01 - Doutorado - Patologia Experimental

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Associação entre as variantes genéticas rs2241043, rs2241049 e rs6518661 do IL17RA e a suscetibilidade e gravidade da psoríase
(2023-07-18) Alcantara, Camila Cataldi de; Simão, Andréa Name Colado; Oliveira, Karen Brajão de; Amarante, Marla Karine; Bello, Valéria Aparecida; Luz, Tamires Flauzino; Almeida, Elaine Regina Delicato de; Oliveira, Sayonara Rangel
INTRODUÇÃO: A psoríase (PsO) é uma doença inflamatória crônica, mediada pelo sistema imunológico e de etiologia desconhecida. A resposta inflamatória normalmente tem início com um fator nocivo aos queratinócitos, estimulando a produção e secreção de citocinas. A indução da diferenciação das células T auxiliadoras dá início à uma produção de citocinas capazes de ativar e recrutar células do sistema imunológico para o local da lesão. Nesse microambiente, a Interleucina (IL) 17 exerce um papel primordial para a fisiopatologia da doença. O caráter multifatorial da PsO e a importância da IL-17 para a sua fisiopatologia evidenciam a necessidade de investigar como o fator genético pode influenciar na suscetibilidade à PsO e na resposta de pacientes aos novos tratamentos desenvolvidos contra essas moléculas. OBJETIVO: Revisar a literatura e avaliar a associação entre as variantes genéticas rs2241043, rs2241049 e rs6518661 do gene IL17RA e a suscetibilidade e gravidade da PsO. SUJEITOS E MÉTODOS: Este é um estudo caso-controle que incluiu 308 participantes de ambos os sexos, com idade entre 18 e 70 anos, sendo 154 pacientes com diagnósticos de PsO e 154 indivíduos saudáveis. O diagnóstico de PsO foi feito por um dermatologista e o Índice de Gravidade e Extensão das Lesões Psoriáticas (PASI) foi usado para determinar a gravidade da doença. Os dados clínicos, epidemiológicos e antropométricos foram obtidos durante consulta clínica através do preenchimento de uma ficha de avaliação previamente estabelecida. As variantes genéticas do gene IL17RA foram genotipadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando sondas TaqMan®. Três variantes genéticas localizados na região intrônica do IL17RA foram genotipados: T>C rs2241043, A>G rs2241049 e G>A rs6518661. RESULTADOS: Os pacientes com PsO eram mais velhos (p<0,001), tinham maior Índice de Massa Corporal (IMC) (p<0,001) e maiores níveis séricos de Proteína C Reativa (p<0,001) e Ferritina (p=0,002) quando comparados aos controles. A presença do alelo G em homozigose par o rs2241049 A>G demonstrou estar associado à proteção contra a PsO nos modelos dominante (OR=0,37, 95% IC 0,18-0,76, p=0,017) e recessivo (OR=0,39, 95% IC 0,20-0,76, p=0,005). A frequência do alelo A foi maior no grupo com PsO e o alelo C, no grupo controle (OR=0,799, 95% IC 0,67-0,95, p=0,0151). O genótipo CC do rs2241043 T>C demonstrou ser um fator de proteção contra o desenvolvimento de PsO grave (OR=0,30, 95% IC 0,10-0,093, p=0,020). Esta associação se manteve independentemente de idade, sexo, etnia e IMC (OR=0,303, 95% IC 0,095-0,965, p=0,043). A presença do alelo A em homozigose para o rs6518661 G>A demonstrou estar associado à proteção contra o desenvolvimento de PsO grave (OR=0,22, 95% IC 0,05-0,99, p=0,020). CONCLUSÃO: Este estudo demonstrou que o genótipo GG do IL17RA A>G rs2241049 é um fator protetor contra o desenvolvimento de PsO. Além disso, o alelo C em homozigose da variante IL17RA T>C rs2241043 e o genótipo AA do IL17RA G>A rs6518661 foram associados à proteção contra o desenvolvimento de PsO grave. Mais estudos são necessários para elucidar quais mecanismos genéticos e epigenéticos podem estar envolvidos nas associações, uma vez que esses genes estão localizados em regiões intrônicas.
Effects of standard of care drugs and resolvin D2 on cellular senescence in pulmonary fibrosis
(2022-05-10) Garcia, Stephanie Badaró; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Guarnier, Flávia Alessandra; Deminice, Rafael; Zuttion, Marília Sanches Santos Rizzo; Raposo, Larissa Staurengo Ferrari; Hogaboam, Cory M
Cellular senescence is pivotal in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) progression. Still, it is yet unknown the effects of standard-of-care (SOC) drugs nintedanib and pirfenidone on senescence lung fibroblasts. In addition, specialized pro-resolving lipid mediators have been shown to be effective at improving infection clearance and hold strong therapeutic potential in the management of COVID-19. However, its mechanisms of action on proliferative and senescent fibroblasts were not yet explored. In this study, we elucidated the effects of SOC drugs on senescent normal and IPF lung fibroblasts in vitro and the effects of Resolvin D2 on proliferative and senescent lung fibroblasts from normal and IPF patients. Colorimetric/fluorimetric assays, qRT-PCR, and western blotting were used to evaluate the effect of SOC drugs on senescent normal and IPF lung fibroblasts. SOC drugs did not induce apoptosis without death ligands in normal or IPF senescent cells. SOC drugs increased caspase-3 activity in the presence of FasL in normal but not in IPF senescent fibroblasts. Conversely, nintedanib enhanced Bcl-2 expression in senescent IPF lung fibroblasts. Moreover, in senescent IPF cells, pirfenidone alone induced MLKL phosphorylation, provoking necroptosis. In addition, fragmented gasdermin D, indicating pyroptosis, was not detected under any condition. In addition, SOC drugs increased transcript levels of fibrotic and senescence markers in senescent IPF fibroblasts, whereas D+Q inhibited all these markers. Finally, D+Q enhanced GDF15 transcript and protein levels in both normal and IPF senescent fibroblasts. Conversely, RvD2 drugs significantly decrease transcript levels of BIRC5, CCR10, COL1A1, COL3A1, FN1, GDF15, and WNT16 in senescent IPF fibroblasts. However, further studies are necessary to elucidate the therapeutic implications of RvD2 in IPF fully.
Mecanismos centrais envolvidos na hiperalgesia induzida pelos vírus Dengue e Chikungunya e proteína E2 do vírus Chikungunya em camundongos
(2019-07-31) Vendrameto, Carina Zerbetto Segato; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Guidoni, Ana Carolina Rossananeis; Borghi, Sérgio Marques; Dionísio, Andressa de Freitas Mendes; Kwasniewski, Fábio Henrique
As arboviroses Dengue e Febre Chikungunya são duas das viroses mais comuns afetando centenas de países por todo o mundo, seguindo a área endêmica de seus vetores, os mosquitos do gênero Aedes. Como não existem medicamentos específicos para ambas as viroses, novas estratégias terapêuticas são necessárias para tratar os principais sintomas como a dor por exemplo. Neste trabalho nós investigamos os mecanismos pelos quais estes vírus induzem dor e buscamos possíveis alvos terapêuticos para este sintoma. O vírus Chikungunya é conhecido por causar uma incapacitante dor articular que pode perdurar durante anos, mesmo após a eliminação completa do vírus, e nós investigamos se a proteína E2 do envelope viral pode estar envolvida nesse processo de indução da dor. Nossos resultados mostraram que o vírus inativado e a proteína E2 recobinante induzem hiperalgesia mecânica e térmica em camundongos, e o tratamento com anticorpos monoclonais anti-rE2 reduziu de forma efetiva a dor induzida pelos estímulos. Também observamos que na ausência ou bloqueio dos canais TRPV1 ocorre redução da hiperalgesia induzida pelo vírus inativado e pela proteína. Por último, encontramos que os neurônios dos gânglios da raiz dorsal apresentaram maior influxo de cálcio em nível basal após a estimulação com o vírus inativado e com a proteína recombinante, indicando ativação neuronal direta através destes estímulos. Pacientes infectados com dengue também apresentam a dor como um dos principais sintomas, então nós investigamos a participação de citocinas e das células da glia na indução da hiperalgesia após a infecção. Nossos dados mostraram que a infecção sistêmica com o vírus dengue induziu hiperalgesia mecânica, aumento na produção das citocinas TNF-a, IL-1ß e IL-10 e ativação de astrócitos e micróglias (aumento na expressão de mRNA para GFAP e Iba-1). O tratamento com moduladores destas citocinas e das células da glia confirmou de maneira efetiva a importância destas células e moléculas na hiperalgesia induzida pelo vírus Dengue em camundongos, demonstrando um grande potencial terapêutico que merece investigação futura.
