expressão dos genes CTNNBIP1(ß-catenin), APC (Adenomatous polyposis coli) ou BIRC5 (survivina) em nenhuma concentração testada Estes estudos indicam que especialmente a genisteína apresenta grande potencial a ser explorado para tratamento e prevenção de câncerItem Comparação do perfil de moléculas de adesão celular e do inibidor do ativador do plasminogênio 1 em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide : influência do tratamento medicamentoso e da síndrome metabólicaSantos, Lorena Flor da Rosa Franchi; Simão, Andréa Name Colado [Orientador]; Reiche, Edna Maria Vissoci; Oliveira, Sayonara Rangel de; Dichi, Isaías; Costa, Neide TomimuraResumo: INTRODUÇÃO Lúpus eritematoso sistêmico (LES) e artrite reumatoide (AR) são doenças autoimunes com característica inflamatória crônica e risco cardiovascular (CV) aumentado que apresentam alteração do perfil de moléculas de adesão celular (MACs) O aumento do risco CV também têm sido avaliado frente a influência de alterações nos níveis do inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1), o principal inibidor da fibrinólise OBJETIVOS Os principais objetivos dessa tese foram: 1) revisar a influência dos principais medicamentos utilizados no tratamento do LES e da AR nos níveis plasmáticos das MACs; 2) comparar o perfil de MACs e PAI-1 no LES e na AR e examinar o impacto da síndrome metabólica (SM) nestas moléculas SUJEITOS E MÉTODOS Esta tese apresenta dois artigos científicos; o primeiro é um artigo de revisão que inclui o objetivo 1 e o segundo, um artigo original, que inclui o objetivo 2 Artigo 1: Foi realizada pesquisa bibliográfica nas bases de dados eletrônicas PUBMED, Lilacs, Biblioteca Eletrônica Científica Online (SCIELO) e Science Direct A pesquisa incluiu estudos em humanos, in vivo ou in vitro, com delineamento experimental ou observacional, e sem limite de data de publicação ou número de sujeitos Foram excluídos estudos em modelos animais ou com tratamentos não padronizados A lista de referências dos artigos selecionados também foi revisada Artigo 2: Foram selecionados 14 pacientes com LES e 124 pacientes com AR recrutados pelo ambulatório de Reumatologia do Hospital Universitário de Londrina, de ambos os sexos, com idade entre 18 e 69 anos Foram determinados os níveis plasmáticos por imunofluorimetria utilizando a plataforma Luminex® das seguintes MACs: molécula de adesão celular endotelial plaquetária 1 (PECAM-1), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), E-selectina, P-selectina e do PAI-1 A SM foi diagnosticada de acordo com os critérios propostos pelo Painel de tratamento de adultos III (ATP III) RESULTADOS Artigo 1: Foram incluídos 21 estudos, três no LES e 18 na AR, relatados em monoterapia ou terapia combinada Os medicamentos mais avaliados nos artigos analisados foram ciclofosfamida (CY, n=2) e pulso de metilprednisolona (pMP, n=2) no LES; metotrexato (MTX, n=9) e infliximabe (IFX, n=4) na AR Além disso, as MACs mais utilizadas para avaliar a resposta ao tratamento foram VCAM-1 (n=2) no LES e ICAM-1 (n=12), VCAM-1 (n=12) e E-selectina (n=14) na AR Pacientes com LES ou AR submetidos ao tratamento usualmente demonstraram diminuição significativa nos níveis de MACs Artigo 2: O diagnóstico (LES versus AR) apresentou alta associação com MACs e PAI-1, explicando 53,9% de sua variação, com efeito particularmente forte em PECAM-1 (45,7%) e VCAM-1 (38,3%) Todas as 5 MACs e PAI-1 foram significativamente maiores no LES do que na AR após o ajuste para possíveis efeitos da idade, SM e circunferência abdominal A presença de SM pode interferir em 8,2% da variação dos níveis plasmáticos das 6 moléculas, e os níveis de VCAM-1, E-selectina e PAI-1 foram significativamente maiores nos indivíduos com SM Os resultados da análise de regressão logística mostraram que níveis aumentados de PECAM-1, VCAM-1 e P-selectina foram melhores preditores de LES (x2 = 143,99, df = 3, p <,1, Nagelkerke = ,7) com 87,1% de todos os casos corretamente classificados com sensibilidade de 87,8%, especificidade de 86,5% e a área sob a curva de operação do receptor (AUC ROC) de ,956 (± ,2) Nossas análises de machine learning (incluindo SIMCA) provaram que ambos os grupos são qualitativamente diferentes com relação aos valores de MACs e PAI-1 e que, de fato, todos os valores das 6 moléculas avaliadas contribuem para a discriminação entre ambos os grupos Os resultados de redes neurais confirmaram que PECAM-1 e VCAM-1 foram as MACs mais significativas que diferenciaram o LES da AR e puderam predizer o LES com sensibilidade de 96,8%, especificidade de 85,4% e AUC ROC de ,956 Nós também verificamos