01 - Doutorado - Patologia Experimental
URI Permanente para esta coleção
Navegar
Submissões Recentes
Item A sinalização mediada por HIF-1a como eixo integrador de marcadores moleculares de progressão no carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço(2026-02-27) Trancolin, Luca Kiichi Suzuki; Luiz, Rodrigo Cabral; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Guarnier, Flávia Alessandra; Vitiello, Glauco Akelinghton Freire; Oliveira, Karen Brajão deO carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) é uma neoplasia maligna caracterizada por um microambiente tumoral hipóxico, que favorece a progressão da doença. A sinalização mediada pelo fator induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-1a) regula vias envolvidas na angiogênese, na transição epitélio-mesenquimal (TEM) e no remodelamento da matriz extracelular (MEC). Embora a hipóxia esteja associada a progressão do câncer em diferentes tipos tumorais, a integração desses processos no contexto do HNSCC ainda permanece pouco compreendida, ressaltando a importância da investigação da expressão de HIF1A e de sua associação com marcadores da progressão e da biologia tumoral. Esta tese teve como objetivo avaliar a expressão de HIF1A e sua correlação com genes relacionados à angiogênese, à TEM e ao remodelamento da MEC em tumores de pacientes com HNSCC. Foram incluídos 44 pacientes com HNSCC, com coleta de fragmentos tumorais e de margens cirúrgicas livres de câncer (CFSM). A expressão gênica de HIF1A, VEGFA, CD44, VIM, COL1A1, P4HA1 e MMP1 foi avaliada por RT-qPCR. A presença proteica de HIF-1a foi analisada por imunohistoquímica, enquanto a arquitetura do colágeno foi avaliada por microscopia de geração de segundo harmônico (SHG). HNSCC apresentou aumento significativo na expressão de HIF1A (p = 0,038) e VEGFA (p = 0,033) em relação ao grupo CFSM, enquanto VIM (p = 0,052) e CD44 (p = 0,368) não diferiram significativamente. A imunohistoquímica revelou correlação positiva entre intensidade de marcação de HIF-1a (Tau = 0,354; p = 0,013) e localização subcelular (Tau = 0,281; p = 0,044) com níveis de expressão de HIF1A. A expressão de HIF1A se correlacionou positivamente com VEGFA (p = 0,0004), VIM (p = 0,011) e CD44 (p = 0,021). A análise do colágeno evidenciou remodelamento estromal, com perda da organização normal, aumento do alinhamento das fibras e heterogeneidade fibrilar em HNSCC. Os genes COL1A1 (p = 0,0043), P4HA1 (p = 0,0047) e MMP1 (p < 0,0001) apresentaram expressão significativamente elevadas em HNSCC em comparação com CFSM, correlacionando-se positivamente com expressão de HIF1A. Tumores HIF1A-high apresentaram maior expressão de COL1A1 (p = 0,0079) e P4HA1 (p = 0,0160) em comparação com HIF1A-low, enquanto MMP1 não apresentou diferença significativa (p = 0,1438). Conclui-se que a hipóxia, através de HIF-1a, em HNSCC está associada ao remodelamento do colágeno no tumor. A expressão elevada de HIF1A relaciona-se ao aumento dos níveis de COL1A1 e P4HA1, indicando que a hipóxia pode coordenar a síntese e a maturação do colágeno. Ademais, observa-se aumento da expressão de HIF1A em tecidos de HNSCC, com correlação positiva com VEGFA, VIM e CD44, sustentando a associação entre hipóxia, angiogênese e TEMItem Atividades analgésica, anti-inflamatória e antioxidante da trans-Chalcona em camundongos: participação dos canais TRPV1, TRPA1 e da via de sinalização NF-kB(2025-06-17) Piva, Maiara; Jr., Waldiceu Verri; Filho, Phileno Pinge; Manchope, Marília Fernandes; Martins, Maria Isabel Lovo; Glauco Akelinghton Freire VitielloResumo: Cerca de 30% da população mundial adulta sofre com condições que causam dor, mas suas opções farmacológicas possuem eficiência limitada e efeitos adversos consideráveis, indicando a necessidade de novas alternativas mais efetivas e seguras. A trans-Chalcona (tC) é um flavonoide de cadeia aberta precursor de outros flavonoides, que possui efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. O objetivo deste trabalho foi investigar o potencial analgésico, anti-inflamatório e antioxidante do flavonoide tC em modelos de estudo de dor e inflamação em camundongos. A tC foi administrada via oral 30 minutos antes dos estímulos. A analgesia foi investigada após estímulo com ácido acético, fenil-p-benzoquinona (PBQ), formalina, adjuvante completo de Freund (CFA), capsaicina, isotiocianato de alila (AITC) e superóxido de potássio (KO2), enquanto os parâmetros inflamatórios foram induzidos pelo KO2, um doador de ânion superóxido. A dor manifesta por contorções abdominais foi induzida por ácido acético, PBQ e KO2, a tC inibiu os três estímulos. A dor manifesta observada pelo tempo lambendo a pata e número