Alterações morfológicas e fisiológicas no cólon de camundongos com retocolite ulcerativa aguda e crônica induzida por dextran sulfato de sódio
(2021-02-25) Watanabe, Paulo da Silva; Araújo, Eduardo José de Almeida; Fernandes, Glaura Scantamburlo A.; Melo, Gessilda de Alcantara Nogueira de; Sant Ana, Debora de Mello Gonçales; Santos, Armenio Aguiar dos
A doença inflamatória intestinal é uma inflamação recorrente que afeta o trato gastrointestinal, causando alterações na motilidade colônica. A evolução dessas alterações não é completamente compreendida e possivelmente está relacionada a sintomas que aparecem em diferentes graus da inflamação intestinal. Os estudos realizados em modelos animais para avaliar motilidade colônica usualmente utilizam apenas uma porção do cólon, e logo, os resultados geralmente não refletem as alterações que ocorrem em todo o órgão. Mais estudos são necessários para avaliar o desenvolvimento da colite, investigando as alterações causadas no epitélio intestinal e na parede do cólon, no modelo agudo e crônico da doença e investigar se essas alterações morfológicas interferem na motilidade de diferentes porções do cólon. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações estruturais e de motilidade do cólon durante o desenvolvimento da retocolite ulcerativa (RCU) aguda e crônica induzida por DSS em camundongos C57Bl/6. Os animais foram distribuídos em 5 grupos, sendo um grupo controle e os demais grupos expostos ao DSS 3% por 2, 5, 7 dias (RCU aguda) ou 2 semanas (RCU crônica). Durante a indução da RCU, os animais foram monitorados diariamente para obter o índice de atividade da doença (IAD). Após eutanásia, os cólons foram removidos e processados para análises histológicas e para as técnicas de imunofluorecência para avaliação de células tuft e neurônios mioentéricos. A motilidade do cólon foi determinada usando um aparelho de manometria convencional de perfusão multilúmen. De acordo com o IAD, o modelo foi eficaz em induzir a RCU tanto de forma aguda como crônica. Houve um aumento na espessura das camadas mucosa, submucosa, dos estratos da camada muscular, na parede total e redução no número de células tuft. Além disso, observou-se depleção de células caliciformes e um aumento na densidade de fibras de colágeno, bem como aumento numérico de neurônios colinérgicos no plexo mioentérico dos animais com RCU crônica. Tanto a população total como as subpopulações avaliadas de neurônios mioentéricos estavam atrofiadas nos grupos com RCU. A exposição progressiva ao DSS foi acompanhada de acúmulo de ajustes no padrão de motilidade colônica. O avanço da RCU provocou, dentre outros aspectos característicos de dismotilidade, redução no número de contrações, no número de complexos motores de migração colônica e no tempo total de trânsito gastrointestinal. De uma forma geral, a inflamação progressiva fez com que as contrações se tornaram mais vigorosas nas extremidades e mais longas na região medial do cólon. Concluímos que durante o progresso da RCU induzida por DSS ocorrem alterações estruturais no cólon, incluindo aumento no número de neurônios mioentéricos colinérgicos, seguidas de variações no padrão de motilidade de diferentes regiões do cólon que, em conjunto, caracterizam dismotilidade colônica
Níveis séricos de homocisteína e sua relação com o estresse oxidativo em pacientes com acidente vascular encefálico
(2019-08-07) Cossentini, Luana Aparecida; Simão, Andréa Name Colado; Bregano, José Wander; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Mari, Naiara Lourenço; Costa, Neide Tomimura; Dichi, Isaías
O acidente vascular encefálico (AVE) é uma das principais causas de 8 morbimortalidade em muitos paísese devido à suas sequelas apresenta 9 importantes implicações socioeconômicas. O AVE possui duas formas 10 principais de apresentação: o AVE isquêmico, o mais frequente, e o AVE 11 hemorrágico, o mais grave. No momento desses eventos o suprimento de 12 oxigênio e nutrientes diminui ou cessa por completo, causando danos ao tecido 13 cerebral caracterizado por morte celular rápida na microrregião. A reperfusão, 14 onde ocorre a retomada do fluxo sanguíneo, pode sobrecarregar a respiração 15 mitocondrial, levando a um pico na produção de espécies reativas de oxigênio 16 (ERO) pelas mitocôndrias causando cada vez mais danos. Estudo prévio com 17 pacientes com AVE isquêmico verificou a existência de valores de 18 homocisteína plasmáticos mais altos do que o relatado no grupo controle, o 19 que sugere a associação entre níveis de homocisteína plasmáticos e a 20 ocorrência de AVE. A homocisteína é um produto intermediário na biossíntese 21 normal dos aminoácidos metionina e cisteína. Está bem estabelecido que a 22 homocisteína plasmática elevada seja um fator de risco vascular. Objetivo: 23 Verificar os níveis de homocisteína sérica e do estresse oxidativo em pacientes 24 acometidos com AVE, atendidos no Hospital Universitário de Londrina – PR e 25 desenvolver uma revisão bibliográfica a cerca do assunto. Materiais e 26 Métodos: 170 pacientes com AVE e 220 controles saudáveis da mesma área 27 geográfica foram recrutados no Hospital Universitário de Londrina da 28 Universidade Estadual de Londrina. Inicialmente, foram comparados os níveis 29 de homocisteína dos pacientes com AVE e dos controles. A seguir, os 30 pacientes com AVE foram divididos em dois grupos de 85 pacientes 31 semhiperhomocisteínemia (<13,59µmol/L) e com (= 13,59µmol/L) 32 hiperhomocisteínemia. Os dados demográficos e os biomarcadores 33 inflamatórios foram analisados nos dois gruposdepacientes com AVE sem e 34 com hiperhomocisteínemia. Os pacientes foram classificados segundo a escala 1 de Rankin, q a qual determina o estado físico do paciente. Para a revisão foram 2 selecionados artigos de 1996 a 2019, disponíveis na base de dados Pubmed e 3 LILACS, optou-se pela busca por termos livres, sem o uso de vocabulário 4 controlado (descritores). Resultados: Os pacientes com AVE apresentaram 5 altos níveis de homocisteinemia quando comparados com o grupo controle 6 (p<0,001) ajustado para as variáveis sexo, etnia e idade. Em análise posterior, 7 quando os grupos foram divididos de acordo com os níveis de homocisteína, 8 houve diferenças significativas em relação ao sexo (p <0,001), escala 9 modificada de Rankin no início do estudo (p<0,034) e glicose (p <0,020). Em 10 análise dos marcadores de estresse oxidativo verificou-se tendência à 11 diminuição nos níveis de NOx (p <0,071) eum significativo aumento no TRAP 12 (p <0,003) no grupo de pacientes com hiperhomocisteinemia. Após a 13 realização das análises de regressão logística binomial verificou-se que glicose 14 (0,017) e TRAP (p <0,019) foram independentemente associados à hiper-15 homocisteinemia em pacientes com AVE. Conclusão: Pacientes com AVE 16 apresentam altas taxas de homocisteína sérica. TRAP e 17 glicemiaestãoassociados à hiper-homocisteinemia. Com o artigo de revisão 18 concluímos que existe uma grande quantidade de referências sobre o estudo 19 do AVE, entretanto são escassos quando o assunto é a relação entre AVE, 20 estresse oxidativo e homocisteína, tornando de grande importância a pesquisa 21 e publicações que ampliem essa discussão.
Efeito do diabetes e exposição hiperglicêmica na susceptibilidade à leishmaniose experimental
(2022-03-04) Silva, Taylon Felipe; Conchon-Costa, Ivete; Kwasniewski, Fábio Henrique; Tomiotto-Pellissier, Fernanda; Bordignon, Juliano; Miranda-Sapla, Milena Menegazzo
A leishmaniose é um grupo de doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania e sua imunopatogênese resulta de fatores do hospedeiro e do parasita que desencadeiam uma resposta imune desequilibrada durante a infecção. O diabetes é uma doença crônica resultante da disfunção da produção de insulina pelo organismo ou da capacidade de utilizá-la adequadamente, levando à hiperglicemia, cujo descontrole crônico causa diversas lesões nos tecidos e prejudica o sistema imunológico. Assim, devido ao delicado equilíbrio imunológico necessário no combate e resistência à infecção por Leishmania e a desregulação crônica da resposta inflamatória observada no diabetes, o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de PBMC de pacientes diabéticos, de celulas de linhagem THP-1 exposta a um ambiente hiperglicêmico e camundongos C57BL/6 diabéticos contra a infecção por Leishmania amazonensis e como essas condições alteram a resposta imune frente ao parasito. Para isso, foi coletado sangue periférico de 25 pacientes diabéticos e 25 controles saudáveis para extração de PBMC e posterior infecção experimental com Leishmania amazonensis por 2 ou 24 h, após isso foi analisada a capacidade leishmanicida e a resposta imune dessas células. Também realizamos um modelo de estímulo hiperglicêmico in vitro com células THP-1 e as infectamos com a mesma espécie de parasito por diversos tempos. Além disso, induzimos diabetes experimental com streptozotocina (STZ) em camundongos C57BL/6 e avaliamos a infecção cutânea no coxim plantar por 5 semanas. Observamos que o diabetes e a hiperglicemia prejudicam a capacidade leishmanicida de PBMC e macrófagos derivados de células THP-1, principalmente por manter o efeito antioxidante do NRF2 e aumentar a atividade das enzimas sequestradoras de radicais livres SOD e catalase, respectivamente, além de reverter o perfil de resistencia que camundongos C57BL/6 apresentam frente a infecção por L. amazonensis, induzindo lesões mais exacerbadas em comparação a animais não diabéticos. Além disso, o estímulo hiperglicêmico favoreceu o aumento de marcadores relacionados ao fenótipo de macrófagos M2 de maneira mediada pelo parasito. No mesmo sentido, a indução de diabetes experimental em camundongos C57BL/6 resultou em falha na produção de oxido nitrico (NO) frente a infecção, além de gerar uma respota semelhante a Th2/Th2 nestes animais, em comparação com animais controle que geraram uma respota semelhantente o perfil Th1. Ainda observamos que macrófagos de animais diabéticos falharam em processar e apresentar antígenos de Leishmania durante a infecção, sendo incapazes de ativar e induzir a proliferação de linfócitos antígeno-específicos. Juntos, esses dados demonstram que o diabetes e a hiperglicemia podem prejudicar a resposta imune celular, principalmente dos macrófagos, contra a infecção por parasitas do gênero Leishmania.