que as MACs (ICAM-1, VCAM-1, E- e P-selectina) e PAI-1 foram associadas aos componentes da SM, tais como pressão arterial e parâmetros metabólicos CONCLUSÕES Artigo 1: O principal resultado na presente revisão foi que os pacientes com LES ou AR, principalmente com doença ativa submetidos a tratamento específico, demonstraram diminuição significativa nos níveis de MACs ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina foram as moléculas frequentemente determinadas para avaliação da resposta ao tratamento Desta forma, as MACs podem refletir a atividade da doença e a resposta ao tratamento em pacientes com LES e AR Artigo 2: No artigo original, nossos dados demonstraram perfil diferencial de MACs e PAI-1 no LES e AR, e PECAM-1 e VCAM-1 podem ser usados para discriminar pacientes com LES de AR como um critério de validação externo Além disso, a SM foi mais frequente em pacientes com LES, mas poderia influenciar os níveis plasmáticos de MACs e PAI-1 em ambas as doenças, e deve ser avaliada concomitantemente com eles Os componentes da SM foram associados à MACs e PAI-1 e poderiam explicar o risco CV diferencial no LES e na ARItem Controle da artrite séptica pelo tratamento com um doador de nitroxil, o Sal de Angeli : avaliação do efeito e mecanismo de ação na redução da dor, inflamação e infecçãoFerrari, Larissa Staurengo; Verri Junior, Waldiceu Aparecido [Orientador]; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Pelayo, Jacinta Sanchez; Costa, Idessania Nazareth da; Pavanelli, Wander RogérioResumo: É cada vez mais evidente a necessidade da busca de novas terapias para o paciente com artrite séptica devido ao sofrimento prolongado, dor, destruição articular e perda de função Neste trabalho estamos propondo a avaliação de uma nova terapia, o tratamento com o sal de Angeli (SA, Na2N2O3), uma droga doadora da forma reduzida do óxido nítrico (NOy), o nitroxil (HNO/NO-) Estudos recentes que recriam condições biológicas demonstram que o HNO é uma molécula endógena em nosso organismo por atuar como fator relaxante derivado do endotélio assim como o NOy e, ainda, diferentemente do NOy atua como papel como fator hiperpolarizante derivado do endotélio Assim, as atividades endógenas do HNO e NOy são iguais em alguns pontos e diferentes em outros, demonstrando que são moléculas dimstintas e com efeitos independentes Quanto ao NOy em geral, existem evidências do seu efeito microbicida, importante para a eliminação bacteriana, para redução do influxo de leucócitos para o foco inflamatório e para analgesia O HNO tem a capacidade de apresentar os efeitos do NOy, como a analgesia Nesse sentido, avaliamos primeiramente o efeito analgésico do doador SA, em modelos de dor manifesta [pfenil-bezoquinona (PBQ); ácido acético e formalina] para melhor compreensão dos mecanismos analgésicos do HNO, nos quais a multiplicação bacteriana não é um fator interferente Os modelos de dor manifesta são caraterizados por um imediato comportamento, podendo ser contorções abdominais (PBQ e ácido acético) ou lambida/sacudidas (formalina) do membro estimulado, e são avaliados por 2-3 min Tais comportamentos dolorosos foram reduzidos de maneira dose-dependente pelo tratamento subcutâneo com o SA, sendo o efeito máximo observado com 3 mg/kg O efeito inibitório do SA foi prevenido pelo pré-tratamento com ODQ, KT5823 e glibenclamida que são inibidores farmacológicos da via cGMP/PKG/canais de K+ATP-sensíveis Além disso, o pré-tratamento com L-cisteina (“sequestrador” de HNO), confirmou que o efeito analgésico do SA depende do HNO Em seguida, a partir da dose analgésica efetiva de SA de 3 mg/kg, verificamos o efeito dessa molécula no modelo crônico de artrite séptica induzida por S aureus O tratamento diário com SA inibiu significativamente a dor e as respostas inflamatórias (edema, recrutamento leucocitário, produção de citocinas, ativação de NF-?B e estresse oxidativo) resultando na prevenção da severidade da doença avaliados por parâmetros clínicos, conteúdo de proteoglicanos e osteoclastogênese As características observadas parecem ser dependentes do efeito microbicida do HNO que diretamente inibiu o crescimento de S aureus e o número de UFC na articulação Como consequência desse efeito, o tratamento com SA também inibiu uma resposta inflamatória sistêmica em resposta à infecção (contagem de leucócitos no pulmão e concentração sérica de citocinas pró-inflamatórias) Assim, os resultados obtidos sugerem o potencial terapêutico do SA ou doadores de HNO na artrite séptica, e sustenta que o SA apresenta efeitos analgésicos intrínsecos independentemente da inibição da infecção