de sacudidas foi induzida pela formalina, CFA, capsaicina, AITC e também foi inibida pela tC. A capsaicina é um agonista do canal iônico TRPV1 e o AITC é um agonista de TRPA1, que foram utilizados para demonstrar a capacidade da tC de modular as vias de sinalização induzidas por esses canais, tanto in vivo como in vitro, indicando o mecanismo de ação envolvido na atividade analgésica do flavonoide. A eficácia da tC na inibição da dor e inflamação induzidas pelo ânion superóxido foi demonstrada através da inibição das citocinas IL-1b TNF-a, IL-33, IL-6 e da via de sinalização NF-kB. A tC também inibiu o estresse oxidativo, ação observada pelo aumento na produção de antioxidantes, redução na produção de ânion superóxido e peroxidação lipídica, devido, pelo menos parcialmente, à regulação positiva da expressão de Nrf2 e à regulação negativa da expressão de Gp91phox e Cox-2. A tC também preveniu a sensibilização dos neurônios nociceptivos TRPV1+ e TRPA1+ pelo ânion superóxido. Desta forma, a tC demonstrou-se eficaz como analgésico, anti-inflamatório e antioxidante com efeito multialvos em camundongosItem Beta-bloqueador carvedilol tem efeito citotóxico e induz estresse oxidativo em células de melanoma murino (B16-F10)(2024-08-29) Silva, Isabela Chagas; Luiz, Rodrigo Cabral; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Guarnier, Flávia Alessandra; Souza Neto, Fernando Pinheiro de; Juliani, Larissa SanchesOs ß-bloqueadores são medicamentos utilizados no tratamento de hipertensão arterial e doenças cardiovasculares. Por conta da relação dos receptores beta (ß-AR) com a proliferação celular, esta classe farmacológica tem sido alvo de estudo no câncer. O atenolol, propranolol e carvedilol (CAR) são exemplos de ß-bloqueadores e seu principal mecanismo de ação é inibir a ação das catecolaminas, diminuindo a concentração de cAMP e consequentemente o estímulo da proliferação. O melanoma está no terceiro lugar em incidência entre os cânceres de pele e é o subtipo com pior prognóstico. Devido a sua agressividade é de suma importância a identificação de novos compostos para o seu tratamento. Por este motivo, os ß-bloqueadores precisam ser mais bem estudados neste tipo de câncer. Neste trabalho avaliamos o efeito citotóxico dos ß-bloqueadores destacando a atividade do CAR, o envolvimento do estresse oxidativo como possível mecanismo de ação. Para o melanoma utilizamos a linhagem de melanoma murino (B16-F10). Nesse estudo, as células B16-F10 e NIH-3T3 foram tratadas com CAR (1 a 50 µM), propranolol e atenolol (50 a 400 µM) durante 24 horas. Foram realizados os testes de viabilidade celular, parada de ciclo, diferenciação do tipo de morte, parâmetros de estresse oxidativo e imunocitoquímica. Dentre os três ß-bloqueadores utilizados, o CAR se demonstrou mais eficiente, causando diminuição da viabilidade de ambas as células em concentrações acima de 20 µM, inibição da formação de colônias, lesão e hiperpolarização mitocondrial, parada de ciclo celular na fase G0/G1, apoptose, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, alterações na produção de glutationa e aumento da marcação nuclear de 8-OHdG e Nrf2. Esses dados demonstram que mesmo que o CAR seja considerado uma molécula antioxidante, ele tem capacidade de gerar estresse oxidativo, causando diminuição da viabilidade celular, lesão mitocondrial, parada de ciclo e apoptose. Mais estudos são necessários para melhor elucidar a relação do CAR com estresse oxidativo. No entanto, esses dados demonstram que ele tem potencial para se tornar uma noda droga antitumoral, especialmente para o melanomaItem Biofilme, imunopatogênese e abordagens terapêuticas na infecção por Arthrographis kalrae: caracterização em modelos in vitro e de infecção sistêmica(2026-04-30) Souza, Bianca Dorana de Oliveira; Itano, Eiko Nakagawa; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Ramos, Solange de Paula; Suguiura, Igor Massahiro de Souza; Venâncio, Emerson José; Ono, Mário AugustoArthrographis kalrae é um patógeno oportunista emergente com reconhecido potencial neurotrópico e angioinvasivo. Apesar de sua relevância clínica, pouco se sabe sobre o papel da formação de biofilmes e dos antígenos solúveis derivados dessas estruturas nas interações patógeno-hospedeiro. Além disso, o diagnóstico e o tratamento da infecção por A. kalrae permanecem como desafios clínicos. Este estudo teve como objetivos caracterizar a formação de biofilme e o perfil de seus antígenos solúveis in vitro, descrever a patogênese da infecção sistêmica em modelo murino e avaliar a eficácia terapêutica dos antifúngicos itraconazol e terbinafina. A formação de biofilme por A. kalrae foi caracterizada por meio