Avaliação transgeracional do efeito da exposição materna a mistura de ftalatos sobre parâmetros testiculares e epididimários de ratos machos pré-púberes e adultos.
(2022-10-20) Umbelino, Ana Paula Franco Punhagui; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Brajão, Karen; Guerra, Marina Trevisan; Perobelli, Juliana Elaine; Borges, Fernando Henrique; Scarano, Wellerson Rodrigo
Ftalatos são compostos químicos derivados do ácido ftálico em que são utilizados amplamente na indústria para garantir a flexibilidade do plástico, como em utensílios domésticos, cosméticos e brinquedos. Devido ao aumento na utilização de produtos compostos por ftalatos pelo ser humano diversos estudos têm sido realizados para avaliar os efeitos imediatos, tardios e transgeracionais dos ftalatos em animais pré- púberes e adultos, principalmente os efeitos sobre funções reprodutivas. Isto posto, o objetivo do presente estudo é verificar se a mistura de ftalatos é capaz de alterar o desenvolvimento testicular e epididimário de ratos machos em idade neonatal e adulta em duas gerações. Para isso, a mistura contém dietil-ftalato, di-(2-etilhexil)-ftalato, dibutil-ftalato, di-isononil-ftalato, di-isobutil-ftalato, e benzil-butil-ftalato. As fêmeas grávidas da linhagem Sprangue-Dawley foram divididas em 4 grupos e doseadas oralmente diariamente de DG10 a DPN21 com óleo de milho (Control:C) ou a mistura de ftalato em três doses (20µg/kg/d:T1; 200µg/kg/d:T2; 200mg/kg/d:T3). Após o período de tratamento, os machos da geração F1 foram submetidos à eutanásia em dois períodos, com DPN22 e DPN120. Os machos F1 com DPN90 foram acasalados com fêmeas não expostas para obtenção da geração F2, em que os machos com DPN22 foram submetidos à eutanásia. Foram coletados ducto deferente, epidídimo, próstata e testículo para dados de peso. Os testículos e epidídimos foram coletados para análise histológica e gênica. A análise histopatológica dos órgãos manteve semelhante entre os grupos, bem como a morfometria testicular de ratos F1 DPN120. No testículo podemos observar aumento de espermatozoides com anormalidade de cabeça na menor dose e alterações nos estágios da dinâmica espermatogênica em todas as doses de ftalato. A contagem de células de Sertoli não teve alteração significativa nos animais F1 DPN22, reduziu nas menores doses nos animais F1 DPN120 e manteve essa redução nas maiores doses nos animais F2 DPN22. A contagem de células de Leydig aumentou nas maiores doses nos animais F1 DPN22, diminuiu nos animais F1 DPN120 e não teve alteração nos animais F2 DPN22. O diâmetro dos túbulos seminíferos aumentou nos animais de DPN22 em todas as doses de ftalato. O padrão de expressão gênica de GPR30, HSD3B1, CYP19A1, BCL2 e PUMA ficaram praticamente inalterados nos animais F1 DPN22, reduziu nos animais F1 DPN120 e reduziu mais ainda nos animais F2 DPN22. No epidídimo podemos observar remodelamento tecidual na esterologia epididimária, e alteração na expressão gênica de GPR30, GPX3, GSR, IL10 e TNFa. Com isso podemos concluir que a mistura de ftalatos é capaz de causar danos significativos em tecido testicular e epididimário em efeito imediato, tardio e transgeracional.
Avaliação do potencial analgésico e antinflamatório das maresinas em modelos experimentais de atrite [i.e. artrite] e colite ulcerativa.
(2022-10-25) Franciosi, Anelise; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Kwasniewski, Fábio Henrique; Borghi, Sérgio; Rossaneis, Ana Carolina; Campos, Cássia Calixto de
A dor é uma experiência sensorial e emocional desagradável, produto do processo inflamatório que pode acometer indivíduos em diversas situações, sendo na maioria delas um agente incapacitante. O processo inflamatório e dor foram avaliados através dos modelos experimentais de artrite induzida por dióxido de titânio (TiO2) e modelo de colite ulcerativa (CU) induzida por ácido acético. Para investigar o objetivo de avaliação do potencial analgésico e anti-inflamatório, foram utilizados mediadores lipídicos pró resolução, as maresinas 1 (MaR1) e 2 (MaR2), como abordagem terapêutica. A artrite foi induzida em camundongos com Titânio (TiO2) intra-articular (i.a) (3mg/articulação). Após 24 horas, os animais foram tratados com MaR1 (1, 3 e 10ng – intraperitoneal i.p), e os tratamentos seguiram até o 30º dia pós indução. Ao longo dos 30 dias, a dose-resposta da droga foi avaliada pela realização de testes comportamentais (hiperalgesia mecânica e térmica, avaliação de incapacitação estática). Foi escolhida a dose de 10ng para o tratamento devido sua eficácia pelo período de 72 horas. A avaliação da ativação de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) por imageamento de cálcio foi realizado no segundo dia (48 hr) pós indução. Outros parâmetros inflamatórios foram avaliados como o edema, o recrutamento de leucócitos no lavado articular foram avaliados durante os 30 dias, e após a eutanásia respectivamente. Parâmetros histológicos como o recrutamento celular, hiperplasia sinovial, neovascularização e degradação da cartilagem, demonstraram a capacidade anti-inflamatória da MaR1. A MaR1 mostrou-se uma excelente abordagem terapêutica, já que não confere toxicidade gástrica, hepática ou renal, atuando ainda na modulação de hiperalgesia e inflamação. A CU foi desencadeada em camundongos com ácido acético (AAC) intraperitoneal (i.p) (na concentração de 6%). Os camundongos foram tratados com MaR2 (300pg e 3ng/animal) antes e após a indução da inflamação com ácido acético via intraretal. Para observar o potencial analgésico e anti-inflamatório por meio da droga-resposta, foram avaliados a hiperalgesia mecânica visceral, e atividade da mieloperoxidase (MPO). Devido a sua eficácia, escolheu-se a dose de 3 ng, e assim o efeito anti-inflamatório foi avaliado por parâmetros histológicos como a destruição das células caliciformes, a atrofia das criptas, distanciamento das camadas musculares e mucosa, o recrutamento de leucócitos e mastócitos. Foi avaliada população de macrófagos no tecido colônico por meio de imunomarcação de F4/80 para macrófagos, e iNOS para células produtoras de óxido nítrico sintase induzível (iNOS). A MaR2 age como analgésica reduzindo a hiperalgesia mecânica visceral, e anti-inflamatória diminuindo o recrutamento celular e os demais parâmetros histológicos, bem como a quantidade de macrófagos positivos para iNOS no tecido colônico. Conclui-se que as Maresinas são potencias alternativas terapêuticas, tanto na inflamação aguda causada pela colite induzida por ácido acético, quanto na inflamação crônica, produto da artrite induzida pelo TiO2.
Efeito protetor da maresina 2 (MaR2) e da resolvina D5 (RvD5) em modelo de endotoxemia induzido pelo lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos.
(2022-05-25) Cardoso, Renato Daniel Ramalho; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Pinge Filho, Phileno; Ferrari, Larissa Staurengo
Os mediadores lipídicos pró-resolução (SPMs) têm a capacidade de regular e reduzir a resposta inflamatória através de diferentes vias, modulando a produção de citocinas pró-inflamatórias, inibindo o recrutamento de células inflamatórias e diminuindo a lesão mediada por espécies reativas de oxigênio (EROs). Portanto, considerando o potencial protetor, anti-inflamatório e antioxidante desses mediadores lipídicos, e que a endotoxemia via LPS pode induzir lesões inflamatórias e oxidantes, entende-se que esses mediadores possuem potencial para serem utilizados terapeuticamente em casos de endotoxemia. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o efeito terapêutico dos mediadores lipídicos pró-resolução Maresina 2 (MaR2) e Resolvina D5 (RvD5) em um modelo de endotoxemia induzida por LPS. Os animais foram tratados com MaR2 (1ng ou 10 ng/animal) ou RvD5 (0,1ng, 1ng ou 10 ng/animal) 60 minutos antes de receber LPS (10mg/kg) por via intravenosa. O sangue foi coletado por punção cardíaca 6 horas após o tratamento e os níveis séricos da ureia, creatinina, ALT e AST foram quantificados. A atividade da MPO e da NAG foram observadas no fígado, pulmões e rins, bem como os níveis de citocinas pró-inflamatórias. Os testes de FRAP, ABTS, GSH, TBARS e NBT foram realizados nos mesmos órgãos para avaliar a capacidade antioxidante total dessas amostras e para observar a atividade e lesão oxidativa. Além disso, fígado, pulmões e rins foram avaliados histologicamente e o resultado foi quantificado por meio de um escore histopatológico. Demonstramos que a MaR2 diminuiu os níveis séricos de ureia e creatinina, atuando de forma protetora, principalmente nos rins, moderando a atividade inflamatória, aumentando a capacidade antioxidante total dessas amostras, diminuindo os níveis de peroxidação lipídica e evitando alterações histológicas severas. Portanto, a MaR2 demonstrou um papel protetor nos rins, reduzindo a inflamação e o estresse oxidativo. Em paralelo, a RvD5 exerceu atividade protetora renal, pulmonar e hepática com melhora dos parâmetros histológicos, diminuição dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, redução da peroxidação lipídica e dos da produção do ânion superóxido. Além disso, a RvD5 também reduziu a atividade de NAG e MPO, restaurou os níveis de antioxidantes totais, assim como os níveis de GSH. Portanto, nossos dados sugerem que MaR2 e RvD5 seriam uma possibilidade terapêutica para endotoxemia/choque endotoxêmico.
A exposição ao cyantraniliprole prejudica parâmetros reprodutivos masculinos na idade juvenil e parâmetros femininos na idade adulta em ratos wistar
(2021-06-25) Scarton, Suellen Ribeiro da Silva; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Arena, Arielle Cristina; Ceravolo, Graziela Scalianti; Goes, Rejane Maira; Beu, Célia Cristina Leme
O Brasil é um dos países que mais utiliza agrotóxicos no mundo e conta com legislação favorável a liberação de compostos de ação pouco conhecida sobre o organismo de mamíferos ou banidos em outras regiões do mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do inseticida Cyantraniliprole sobre parâmetros reprodutivos masculino e feminino de ratos Wistar púberes e adultos, após autorização OF. CIRC. CEUA nº134/2017, processo n° CEUA-UEL 211.062017-4. Em todos os experimentos o Cyantraniliprole foi utilizado em baixa dose de 10 mg / kg (grupo Low dose – LD) ou alta dose 150 mg / kg (grupo High dose – HD), água de torneira foi utilizada como veículo. No primeiro experimento machos, no dia pós-natal (DPN) 21, foram distribuídos nos grupos LD, HD ou controle (C), que recebeu somente veículo. O exposição se iniciou no DPN25, via intragástrica e a eutanásia ocorreu por saturação anestésica no DPN67. Espermatozoides foram coletados do ducto deferente para as análises de atividade mitocondrial da peça intermediaria, atividade da colinesterase – ChE, peroxidação lipídica – LPO, atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase - G6PD e atividade da malato desidrogenase – MDH. No segundo experimento machos, DPN21, foram distribuídos nos grupos exposição: LD, HD e C. O tratamento se iniciou no DPN25, via intragástrica. A eutanásia de metade dos animais de cada grupo ocorreu por saturação anestésica no DPN67. Os outros animais de cada grupo foram mantidos vivos por mais 42 dias, sem receber o cyantraniliprole, originando os grupos recuperação, a eutanásia desses animais ocorreu por saturação anestésica no DPN110. De todos os grupos foram coletados plasma para determinação da concentração de testosterona. Os testículos foram pesados e utilizados para contagem espermática, avaliação do sistema antioxidante e de parâmetros histológicos e estereológicos. Espermatozoides do ducto deferente foram utilizados para avalição morfológica. No terceiro experimento, os efeitos do cyantraniliprole foram observados em fêmeas adultas, DPN67, distribuídas nos grupos C, LD e HD (n=6 por grupo). A eutanásia ocorreu no DPN95, foram coletados sangue, para dosagem de progesterona, útero e ovários para avaliação morfométrica e histopatológica, contagem de folículos ovarianos e marcadores bioquímicos de estresse oxidativo. Foi realizada a mensuração da massa (g) do fígado, rins, glândulas hipófise e adrenal. A concentração de progesterona e o peso do útero, ovário, fígado, rins, glândula adrenal e a foram maiores em LD. O número de ciclos estrais diminuiu e a duração do ciclo aumentou nos animais HD. O epitélio glandular do útero foi maior e o número de folículos ovarianos, primordial + primário, pré-antral, antral e atrésico foi reduzido em LD. A análise histopatológica revelou a ocorrência de metaplasia do epitélio luminal do útero com presença de mitose e polimorfismo das células do epitélio glandular, além da presença de infiltrado inflamatório no endométrio. Nos ovários, vasos sanguíneos congestos e hiperplasia da rete ovarii foram observados. A atividade da colinesterase no útero foi menor em ambas as doses. Maior ocorrência de lipoperoxidação e da atividade da enzima SOD ocorreram apenas em LD, e a atividade da GST foi aumentada em LD e HD. No ovário, a atividade da colinesterase foi aumentada nos animais tratados com ambas as doses, e a atividade da GPx foi maior apenas com LD. Como resultados observamos que no primeiro experimento a atividade mitocondrial e da MDH diminuíram nos espermatozoides expostos a LD, sem o aumento da peroxidação lipídica. A atividade da G6PDH e da ChE foram similar entre os grupos. No segundo experimento a atividade do sistema antioxidante entre os grupos exposição e recuperação foi similar, no entanto a produção de testosterona in vitro aumentou em LD e HD e diminuiu em LDR e HDR. O número de células de Sertoli foi menor em todos os grupos que receberam cyantraniliprole tanto na fase de exposição como na recuperação. A fase I-V do ciclo do epitélio seminífero foi aumentada e a fase VII-VIII, diminuída nos grupos que receberam o tratamento nos dois períodos. A proporção do lúmen e estroma foi maior, e do epitélio menor, apenas em LD, no entanto o número de espermatozoides por grama de testículo e a produção diária de espermatozoides foi diminuiu nos animais que receberam ambas as doses de cyantraniliprole, independente da fase do experimento. Como consequência o número de espermatozoides normais foi menor nos grupos que receberam Cyantraniliprole em relação ao controle. As principais anormalidades morfológicas observadas nos espermatozoides foram: falta de curvatura e cabeças isoladas, caudas quebradas e enroladas, e falta de integridade do acrossoma. No terceiro experimento, a concentração de progesterona e o peso do útero, ovário, fígado, rins, glândula adrenal foram maiores em LD. O número de ciclos estrais diminuiu e a duração do ciclo aumentou nos animais HD. O epitélio glandular do útero foi maior e o número de folículos ovarianos, primordial + primário, pré-antral, antral e atrésico foi reduzido em LD. A análise histopatológica revelou a ocorrência de metaplasia do epitélio luminal do útero com presença de mitose e polimorfismo das células do epitélio glandular, além da presença de infiltrado inflamatório no endométrio. Nos ovários, vasos sanguíneos congestos e hiperplasia da rete ovarii foram observados. A atividade da colinesterase no útero foi menor em ambas as doses. Maior ocorrência de lipoperoxidação e da atividade da enzima SOD ocorreram apenas em LD, e a atividade da GST foi aumentada em LD e HD. No ovário, a atividade da colinesterase foi maior nos animais tratados com ambas as doses, e a atividade da GPx foi maior apenas com LD. Esses resultados mostram que a baixa dose de cyantraniliprole prejudicou a membrana celular e a produção de energia dos espermatozoides e que os danos gerados pela exposição ao cyantraniliprole na puberdade foram mantidos ou acentuados, mesmo após o período de recuperação, ou seja, na vida adulta. O trato genital feminino também sofreu alterações, o que pode representar prejuízos fertilidade a esses indivíduos.