da quantificação de biomassa (cristal violeta) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Macrófagos RAW 264.7 foram expostos a células planctônicas ou associadas ao biofilme, bem como a antígenos livres de células (CFA). Ambas as formas de crescimento reduziram a viabilidade dos macrófagos e inibiram significativamente a produção de óxido nítrico (NO) e interleucina-6 (IL-6) induzida por lipopolissacarídeos (LPS) (p < 0.0001). Observou-se um efeito inibitório na produção de NO mais pronunciado nas células e CFA derivados de biofilme, os quais também exibiram maior citotoxicidade em macrófagos não ativados (p < 0.05). A análise de biofilmes demonstrou um aumento progressivo na biomassa, nas estruturas características de biofilme e por immunoblotting na reatividade antigênica e enriquecimento de componentes de alta massa molecular durante a maturação do biofilme (48 - 144 h). Paralelamente, na etapa in vivo, camundongos BALB/c foram infectados por via intravenosa, tratados ou não e monitorados quanto a sinais clínicos, carga fúngica tecidual (unidade formadora de colônia - UFC), alterações histopatológicas, antigenemia e resposta imune humoral. Os resultados demonstraram que 30% dos animais do grupo controle infectado/não tratado desenvolveram uma síndrome neurológica caracterizada por tremores, ataxia, inclinação cefálica, giros e andar em círculos. Colônias viáveis foram recuperadas da maioria dos órgãos avaliados (cérebro, rim, fígado, baço), com exceção dos pulmões, evidenciando o tropismo sistêmico do fungo. O tratamento com terbinafina (75 mg/kg) preveniu totalmente o surgimento de sinais neurológicos graves e evitou a perda de peso, enquanto o itraconazol (50 mg/kg) reduziu a incidência da síndrome de 30% para 11.1%. A terbinafina também promoveu uma redução significativa da carga fúngica no fígado e baço (p < 0,05) em comparação ao grupo controle, eficácia não atingida pelo itraconazol. A histopatologia cerebral do grupo controle infectado/não tratado revelou meningoencefalite multifocal com infiltrados inflamatórios nas regiões meníngea, cortical, talâmica e hipotalâmica. Nessas regiões, foram detectadas alterações como microabscessos, manguitos perivasculares e início de gliose. Camundongos tratados com terbinafina apresentaram proteção neural superior, com apenas infiltrados inflamatórios leves e localizados, enquanto o grupo itraconazol exibiu manguitos perivasculares moderados e gliose persistente. Ambos os fármacos reduziram os níveis de antígenos circulantes (antigenemia) (p < 0.05); no entanto, apenas o tratamento com terbinafina resultou na diminuição dos níveis de anticorpos IgG específicos (p < 0.05). Adicionalmente, a presença de antígenos foi detectada na urina dos camundongos infectados. Em conclusão, a formação de biofilme por A. kalrae induz alterações qualitativas e quantitativas na produção de antígenos, potencializando tanto os efeitos citotóxicos quanto os imunomoduladores. Os achados confirmam a agressividade neurotrópica do patógeno e demonstram que a antigenemia e a resposta humoral são biomarcadores sensíveis para o monitoramento da eficácia antifúngica. A terbinafina surge como uma estratégia terapêutica superior neste modelo de micose sistêmica neuroinvasiva.Item Exposição materna oral ao cyantraniliprole durante os períodos gestacional e lactacional altera o sistema reprodutor feminino e masculino da prole púbere e adulta de ratos Wistar(2024-01-31) Menezes, Ana Camila Ferreira de; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Ceravolo, Graziela Scalianti; Gomes, Gislaine Garcia Pelosi; Guerra, Marina Trevizan; Oliveira, Karen Brajão deDesde 2008 o Brasil vem sendo o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, tendo vários casos de intoxicação notificados. Dentre os vários efeitos colaterais que podem ser causados devido exposição crônica a essas substâncias podemos destacar a infertilidade, a impotência sexual, abortos e malformações, neurotoxicidade, alterações hormonais e maior risco de câncer. O cyantraniliprole surgiu como uma proposta de nova moléculas inseticidas menos nociva. Esse tóxico possui modo de ação sistêmico, atuando por ingestão e contato, através da ativação dos receptores de rianodina, ocasionando uma massiva liberação de cálcio. De acordo com a bula do produto registrada no Ministéria da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), não apresenta toxicidade aguda significante pelas vias de exposição oral, dérmica e inalatória para mamíferos. Porém, por ser uma substância nova, não há estudos na literatura sobre os efeitos a longo prazo na saúde de humanos e outros mamíferos. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi avaliar se a exposição ao cyantraniliprole durante os períodos gestacional e lactacional podem trazer prejuízos para o desenvolvimento do sistema reprodutor feminino e masculino da prole de ratos Wistar. Para isso, ratas Wistar foram colocadas para acasalar e ao diagnóstico de prenhez foram divididas nos grupos experimentais: Controle (C), Cyantraniliprole 1 mg/kg/dia (C1), Cyantraniliprole 10 mg/dia (C10) e Cyantraniliprole 150 mg/kg/dia (C150). O presente trabalho foi aprovado pela CEUA-UEL, ofício 20/2020. Foram avaliados os parâmetros gestacionais, o comportamento materno e o desenvolvimento físico da prole ao nascer. Após atingirem a puberdade e a idade adulta, foram feitas as eutanásias e foram coletados os úteros e os ovários das fêmeas para análise histológica e bioquímica de estresse oxidativo, e os testículos e epidídimos dos machos para análise histopatológica. Os dados obtidos foram analisados quanto normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e posteriormente através de ANOVA com teste de Tukey a posteriori. Foi utilizado o nível de significância de 5%. Foi possível verificar que a dose de 150 mg/kg/dia é inviável para esse delineamento experimental. A análise do comportamento materno com perturbação mostrou que a mãe apresenta maior contato com os filhotes, menor tempo de autolimpeza e de limpeza dos filhotes nos grupos C1 e C10, e no grupo C10 as mães ainda apresentaram maior tempo amamentando e menor tempo sem interação com os filhotes. As análises histológica e de estresse oxidativo dos ovários das fêmeas púberes e adultas não indicaram alterações em nenhum dos grupos e nenhuma das idades. Já a análise dos úteros indicou alteração estrutural, A análise de morfometria uterina indicou um espessamento do perimétrio dos animais de ambas as idades, nos grupos C1 e C10 quando comparados com o controle. Já na análise do miométrio foi possível observar um espessamento apenas nos animais púberes do grupo C1 e nos animais adultos do grupo C10, quando comparados os dados ao controle. O endométrio apresentou espessamento nos animais púberes dados grupos C1 e C10 comparados ao controle, enquanto os adultos não apresentaram alteração significativa. Dessa forma é possível concluir que a ingestão de cyantraniliprole pelas mães durante prenhez e lactação é capaz de alterar o desenvolvimento uterino e pós-natal da prole, alterando a estrutura e a bioquímica do útero de ratas púberes e adultasItem Análise da associação dos polimorfismos genéticos rs11568821, rs2227882, rs2227981 e rs10204525 gene PDCD1 e suas estruturas haplotípicas na imunopatogênese da covid-19(2025-04-25) Moretto, Sarah Lott; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi; Galhardi, Lígia Carla Faccin; Serpeloni, Juliana Mara; Vitiello, Glauco Akelinghton FreireA COVID-19, causada pelo vírus SARS-CoV-2, pode causar infecções assintomáticas ou se manifestar com sintomas leves a graves. Esse amplo espectro sintomático pode ser explicado pelo intenso desequilíbrio na produção de citocinas pró- e anti-inflamatórias em pacientes com doença grave (“tempestade de citocinas”). A proteína de morte celular programada 1 (PD-1), expressa principalmente por linfócitos T, faz parte de um importante ponto de checagem da resposta imune efetora. Dentro deste contexto, o presente estudo teve por objetivo produzir um artigo de revisão bibliográfica sobre o eixo PD-1/PD-L1 em infecções virais e identificar variantes genéticas (SNPs) dos genes PDCD1 e CD274 já estudadas neste contexto, além de analisar as variantes genéticas rs11568821, rs2227982, rs2227981 e rs10204525 do gene PDCD1 em pacientes com COVID-19 leve, moderada e grave. Foi possível constatar, através do artigo de revisão, que existem somente dois estudos realizados em COVID-19 no que se refere a SNPs do gene PDCD1. Ademais, observamos que a maioria dos estudos que avaliam variantes genéticas do eixo PD-1/PD-L1 é feita em infecções pelos vírus HBV e HCV. O gene PDCD1 é mais investigado em relação a infecções virais do que o gene CD274, codificante para o PD-L1. Foram encontrados mais de 20 estudos com variantes no gene PDCD1, em comparação aos 5 estudos encontrados para o gene CD274. As infecções virais avaliadas foram semelhantes para ambos os genes, sendo elas infecções por citomegalovírus (CMV), vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), vírus da hepatite B (HBV) e C (HCV), vírus linfotrópico T humano tipo 1 (HTLV-1) e coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), sendo o gene CD274 avaliado somente nas últimas 4 infecções. Futuras investigações são necessárias para elucidar a influência de cara variante na expressão e função das proteínas