Polimorfismos dos genes TGFB1 e TGFBR2: relação com suscetibilidade e prognóstico da leucemia linfoide aguda na população infantojuvenil brasileira
(2021-02-26) Sakaguchi, Alberto Yoichi; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Oliveira, Carlos Eduardo Coral de; Ariza, Carolina Batista; Oliveira, Gabriela Gonçalves de; Vitiello, Glauco Akelinghton Freire; Amarante, Marla Karine
A leucemia linfoide aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica que apresenta maior incidência na faixa pediátrica e acomete o processo fisiológico da hematopoese, acumulando principalmente células precursoras das linhagens B e T não funcionais, denominadas de linfoblastos. Essas células perdem a capacidade de diferenciação celular e acometem o compartimento da medula óssea e/ou sangue periférico, comprometendo outras linhagens celulares. A etiologia específica da LLA permanece desconhecida, no entanto, algumas hipóteses sugerem o envolvimento do sistema imunológico na LLA. Uma das moléculas implicadas é a citocina fator de crescimento transformador beta (TGFß), a qual fisiologicamente apresenta um papel pleiotrópico, incluindo função reguladora da hematopoese. Dentro da família do TGFß, o TGFß1 é a isoforma mais abundante e, junto com os seus receptores (TGFßRI e TGFßRII), pode ativar uma cascata de sinalização seguida de expressão gênica em diferentes tipos de células alvo. Alguns estudos apontam para influências dos polimorfismos dos genes TGFB1 e TGFBR2 nas neoplasias hematológicas, inclusive LLA. Sendo assim, este trabalho visou avaliar as variantes genéticas do TGFB1 (rs1800468, G-800A; rs1800469, C-509T; rs1800470, C29T; rs1800471, G74C) e suas estruturas haplotípicas, e do TGFBR2 (rs3087465, G-875A) entre pacientes com LLA e crianças livres de neoplasia, suas associações com a suscetibilidade e o prognóstico dos pacientes com LLA, e correlacionar a presença das variantes com seus dados clínicopatológicos. Os resultados apontaram que o polimorfismo C29T em heterozigose apresentou um efeito protetor em comparação com homozigoto selvagem nos LLA geral e subtipo LLA de células B (LLA-B). Em contrapartida, o alelo T do C29T foi associado à suscetibilidade tanto para LLA geral quanto para LLA-B. Numa análise de correlação, o polimorfismo G74C apresentou uma correlação negativa com recaída para os LLA geral e subtipo LLA-B, e o haplótipo GTTG no modelo dominante correlacionou-se negativamente com óbito apenas para LLA geral. No entanto, os haplótipos GCTG no modelo recessivo e GCCG no modelo dominante correlacionaram-se positivamente com óbito e idade, respectivamente, para LLA geral. Na estratificação de risco, o polimorfismo C-509T no modelo dominante observou-se uma correlação negativa com óbito para LLA geral Alto Risco (AR), enquanto que, haplótipo GTTG no mesmo modelo correlacionou-se negativamente com óbito no mesmo grupo de risco. O haplótipo GCCG no modelo dominante correlacionou-se positivamente com recaída para LLA geral Baixo Risco (BR), e o haplótipo GCTG no modelo recessivo apresentou uma correlação positiva com óbito para LLA geral AR. Ainda, o haplótipo GCCG no modelo dominante correlacionou-se positivamente com recaída para LLA-B BR. Com relação ao polimorfismo rs3087465 (G-875A) do TGFBR2, os resultados apontaram uma associação com suscetibilidade para LLA geral e subtipo LLA-B. Ainda, o G-875A associou-se com suscetibilidade no grupo AR tanto para LLA geral quanto para LLA-B, aumentando a chance de recaída para estes subtipos. Num estudo de correlação, o G-875A apresentou uma correlação positiva com grupo de risco de recaída para os subtipos LLA geral e LLA-B. Além disso, o polimorfismo G-875A correlacionou-se positivamente com recaída nos modelos dominante e aditivo na LLA-T. É imprescindível que investigações adicionais com alvo nas vias de sinalização desta citocina e seu receptor sejam conduzidas a fim de elucidar sua influência na leucemogênese desta neoplasia. Desta forma, a citocina TGFß1 junto com um dos receptores (TGFßRII) podem servir como marcadores de prognóstico e de suscetibilidade da LLA na população infantojuvenil brasileira.
Alterações morfofisiológicas no cólon de ratos após exposição a baixas doses de malation
(2021-11-23) Pupim, Andréia Carla Eugenio; Araújo, Eduardo José de Almeida; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Buttow, Nilza Cristina; Castelucci, Patrícia; Sant Ana, Débora de Mello Gonçales
Malation (MAL) é um inseticida organofosforado inibidor das colinesterases, muito utilizado para o controle de pragas na agricultura como no combate de mosquitos vetores transmissores de várias arboviroses. O uso deste pesticida químico, expõe os seres humanos aos seus efeitos tóxicos. Sintomas gastrointestinais são observados devido acúmulo de acetilcolina e de alterações no sistema nervoso entérico (SNE) resultando em modificações morfofisiológicas dos órgãos do trato gastrointestinal. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da exposição contínua de duas doses de MAL: 10 e 50 mg/Kg, consideradas baixas de acordo com DL50 oral, no cólon de ratos avaliando a estrutura da parede e parâmetros de motilidade colônica. Ratos Wistar foram distribuídos em três grupos: Controle que recebeu solução salina 0,9% e os grupos M10 e M50 que receberam 10 e 50 mg/Kg, respectivamente, de MAL via gavagem por 40 dias. O cólon foi coletado para análises histopatológicas, do SNE, atividade de colinesterase e análises funcionais. Os dados coletados foram avaliados de acordo com o tipo de distribuição. Ambos os grupos foram comparados em relação ao controle. As diferenças estatísticas foram consideradas quando P<0,05. Após período experimental foi observado em ambos os grupos alterações significativas no fenótipo dos pellets fecais, menor tempo de trânsito intestinal no grupo M50. Após eutanásia constatou-se redução da atividade da butirilcolinesterase. Alterações macroscópicas não foram significativas. Microscopicamente houve atrofia da mucosa em M10 e hipertrofia no M50, e aumento da profundidade das criptas em M50. As camadas submucosa e musculares dos grupos estavam atrofiadas, com redução da massa citoplasmática das células dos estratos musculares demonstrada com aumento do número de núcleos. Na avaliação da densidade populacional de neurônios do SNE, não foram observadas alterações de neurônios imunorreativos (IR) para HuC/D e calrretinina no plexo submucoso (PS) e de neurônios IR para HuC/D, ChAT e nNOS no plexo mioentérico (PM), com redução da proporção de neurônios colinérgicos em relação ao total de neurônios no grupo M50 no cólon proximal (CP), porém no PM no cólon distal (CD) houve perda neuronal de neurônios IR para HuC/D em ambos grupos e menor número para nNOS em M10. Os corpos celulares neuronais estavam hipertrofiados em M10 em ambas as porções e no M50 no CD, com atrofia do M50 na CP no PS. No PM observou-se atrofia no grupo M10 para todas as populações avaliadas no CP e no CD para HuC/D e nNOS, e hipertrofia para ChAT no CD no M50. As baixas doses de MAL desencadearam uma série de alterações nos padrões de motilidade do cólon e da frequência, a duração e a direção dos Complexos Motores Migratórios Colônicos (CMMCs). Em M10, observou-se contrações simultâneas que apresentavam maior pressão e tempo de duração, e aumento no intervalo entre as contrações, sem alterar o perfil dos CMMCs. Em M50, a alteração de motilidade foi mais expressiva, com redução na frequência de CMMCs anterógrados e aumento na frequência de CMMCs retrógrados. Conclui-se que a exposição oral contínua ao MAL causou modificações estruturais e funcionais do cólon de ratos em ambas as doses.
Interação das variantes de nucleotídeo único de CXCL12 rs1801157 e CXCR4 rs2228014 e da expressão tecidual de CXCR4 na infecção pelo papilomavírus humano, no desenvolvimento de lesão intraepitelial escamosa e do câncer cervical
(2021-05-20) Okuyama, Nádia Calvo Martins; Oliveira, Karen Brajão de; Hirata, Bruna Karina Banin; Guembarovski, Roberta Losi; Serpeloni, Juliana Mara; Andrade, Fabio Goulart de
O papilomavírus humano (HPV) está associado ao desenvolvimento de verrugas genitais bem como ao desenvolvimento de lesões no colo do útero e ao câncer cervical. No entanto, para o desenvolvimento de lesões precursoras e do câncer são necessárias também condições intrínsecas ao indivíduo como o sistema imunológico. Neste contexto, destaca-se o eixo CXCL12/CXCR4 e suas variantes genéticas, uma vez que este eixo tem papel fundamental na regulação do tráfego de células imunológicas e tumorais. O gene CXCL12 pode conter um uma variante de nucleotídeo único (do inglês, single nucleotide variant (SNV)) na região 3’ não traduzida (3’UTR) também conhecido como rs1801157. Em relação ao gene do receptor CXCR4, o SNV é identificado como rs2228014. Até o presente momento, não existem estudos avaliando a interação entre o SNV rs1801157 de CXCL12 e o SNV rs2228014 de CXCR4 no contexto da infecção pelo HPV e o desenvolvimento de câncer de colo de útero. Amostras de muco cervical e sangue periférico foram coletadas de 424 mulheres submetidas ao exame citológico, e amostras de tecido tumoral embebidas em parafina foram provenientes do Hospital do Câncer de Londrina. As participantes foram estratificadas com base na presença ou ausência de DNA do HPV, testada pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e de acordo com o a presença de lesões conforme determinado por análise citológica ou biópsia cervical. Dados clínicos e histopatológicos de pacientes com câncer e dados sociodemográficos de todas as participantes também foram coletados. As análises das variantes genéticas mostraram uma associação significativa para CXCR4 rs2228014 em relação a infecção por HPV em diferentes modelos genéticos: codominante CT (ORadj=2,005, 95%IC (1,03-3,87) p=0,038) e dominante CT+TT (ORadj=2,254, 95%IC (2,25-4,20) p=0,011), e ao desenvolvimento de câncer cervical: codominante CT (CC: ORadj=4,755, 95%IC (1,92-11,84) p=0,001), dominante CT+TT (CC: ORadj=4,755, 95%IC (2,09-10,81) p<0,001). CXCL12 rs1801157 encontrou-se associado a lesão intraepitelial escamosa (LIE) e ao câncer cervical: CXCL12 codominante AA (LIE: ORadj=8,857, 95%IC (3,24-24,20) p<0,001; CC: ORadj =5,031, 95%IC (1,48-17,00) p=0,009) e AA (LIE: ORadj=9,425, 95%CI (3,26-23,14) p<0,0001; CC: ORadj=5,962, 95%IC (1,89-18,72) p=0,005). A análise da interação entre ambas variantes genéticas mostrou que as variantes combinadas se encontram independentemente associadas à infecção por HPV: CXCL12 GA + CXCR4 CT (codominante) (ORadj=7,345, 95%IC (2,124-25,400) p=0,002); CXCL12 GA+AA + CXCR4 CT+TT (ORadj=10,138, 95%IC (3,466-29,652) p<0,001). Em relação a LIE as interações significativas foram: CXCL12 GA+AA + CXCR4 CC+CT (ORadj=2,068, 95%IC (1,123 – 3,811) p=0,002). Para o câncer cervical: CXCL12 AA + CXCR4 CT (ORadj=7,634, 95%IC (2,580-22,571) p=0,015), CXCL12 GA+AA + CXCR4 CT+TT (ORadj=4,207, 95%IC (1,641-10,753) p=0,006), CXCL12 GA+AA + CXCR4 CT (ORadj=3,021, 95%IC (1,382-10,570) p=0,011). A marcação tecidual do receptor CXCR4 por imunohistoquímica, não se mostrou associada aos parâmetros clinicopatológicos [tipo de tumor (p=0,310); grau histológico (p=0,959) e estadiamento (p=0,776)] bem como as variantes de nucleotídeo único rs2228014 [codominante (p=0,372); dominante (p=0,198); recessivo (p=0,639) e overdominante (p=0,200)] e rs1801157 [codominante (p=0,116); dominante (p=0,163); recessivo (p=0,050) e overdominante (p=0,545)]. Embora o modelo recessivo do SNV rs1801157 de CXCL12 tenha apresentado uma forte marcação para o CXCR4 (p=0.050). Os SNVs também não foram associados aos parâmetros clinicopatológicos. Esta é a primeira vez que a análise de interação dos SNVs rs1801157 de CXCL12 e rs2228014 de CXCR4 são analisados em relação a infecção pelo vírus HPV, lesões intraepiteliais escamosas e ao câncer cervical. Com base nos resultados apresentados, ambas as variantes genéticas podem ser consideradas interessantes candidatas a suscetibilidade para essa a progressão do câncer de colo de útero uma vez que a presença dos alelos variantes foi associada a uma maior susceptibilidade tanto à infecção pelo HPV como ao desenvolvimento de LIE e do câncer cervical.