PD-1 e PD-L1 no contexto de infecções virais crônicas e agudas. Prosseguindo com o artigo experimental, este foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo seres humanos da Universidade Estadual de Londrina (CAAE 36247920.1.0000.5231). Os parâmetros sociodemográficos, comorbidades, assim como os sintomas mais comuns dos pacientes, foram analisados com relação à gravidade e desfecho da doença, a fim de se buscar potenciais marcadores de prognóstico para COVID-19. Trata-se de um estudo tipo caso-caso, em que pacientes com COVID-19 leve foram considerados controles, e pacientes com sintomas moderados e graves foram considerados grupo caso. As variantes genéticas foram avaliadas utilizando-se a técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR). A análise de associação dos polimorfismos genéticos indicou que os genótipos do SNP rs2227982 GA e AA (p=0.047) e alelo A (p=0.023) apresentaram diferença significativa na distribuição entre os grupos estudados. O alelo T do SNP rs11568821 (p=0.049) também teve diferença significativa na frequência entre o grupo de referência e os grupos casos. A análise de regressão logística multinomial identificou uma associação entre os modelos hereditários dominante (OR=2,657, IC=1,315-5,367, p=0,006) e superdominante (OR=2,411, IC=1,169-4,973, p=0,017) do rs2227982 e a COVID-19 moderada. Também encontramos uma associação entre o genótipo AA do rs2227981 sob o modelo genotípico (OR=2,172, IC=1,129-4,178, p=0,020) e o modelo recessivo (OR=1,904, IC=1,090-3,327, p=0,024) e a COVID-19 grave. Os modelos hereditários genotípicos para o genótipo CT (OR=1,825, IC=1,118-2,980, p=0,016), dominante (OR=1,707, IC=1,066-2,733, p=0,026) e superdominante (OR=1,816, IC=1,121-2,942, p=0,015) de rs10204525 mostraram correlação com a COVID-19 grave. Não foi observada nenhuma associação entre o polimorfismo rs11568821 e a gravidade da COVID-19, bem como com o desfecho da doença. A análise de inferência de haplótipos resultou em 12 haplótipos recorrentes na população estudada, sendo que suas distribuições entre os grupos foram significativamente diferentes (leve vs moderado: p=0.02; leve vs grave: p=0.02). Entretanto, nenhum modelo de hereditariedade dos cinco haplótipos mais frequentes se mostrou significativo na análise de associação com a gravidade e sobrevida dos pacientes com COVID-19. Este estudo se destaca por ser o primeiro a avaliar o SNP rs2227982 em pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 e acometidos pela COVID-19. Os achados sobre os polimorfismos rs2227982, rs2227981 e rs10204525 contribuem para a busca por biomarcadores relacionados à COVID-19, enfatizando a importância de estudos multi-populacionais para a compreensão de como fatores genéticos podem influenciar na patogênese e desfecho da doença. Contudo, nossos resultados indicam que embora envolvidos na imunopatogênese da COVID-19, esses SNVs não estão independentemente associados à gravidade da doença ou mesmo à sobrevida dos indivíduosItem 3,3’,5,5’-Tetrametoxibifenil-4,4’-diol induz apoptose e potencializa a citotoxicidade de doxorrubicina via estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e autofagia em linhagens de câncer de mama triplo negativo(2026-02-06) Inoue, Fabricio Seidy Ribeiro; Pavanelli, Wander Rogério; Guarnier, Flávia Alessandra; Seiva, Fábio Rodrigues Ferreira; Bidóia, Danielle Lazarin; Mantovani, Mário Sérgio; Panis, CarolinaO câncer de mama triplo negativo (CMTN) é o subtipo mais agressivo e metastático, caracterizado por alta instabilidade genômica, mutações em TP53, dependência de CDK1 para progressão do ciclo celular e estresse oxidativo elevado. O 3,3’,5,5’-tetrametoxibifenil-4,4’-diol (TMBP) demonstrou, por meio de análises de docking molecular, interação com CDK1 no sítio inibitório Tyr15, redução da expressão de CDK1 e seletividade para células tumorais TP53 mutantes. Neste trabalho, investigamos o perfil transcriptômico e os processos biológicos modulados pelo TMBP, bem como seus efeitos antitumorais isolado e em combinação com doxorrubicina (DOX) em linhagens de CMTN. A atividade metabólica celular (resazurina) foi utilizada para determinar os valores da concentração inibitória de 50% (IC50) nas linhagens HB4a (não tumoral), MDA-MB-231 e MDA-MB-468. Na etapa transcriptômica, as células MDA-MB-231 tratadas com TMBP foram analisadas por microarranjo (Affymetrix Human GeneChip 1.0 ST), identificando genes diferencialmente expressos (DEGs) e vias biológicas enriquecidas. Esses achados foram validados por ensaios de apoptose, atividade de caspase-3/7 e ensaio de migração. Em seguida, as três linhagens foram tratadas com combinações TMBP+DOX e avaliadas por modelagem de sinergismo (ZIP), ensaio do cometa, ciclo celular, apoptose, ERO, ??m, gotículas lipídicas e organelas vesiculares ácidas, atividade de caspase-3/7, quantificação de vacúolos autofágicos e análises bioquímicas para marcadores de estresse oxidativo. O tratamento com TMBP em células MDA-MB-231 resultou em 108 DEGs associados à apoptose, via TGF-ß/SMAD e reconhecimento/reparo de DNA, além de aumento de apoptose, ativação de caspase-3/7 e redução da migração celular. O tratamento combinado (TMBP+DOX) apresentou efeitos citotóxicos aditivos a sinérgicos seletivamente nas células de CMTN, preservando a viabilidade das células não tumorais. Mecanisticamente, a associação potencializou a parada do ciclo celular em G1, potencializou a morte celular por apoptose, promoveu maior acúmulo de ERO e disfunção mitocondrial, evidenciada pela perda do ??m e danos ultraestruturais. O tratamento induziu autofagia e elucidou seu papel citóxico no processo de morte celular. A depleção de defesas antioxidantes causadas pelo tratamento, incluindo SOD, GPx e GSH, revelou colapso redox, particularmente em células MDA-MB-231, destacando a suscetibilidade específica desse subtipo ao estresse oxidativo. Em conjunto, os dois estudos demonstram que o TMBP apresenta potente atividade antitumoral, isolado ou associado à DOX, reforçando o TMBP como um candidato terapêutico promissor para terapias direcionadas ao CMTN e outros tumores que compartilham de vulnerabilidades similares.Item Investigação sorológica e molecular da paracoccidioidomicose humana e animal sob a perspectiva da nova classificação taxonômica das espécies de Paracoccidioides(2025-05-16) Suguiura, Igor Massahiro de Souza; Ono, Mário Augusto; Itano, Eiko Nakagawa; Cotica, Érika Séki Kioshima; Vilas-Boas, Laurival Antônio; Baeza, Lilian CristianeA paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença causada pelos patógenos cultiváveis do gênero Paracoccidioides. A reclassificação taxonômica baseada em análises moleculares desse grupo resultou na definição de cinco espécies distintas: P. brasiliensis sensu stricto, P. restrepiensis, P. venezuelensis, P. americana e P. lutzii. Essa nova classificação abriu diversas lacunas no entendimento da micose. Neste estudo, investigamos o panorama atual da PCM em uma região hiperendêmica para a doença, o estado do Paraná, através da análise das notificações oficiais do estado (Capítulo I). Observamos que a PCM apresentou mortalidade superior a outras micoses, demora no diagnóstico e importante subnotificação. Além dos seres humanos, a doença também afeta animais domésticos e silvestres, porém com poucos registros da sua ocorrência na literatura. Considerando a importância epidemiológica local, utilizamos além dos métodos tradicionais, novos métodos para diagnosticar um caso atípico de PCM canina (Capítulo II). Nesse contexto, devido a necessidade do uso de métodos moleculares na identificação desses patógenos, tanto em humanos como em animais, propusemos uma nested PCR para amplificação parcial do gene de alfa tubulina (TUB1) diretamente de amostras biológicas. Utilizamos os produtos dessa reação em técnicas capazes de identificar a maioria das espécies de Paracoccidioides, com ou sem o uso de sequenciamento (Capítulo III). A nested PCR também se mostrou eficaz na amplificação de TUB1 em espécies não cultiváveis do gênero, como Paracoccidioides ceti, agente da paracoccidioidomicose ceti (PCM-C), micose que acomete cetáceos (Capítulo IV). Através da nested PCR foi possível diagnosticar dois casos de PCM-C em golfinhos brasileiros e ainda investigar as diferenças genéticas no grupo a partir da utilização de TUB1. Além da identificação molecular, os métodos sorológicos são amplamente utilizados no diagnóstico da PCM. Dependendo do método empregado, observam-se diferenças significativas nos resultados, de acordo com as espécies de fungos que infectam os pacientes, e o isolado utilizado para a produção dos antígenos. Assim, revisamos a diferenciação sorológica entre as espécies cultiváveis de Paracoccidioides, adotando uma nova abordagem (Capítulo V). Utilizamos diversos isolados dos fungos em infecção experimental murina para avaliar o reconhecimento antigênico, tanto homólogo quanto heterólogo, por meio de ELISA e immunoblotting, nas versões tradicional e por avidez. Foi observado que os antígenos são bastante conservados entre as espécies cultiváveis de Paracoccidioides, não sendo observadas variações consistentes entre elas. Apesar das variações do reconhecimento antigênico entre isolados foi observado, que dentre os antígenos, o de 70 kDa foi reconhecido com maior avidez. Em conclusão, os dados apresentados neste trabalho