Efeito terapêutico e mecanismos de ação da resolvina d5 em modelos de artrite
(2021-09-22) Manchope, Marília Fernandes; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Ferraz, Camila Rodrigues; Kwasniewski, Fábio Henrique; Ribeiro, Felipe Pinho; Pinto, Larissa Garcia
A dor e inflamação articular acomete pacientes com artrite reumatoide (AR), ou que passaram por um procedimento que falhou de artroplastia/implante e tratamentos mais eficazes são necessários nestes casos. Utilizou-se neste trabalho dois modelos experimentais: 1) artrite induzida pelo antígeno albumina de soro bovino metilada (mBSA) em camundongos imunizados com mBSA emulsificado em CFA ou IFA; 2). artrite crônica induzida por dióxido de titânio (TiO2). Como abordagem terapêutica utilizou-se a resolvina (Rv)D5, que é um mediador lipídicos pró-resolução, e estes mediadores possuem potente ação resolutiva da inflamação e induzem analgesia prolongada. Camundongos C57BL/6 (20-25g) foram pré-tratados com RvD5 [3, 10 e 30 ng, i.p.) 30 minutos antes do desafio intra-articular (i.a.) com mBSA (100 µg). A hipersensibilidade mecânica e edema foram avaliados (1-24h) após o desafio, e infiltrado de neutrófilos (9-48h). Avaliou-se 24h após o desafio, a ativação de neurônios do gânglio da raiz dorsal (GRD) e expressão de RNAm para os canais TRPV1 e Nav1.8. Determinou-se no GRD 9h após o desafio: i) níveis do peptídeo B?B, iii) porcentagem de p-NF?relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), ii) p-NF na população de neurônicos CGPR+ . Na medula espinal, 9h após desafio avaliou-se a expressão de RNAm para GFAP, Olig-2, Iba-1, CX3CR1, ST2, IL-33, TNFa, pro-IL 1ß e IL-10. Utilizou-se um protocolo prolongado consistindo de 2 desafios i.a. com mBSA primeiro no tempo zero e após 120h. Os animais foram pré-tratados 30 minutos antes do primeiro desafio e o tratamento com RvD5 repetido a cada 48h. A hipersensibilidade mecânica e edema foram avaliados diariamente até 240h após o primeiro desafio com mBSA nos camundongos. No contexto da artrite crônica induzida por TiO2, camundongos Swiss ou LysM-eGFP / CCR2-RFP (20-25g) foram tratados com RvD5 (1, 3 e 10 ng, i.p.) e 24h após o estímulo i.a. com TiO2 (3mg), e o tratamento repetido a cada 72h. Fenótipo da artrite (comportamento nociceptivo e edema articular) foi avaliado ao longo de 30 dias. Após 30 dias avaliou-se, o dano histopatológico, recrutamento de leucócitos, estresse oxidativo, e RNAm para gp91phox , iNOS TNFa, pró-IL-1ß. In vitro utilizou-se macrófagos derivados da medula óssea, as células foram pré-tratados por 12h com RvD5 (0,1-100 ng/ml), primados com LPS e exposto ao TiO2. O sobrenadante foi utilizado para dosagem de TNFa, IL-1ß por ELISA, lactato desidrogenase, e os macrófagos para a translocação B por imunofluorescência. A RvD5 induziu analgesia e efeito anti inflamatório em ambos os modelos avaliados, reduzindo a hipersensibilidade?nuclear de p-NF mecânica, térmica, edema e alteração na distribuição do peso corpóreo das patas traseiras do camundongo. Na AR, a RvD5 reduziu a ativação neuronal, a ativação de neurônicos CGRP+ no GRD, inibiu a neuroinflamação na medula espinal reduzindo a ativação de células da glia e expressão de citocinas e o receptor ST2. Já na artrite crônica induzida por TiO2 RvD5 inibiu o infiltrado de leucócitos Lysm+ e CCR2+ , estresse oxidativo articular, expressão de RNAm para TNFa e pro-IL-1ß in vivo e B induzidos por TiO2 in vitro. Portanto a RvD5?produção de TNFa e ativação do NF é uma abordagem terapêutica promissora no contexto da dor articular, minimizando a dor e inflamação, e modulando mecanismos inflamatórios periféricos e mecanismo sensoriais de camundongos acometido com dor articular.
Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo e marcadores inflamatórios sistêmicos de pacientes com Carcinoma Papilífero de tireoide e tireoidite de Hashimoto residentes no Norte do Paraná
(2021-04-09) Lopes, Natália Medeiros Dias; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Seiva, Fabio Rodrigues Ferreira; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Andrade, Fábio Goulart de; Montoro, José Raphael de Moura Campos
O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia maligna endócrina mais incidente, com maior acometimento entre as mulheres. É dividido em diferentes subtipos, sendo o carcinoma papilífero da tireoide (CPT) o mais frequente. Outras alterações podem se desenvolver na tireoide, como as doenças autoimunes, cuja principal representante é a tireoidite de Hashimoto (TH). Desde 1955, quando foi descrito pela primeira vez uma possível relação entre TH e CT, vários estudos têm sido elaborados na tentativa de elucidar esta correlação, entretanto, ainda não foram totalmente esclarecedores. Sabendo-se que o estresse oxidativo (EO) está relacionado com o desenvolvimento de diversos tipos de câncer, bem como a participação de marcadores inflamatórios, o objetivo deste trabalho foi determinar a participação do EO e dos marcadores inflamatórios sistêmicos em pacientes com CPT e TH residentes no norte do Paraná. Após aprovação ética (CEP-UEL nº 2.793.785), foram coletadas amostras de 115 pacientes, divididos entre os grupos: BENIGNO (n=63), CPT (n=27), TH (n=15) e CPT+TH (n=10). Um questionário para avaliar as características clínico patológicas e uma amostra de tecido também foram coletados. Sessenta e três indivíduos saudáveis foram utilizados como controle. Quanto às análises de EO, foram avaliados nos eritrócitos os parâmetros de defesa antioxidante Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e Glutationa reduzida (GSH), além dos relacionados a lipoperoxidação, como a quimiluminescência induzida por terc-butil hidroperóxido e Malondialdeído (MDA), dosado no plasma. Os marcadores inflamatórios, interleucina-10 (IL-10), TGF-ß1 e TNF-a também foram analisados no plasma. No microambiente tumoral avaliamos marcadores de estresse oxidativo (3-nitrotirosina e 4-hidroxinonenal), além de ki-67 e VEGF. Os resultados da CAT e SOD demonstraram valor maior nos grupos com alteração da tireoide em relação ao grupo controle. Quanto a GSH, os grupos BENIGNO e CPT apresentaram valores reduzidos em relação ao controle. Quando apenas os grupos CPT e CPT+TH foram comparados, nenhuma diferença significativa foi encontrada quanto aos parâmetros de EO, bem como quanto aos resultados dos marcadores inflamatórios. A capacidade de conter a lipoperoxidação induzida foi menor e um alto nível de MDA plasmático foi observado no grupo CPT. Para a análise entre CPT e CPT+TH, a participação do EO foi mais pronunciada no grupo CPT. Na imunohistoquímica, foi encontrado maior marcação no grupo CPT quanto aos parâmetros analisados, quando comparado ao CPT+TH. Pacientes com CPT sem TH apresentam maiores níveis de EO e marcadores de proliferação e angiogênese, assim, apresentam cenário mais favorável a metástases, e possível pior prognóstico, do que pacientes com associação entre CPT e TH.