reforçam a importância da PCM no cenário atual, além de fornecer uma abordagem atualizada com novas metodologias aplicáveis tanto para os agentes cultiváveis quanto não cultiváveis de ParacoccidioidesItem Trans-chalcona e calcipotriol na esquistossomose mansônica: avaliação dos efeitos antiparasitário e antifibrótico(2025-08-29) Detoni, Mariana Barbosa; Costa, Ivete Conchon; Costa, Idessania Nazareth; Pereira, Maria Isabel Lovo Martins Busch; Bosqui, Larissa Rodrigues; Caldas, Lizandra Guidi Magalhães; Pavanelli, Wander RogérioA esquistossomose é uma doença parasitária causada por trematódeos do gênero Schistosoma, cujas formas adultas habitam os vasos portais e mesentéricos do ser humano e as formas intermediárias se desenvolvem em moluscos gastrópodes. A fase aguda pode ser assintomática ou apresentar manifestações como febre, dor de cabeça e calafrios, podendo evoluir para a fase crônica, caracterizada por formação de inúmeros granulomas hepáticos ao redor dos ovos depositados nos tecidos, levando a fibrose, hipertensão portal e consequente morbidade. O tratamento baseia-se no uso do praziquantel (PZQ, pirazino-isoquinolina), eficiente apenas contra os vermes adultos. Assim, apesar de sua eficácia, apresenta limitação contra formas juvenis e na resposta granulomatosa, além de risco iminente de surgimento de cepas resistentes. Tendo em vista a magnitude de sua prevalência, a severidade das formas clínicas e ineficiência do tratamento contra formas imaturas e em casos crônicos, torna-se necessário a busca por novas alternativas terapêuticas. Neste contexto, o presente trabalho avaliou os efeitos da trans-Chalcona (TC), um flavonoide natural com amplo espectro de atividade biológica, e do calcipotriol (CP), um análogo sintético da vitamina D com propriedades antifibróticas, no contexto da esquistossomose experimental. In vitro TC demonstrou atividade esquistossomicida, principalmente contra formas juvenis de Schistosoma mansoni, induzindo alterações nos níveis de óxido nítrico, despolarização da membrana mitocondrial, danos ao tegumento e perda da integridade da membrana celular, comprometendo a oviposição. Em modelo murino de esquistossomose, o tratamento com TC reduziu a carga parasitária e o tamanho dos granulomas, promovendo regulação do perfil inflamatório. Além disso, TC apresentou baixa toxicidade em células saudáveis, reforçando seu potencial como agente terapêutico seguro e eficaz. CP, por sua vez, foi avaliado quanto à capacidade hepatoprotetora no modelo experimental. Embora não tenha apresentado ação direta sobre a carga parasitária, o tratamento com CP foi capaz de reduzir o estresse oxidativo e o infiltrado inflamatório hepático, resultando em diminuição dos granulomas e da deposição de colágeno. CP também demonstrou eficácia na modulação do perfil oxidativo em células estreladas hepáticas, com efeitos superiores ao PZQ. Os resultados obtidos indicam que TC possui potencial aplicação como fármaco esquistossomicida, enquanto o CP pode representar uma importante estratégia adjuvante para a proteção hepática em casos graves de esquistossomose. Em conjunto, os dados reforçam a importância do desenvolvimento de terapias combinadas ou complementares, capazes de atuar simultaneamente sobre S. mansoni e sobre os danos induzidos no hospedeiro, contribuindo para um tratamento mais eficaz e abrangente da esquistossomoseItem Consequências da administração de dimesilato de lisdexanfetamina sobre o desenvolvimento pós natal do sistema genital masculino de ratos wistar(2024-02-16) Santos, Dayane Priscila dos; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Araújo, Eduardo José de Almeida; Andrade, Fábio Goulart de; Martins-Pinge, Marli CardosoO transtorno do Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) é caracterizado por excessiva desatenção, desorganização ou hiperatividade/impulsividade. Esses sintomas iniciam-se na infância produzindo prejuízos pessoais, sociais e acadêmicos. Para melhorar a qualidade de vida dos pacientes, medicamentos neuroestimulantes são recomendados. Dentre eles, encontra-se o dimesilato de lisdexanfetamina (LDX), um inibidor da recaptação de noradrenalina e dopamina prescrito para pacientes a partir dos 6 anos de idade. Nessa fase o sistema genital masculino não está completamente desenvolvido e o aumento da estimulação catecolaminérgica nos órgãos genitais poderia prejudicar seu desenvolvimento e funcionalidade. Esse estudo objetivou avaliar, em modelo animal, os efeitos da administração de LDX durante o período de desenvolvimento pós-natal do testículo e epidídimo e verificar se esses efeitos perduram até a vida adulta. Oitenta ratos Wistar foram divididos nos grupos