Variações genéticas, níveis cervicais e plasmáticos de TGFB1: implicações na infecção pelo HPV e no câncer cervical
(2020-04-03) Trugilo, Kleber Paiva; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi; Galhardi, Ligia Carla Faccin; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Watanabe, Maria Angelica Ehara
O papilomavírus humano (HPV) é o principal agente causador das lesões intraepiteliais cervicais e do câncer cervical. Entretanto, a resposta imune apresenta um impacto considerável no desfecho da infecção. Neste contexto, o fator de transformação do crescimento ß 1 (TGFB1) parece desempenhar um papel dual, atuando como supressor ou favorecendo a progressão das lesões e do câncer. Como variações genéticas podem influenciar a produção de TGFB1, o presente estudo teve como objetivo verificar o papel das variações genéticas c.–1638G>A, c.–1347T>C, c.29C>T e c.74G>C de TGFB1 e suas estruturas haplotípicas na suscetibilidade à infecção pelo HPV e no desenvolvimento das lesões cervicais e do câncer, além de analisar se os haplótipos influenciam os níveis cervicais e plasmáticos de TGFB1. Um total de 402 mulheres participaram do estudo. Amostras de muco cervical e sangue periférico foram coletadas de 351 mulheres submetidas a exame citológico e amostras de tecido tumoral embebidas em parafina de 51 pacientes foram fornecidas pelo Hospital do Câncer de Londrina. As participantes foram estratificadas com base na presença ou ausência de DNA do HPV, testada pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e de acordo com o status cervical, conforme determinado por análise citológica ou biópsia cervical [sem lesão cervical, lesões de baixo e alto grau (LIEBG e LIEAG) e câncer]. Dados clínicos e histopatológicos de pacientes com câncer e dados sociodemográficos de todos as participantes também foram coletados. Os genótipos das variações de TGFB1 foram determinados por PCR seguida de digestão enzimática e as estruturas haplotípicas foram inferidas pelo software PHASE 2.1.1. Os níveis cervicais e plasmáticos de TGFB1 foram medidos por ensaio imunofluorimétrico. As análises caso-controle foram realizadas por regressão logística ajustada para possíveis fatores de confusão e por testes de Mann-Whitney e Kruskal Wallis. Para a primeira produção científica (artigo 1), foram incluídas 190 mulheres não infectadas por HPV (controles) e 161 infectadas. Entre as infectadas (com exclusão de cinco pacientes), 80 (51,3 %) não apresentavam lesão cervical, 23 (14,7 %) possuíam LIEBG e 53 (34,0 %) tinham LIEAG. A análise das variantes genéticas mostrou que os alelos –1347T (P = 0,028) e 29C (P = 0,006) e o genótipo 29CC (P = 0,023) foram proporcionalmente mais frequentes nas mulheres infectadas do que nas não infectadas (40.1%, 50.0%, 24.8% e 32.1%, 39.7%, 17.4%, respectivamente), enquanto não houve diferença entre os grupos de lesão. Considerando os haplótipos, oito estruturas foram inferidas. Dessas, GCTG, aqui denominado *4, foi mais frequente no grupo infectado do que no não infectado (P = 0,003). A análise por regressão logística mostrou que mulheres –1347TT e – 1347CT+TT foram mais suscetíveis à infecção pelo HPV do que –1347CC (OR = 2,16; IC95 % = 1,10 – 4,25 e OR = 1,62; IC95 % = 1,03 – 2,54). Da mesma forma, 29CT, 29CC e 29CT+CC aumentaram a suscetibilidade ao HPV quando comparados com 29TT (OR = 1,77; IC95 % = 1,06 – 2,97; OR = 2,31; IC95 % = 1,23 – 4,34 e OR = 1,92; IC95 % = 1,18 – 3,12, respectivamente). Por outro lado, portadoras do haplótipo *4 (que contém os alelos –1347C e 29T) em homozigose foram menos suscetíveis ao HPV do que as não portadoras de *4 (OR = 0,39; IC95 % = 0,21 – 0,72). Por fim, comparando os dois haplótipos mais frequentes, *3 (GTCG) com *4, mulheres *3/*3 e *3/*4 foram mais suscetíveis ao HPV do que mulheres *4/*4 (OR = 2,13; IC95% = 1,13 – 4,00 e OR = 2,81; IC95% = 1,29 – 6,10, respectivamente). As pacientes infectadas pelo HPV apresentaram níveis maiores de TGFB1 no plasma [4575,19 (IQR = 4392,34) pg/mL] e no muco cervical [53,17 (IQR = 56,46) pg/mg de proteínas] comparadas com as não infectadas [2964,80 (IQR = 3091,45) pg/mL e 32,57 (IQR = 54,49) pg/mg de proteínas, respectivamente] (P = 0,001 e P = 0,008, respectivamente). Maiores níveis também foram observados no plasma do grupo LIEBG [6653,45 (IQR = 5098,44) pg/mL] do que no grupo sem lesão [3689,4 (IQR = 3383,8) pg/mL] (P = 0,010). Com relação aos haplótipos, mulheres infectadas portando *3/outros (heterozigotas) apresentaram níveis menores de TGFB1 plasmático do que mulheres infectadas não portadoras (outros/outros) [3067,13 (IQR 4200,20) pg/mL e 4836,23 (IQR 4313,38) pg/mL, respectivamente, P = 0,03]. Da mesma forma, mulheres infectadas *3/*3 + *3/outros [3993,99 (IQR = 4173,05)] tiveram níveis mais baixos de TGFB1 plasmático (P = 0.04) do que as infectadas não portadoras [4836,23 (IQR = 4313,38)]. No segundo artigo, foram incluídas apenas pacientes infectadas (n = 130) e distribuídas nos grupos sem lesão (79/60,8 %) e câncer (51/39,2 %). Inicialmente, nenhuma das variações genéticas enquanto marcadores isolados foi associada com o câncer. No entanto, o haplótipo GTCG nos modelos dominante e recessivo aumentou a suscetibilidade ao câncer cervical (OR = 2,48; IC95% = 1,05 – 5,83 e OR = 4,73; IC95% = 1,18 – 19,02; respectivamente). Com base nos resultados dos artigos 1 e 2, esta é a primeira vez que haplótipos de TGFB1 foram associados com a infecção pelo HPV e com o câncer cervical, sugerindo as estruturas haplotípicas de TGFB1 (c.–1638G>A, c.–1347T>C, c.29C>T e c. 74G>C) como potenciais loci candidatos de suscetibilidade para estas doenças.
Investigação da variante genética LTF rs1126478 como marcador de suscetibilidade e detecção de cárie pelo método ICDAS em pré-escolares
(2020-04-01) Singi, Paola; Oliveira, Karen Brajão de; Frederico, Regina Célia Poli; Guembarovski, Roberta Losi; Inagaki, Luciana Tiemi; Caldarelli, Pablo Guilherme; Garbelini, Cássia Cilene Dezan
A cárie dentária é considerada o maior problema de saúde bucal no mundo, acometendo adultos e crianças em todas as faixas etárias e classes sociais. Estudos tem associado a participação de proteínas salivares, como a lactotransferrina (LTF) na patogênese da cárie. A LTF é uma glicoproteína salivar importante, que interage com o biofilme dentário por diferentes mecanismos como atividade quelante de ferro ou ainda por modular o desenvolvimento do biofilme dentário e inibir a adesão do Streptococcus mutans na superfície dentária. Sabendo que variações genéticas podem alterar a expressão e produção de proteínas e já foram descritas muitas variações na sequência gênica da LTF, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência da variante LTF rs1126478 (c.140A>G no exon 2, Lys47Arg) na suscetibilidade à cárie dentária em pré-escolares. O artigo 1 descreveu um protocolo para calibração de dentistas em diagnósticos de cárie dentária a partir do Sistema Internacional de Detecção e Avaliação de Cárie (ICDAS). Neste estudo transversal, quatro examinadores avaliaram 800 superfícies de molares decíduos em 20 pré-escolares. O treinamento teórico-prático foi conduzido por um odontopediatra com experiência em estudos epidemiológicos. Foram realizadas duas rodadas (1 e 2), cada uma consistindo de dois exames intra-orais sob condições padronizadas, com um intervalo de 7 dias entre os exames (n=10). A confiabilidade foi avaliada pelo índice kappa ponderado. As concordâncias intra-examinadores variaram de 0,56 a 0,76 e 0,72 a 0,83 nas rodadas 1 e 2, respectivamente. Para a concordância inter-examinadores a variação foi de 0,45 a 0,73 e 0,62 a 0,73 nas rodadas 1 e 2, respectivamente. O treinamento melhorou consideravelmente os resultados e o protocolo descrito permitiu estabelecer um alto grau de confiabilidade entre os examinadores. O artigo 2 descreveu um estudo caso-controle, no qual foram incluídas 448 crianças em idade pré-escolar de 3 a 6 anos; 219 do sexo masculino e 229 do sexo feminino. Após o exame intra-oral, a população do estudo foi dividida de acordo com os critérios do ICDAS em grupos: 48 crianças sem cárie (ICDAS 0), 248 crianças no grupo com lesão de mancha branca (ICDAS 1-2) e 152 crianças no grupo com cárie de esmalte e dentina (ICDAS 3-6). O polimorfismo do gene LTF rs1126478 foi genotipado pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida da análise dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)), a partir do DNA extraído de saliva coletada das crianças. Por meio de modelo de regressão logística multinomial ajustado para fatores de confusão, observou-se que crianças com o genótipo AG apresentaram menor suscetibilidade à cárie quando comparadas àquelas com o genótipo AA (OR= 0,42; IC95%= 0,18-0,95; P= 0,038) e AA+GG (OR= 0,43; IC95%= 0,21-0,87; P= 0,020). Fatores intrínsecos e comportamentais, especialmente a frequência de ingestão de açúcar foram associados com processo de cárie. Este é o primeiro estudo a mostrar a associação da variação genética LTF rs1126478 no desenvolvimento de cárie, utilizando os critérios do ICDAS. O polimorfismo LTF rs1126478 foi associado com a cárie dentária em uma população brasileira, entretanto mais análises são necessárias para confirmar a real influência deste polimorfismo no desenvolvimento da cárie.
Influência do consumo de sacarose e frutose sobre a morfologia e função do sistema reprodutor masculino de ratos Wistar
(2020-02-27) Alvarenga, Daniele Sapede; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Pinge, Marli Cardoso Martins; Gerardin, Daniela Cristina Ceccatto; Uchôa, Ernane Torres; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini
O aumento do consumo de açúcar é responsável pela incidência de hipertensão, obesidade e diabetes em crianças e adolescentes. O estilo de vida pode resultar em alterações nesses indivíduos quando adultos, afetando o desenvolvimento pós-natal do sistema reprodutor e prejudicando a fertilidade. O estresse oxidativo é o desequilíbrio entre elementos antioxidantes e oxidantes como os radicais livres. Dessa forma, níveis elevados de radicais livres estão envolvidos em diferentes processos patológicos. Alimentos ricos em componentes antioxidantes estão associados com uma melhor qualidade de vida. Pterostilbeno é um componente antioxidante das blueberries e tem demonstrado benefícios terapêuticos em várias doenças. Sendo assim, nós levantamos as hipóteses: se o alto consumo de frutose no período puberal poderia afetar a fase adulta; e se a administração alta de sacarose na fase adulta afeta o sistema reprodutor e o uso de antioxidantes melhora os efeitos gerados. Para isso, ratos Wistar machos (30 dias de idade) foram distribuídos em quatro diferentes grupos: Fr30, que receberam frutose (20%) na água por 30 dias; Re-Fr60, que receberam frutose (20%) por 30 dias e permaneceram por mais 60 dias sem o tratamento; e dois grupos controles C30 e Re-C60, com água ad libitum. No segundo modelo experimental, ratos Wistar machos (60 dias de idade) foram tratados com solução de sacarose (40%) ou água por 150 dias e distribuídos em quatro grupos: grupo Controle; Pterostilbeno (40mg/kg por gavagem); Sacarose (40%) na água; Sacarose (40%) + Pterostilbeno (40mg/kg) por mais 45 dias. Frutose induziu um aumento de túbulos seminíferos anormais com vacúolos epiteliais, degeneração e células imaturas no lúmen, além disso, aumentou a produção diária de espermatozoides (DSP). Após descontinuar o tratamento, a DSP e o número de espermatozoides diminuiu significativamente. Sacarose induziu estresse oxidativo reduzindo túbulos seminíferos normais, células de Leydig e Sertoli e o número de espermatozoides normais. No entanto, o tratamento com pterostilbeno não foi eficiente em reduzir a peroxidação lipídica nos testículos. Nós concluímos que o consumo de frutose em ratos peribuberais leva a alterações no sistema reprodutor observadas na fase adulta; e o tratamento com pterostilbeno não foi eficiente em reduzir os danos oxidativos nos testículos causados pelo alto consumo de sacarose.
Análise da perda de força e de massa muscular na síndrome da caquexia induzida pela forma sólida do adenocarcinoma de Ehrlich
(2020-07-21) Bordini, Heloiza Paranzini; Guarnier, Flávia Alessandra; Araújo, Eduardo José de Almeida; Cecchini, Rubens; Sczepanski, Cláudia Roberta Brunnquell; Borghi, Sergio Marques
Caquexia é uma síndrome complexa que afeta pacientes com doenças crônicas, como o câncer e piora a qualidade de vida e o prognóstico da doença, pois faz com que o indivíduo se torne resistente à terapia anticâncer, culminando em um mau prognóstico em cerca de 70-80% dos pacientes com estágio avançado. A caquexia é diretamente responsável por 20-30% das mortes por câncer, devido à falência cardíaca e respiratória. Sabe-se que espécies reativas de oxigênio têm importante participação na caquexia, afetando principalmente o músculo esquelético, levando ao dano oxidativo e perda de massa muscular, o que provoca fraqueza e fatigabilidade, distúrbios no metabolismo de todo o corpo, recuperação tardia de doenças e lesões agudas, aumento da morbimortalidade por doenças crônicas, quedas, estadas hospitalares prolongadas e perda de vida independente. O objetivo deste estudo é avaliar a interferência do estresse oxidativo na atrofia e perda de força presentes na síndrome da caquexia em tempos experimentais diferentes (14 dias e 28 dias), em um novo modelo experimental de tumor de Ehrlich, comparando dois tipos de fibras musculares: fibras lentas e fibras rápidas. Malondialdeído (MDA) foi quantificado por TBARS, os hidroperóxidos lipídicos por quimiluminescência, e proteínas carbonílicas por ELISA. A área de secção transversa foi analisada para avaliar a área das fibras. As fibras rápidas mostram mais estresse oxidativo comparado às fibras lentas em 14 dias; no entanto, estas fibras mostram menos estresse oxidativo em 28 dias, sugerindo que este tipo de fibra tem ação de algum efeito protetor. Alguns parâmetros oxidativos, como a carbonilação de proteínas e a hidroperodixação lipídica não parecem ser danos importantes para as fibras rápidas, ao contrário do MDA, que parece ser o principal indutor de atrofia neste tipo de músculo, que apresenta maior diminuição na área das fibras, mesmo em 14 dias. Este trabalho tràs à luz a sugestão de que diferentes tipos de fibras musculares se comportam de maneira diferente, de acordo com o modelo experimental indutor de caquexia. Portanto, o estudo de diferentes modelos experimentais se faz necessário para que se possa compreender quais são as possíveis alterações que acontecem na síndrome da caquexia no câncer.
Efeitos da alteração do ciclo circadiano materno sobre o desenvolvimento do sistema reprodutor da prole na vida adulta em ratos
(2019-03-29) Ogo, Fernanda Mithie; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Cecchini, Alessandra Lourenço; Gerardin, Daniela Cristina Ceccatto; Andrade, Fábio Goulart; Pinge, Marli Cardoso Martins
Alterações no ciclo circadiano são conhecidas por causar distúrbios fisiológicos nos eixos hipotálamo-hipófise-adrenal e hipotálamo-hipófise-gonadal em indivíduos adultos. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar se a exposição de ratas prenhas à luz constante pode alterar o desenvolvimento do sistema reprodutor da prole masculina e feminina. As mães foram divididas em dois grupos: um grupo claro-escuro (LD) que de ratas prenhes foram expostas a um fotoperíodo claro-escuro (12h/12h), e um grupo claro-claro (LL) que de ratas prenhes foram expostas a um fotoperíodo de luz constante durante o período de gestação. Após o nascimento, os filhotes de ambos os grupos permaneceram no fotoperíodo claro-escuro normal (12h/12h) até a idade adulta. Um filhote (macho e fêmea) de cada ninhada foi selecionado e, na idade adulta (PND 90), o sangue do tronco foi coletado no PND90 mensuração dos níveis plasmáticos de testosterona, testículos e epidídimo para contagem de espermatozoides, estresse oxidativo e análises histopatológicas, e os espermatozoides dos vasos deferentes, para realizar as análises morfológicas e de motilidade em machos e na prole feminina, foi coletado na fase de estro, para análise dos níveis plasmáticos de hormônio luteinizante (LH) e progesterona, e o útero e os ovários foram colhidos para estresse morfométrico, histológico e oxidativo avaliações. Os resultados das análises realizadas em machos mostraram que um fotoperíodo de luz constante causou diminuição nos níveis de testosterona, peso do epidídimo e contagem de espermatozóides no epidídimo, diâmetro do túbulo seminífero, número de células de Sertoli e número de espermatozóides normais. Danos histopatológicos também foram observados nos testículos, e alterações estereológicas, no grupo LL. Enquanto os resultados da prole feminina observaram-se uma redução do LH adulto e aumento dos níveis plasmáticos de progesterona, além de lesões uterinas como aumento do número de glândulas endometriais e redução dos níveis de enzimas antioxidantes, como glutationa redutase e glutationa S-transferase. Em conclusão, a exposição à luz constante durante o período gestacional prejudica o sistema reprodutivo da prole tanto masculina quanto feminina na idade adulta.

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