experimentais controle imediato (C-I), LDX imediato (LDX-I), controle tardio (C-T) e LDX tardio (LDX-T). Os grupos LDX-I e LDX-T receberam 11,3 mg/kg/dia de LDX diluído em 500 µL de salina a 0,9% diariamente via gavagem do dia pós-natal (DPN)25 ao DPN65. Após o período de tratamento os grupos C-I e LDX-I foram eutanasiados no DPN66 e os grupos C-T e LDX-T permaneceram no biotério por um tempo de recuperação de 65 dias recebendo ração e água ad libidum até a data de sua eutanásia no DPN131. Os testículos foram utilizados para determinação da produção diária de espermatozoides (PDE), análises histopatológicas, morfométricas e de estresse oxidativo. Os epidídimos foram utilizados para análise de estresse oxidativo, estereologia, morfologia, histopatologia e determinação do tempo de trânsito espermático (TTE). Espermatozoides foram avaliados quanto a morfologia, integridade do acrossôma, atividade mitocondrial e motilidade. A testosterona foi determinada no plasma. Nos testículos, o LDX induziu hipoplasia de células de Leydig e consequente redução dos níveis plasmáticos de testosterona no grupo LDX-I. A baixa disponibilidade de testosterona neste grupo favoreceu o desprendimento de células imaturas do epitélio germinativo, culminando em aumento do percentual de túbulos seminíferos contendo vacúolos no epitélio e células imaturas na luz. Esses fatores contribuíram para redução da altura do epitélio germinativo, do diâmetro dos túbulos seminíferos e da PDE. O grupo LDX-T evidenciou que a hipoplasia de células de Leydig permanece após a interrupção do tratamento, causando atrofia gonadal e persistência da testosterona plasmática reduzida. Consequentemente, houve persistência do desprendimento de células imaturas do epitélio germinativo e da redução da altura do epitélio germinativo e da PDE nos animais adultos. No epidídimo, a administração de LDX gerou hipoplasia de células basais e retardou a expansão do ducto epididimário na região de cauda dos grupos LDX-I e LDX-T. O grupo LDX-I apresentou aceleração do TTE pelo epidídimo e redução na atividade de glutationa-S-transferase na região de cauda resultando em redução da atividade mitocondrial e motilidade espermática. Após a interrupção do tratamento o TTE foi reestabelecido no grupo LDX-T, mas a atividade da glutationa S-transferase na cauda se manteve reduzida levando ao aumento da peroxidação lipídica nessa região e persistência da redução da atividade mitocondrial e motilidade nos espermatozoides dos animais adultos. Em conclusão, esses resultados demonstram que a administração de LDX retarda o desenvolvimento pós-natal dos testículos e da cauda do epidídimo, levando a alterações irreversíveis na morfologia e funcionalidade desses órgãosItem Atividade antitumoral do 3,3',5,5'-tetrametoxibifeenil-4,4'-diol e trilobolido-6-O-isobutirato em um modelo experimental in vitro em células A549 e NCI-H460: explorando os efeitos metabólicos e os mecanismos de ação(2023-10-20) Concato-Lopes, Virgínia Márcia; Pavanelli, Wander Rogério; Kwasniewski, Fábio Henrique; Mantovani, Mário Sérgio; Bidoia, Danielle Lazarin; Providello, Maiara Voltarelli; Mantovani, Mário SérgioO câncer de pulmão, uma doença crônica e heterogênea, é a principal causa de morte relacionada ao câncer mundialmente. Apesar da disponibilidade de diversas opções terapêuticas, sua eficácia continua limitada, frequentemente acompanhada de alta toxicidade, efeitos colaterais significativos, além de resistência medicamentosa que as células cancerígenas desenvolvem. O composto fenólico 3,3',5,5'-tetrametoxibifenil-4,4'-diol (TMBP), obtido por meio da biotransformação do 2,6-dimetoxifenol, mediada por lacase fungica, e a lactona sesquiterpênica extraída de Sphagneticola trilobata, trilobolide-6-O-isobutirato (TBB), demonstraram na literatura efeitos leishmanicida, antitumorais e imunomoduladores. No entanto, seus mecanismos de ação em câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) não foram investigadas. Neste estudo, avaliamos o efeito antitumoral in vitro do TMBP e do TBB nas linhagens A549 e NCI-H460, elucidando os mecanismos indutores de morte celular. O tratamento com TMBP (12,5-200 µM) sobre as células NCI-H460 resultou na redução da proliferação em 24, 48 e 72 h. O IC50 (154 µM) foi obtido e utilizado para os demais experimentos. Após 24 h de exposição, o tratamento com IC50, induziu diversas alterações morfológicas e ultraestruturais nas células NCI-H460, reduziu a migração e a marcação de N-caderina e ß-catenina por imunofluorescência, aumento de espécies reativas de oxigênio (ERO) e óxido nítrico (ON), juntamente com a diminuição dos radicais ânion superóxido e atividade reduzida da glutationa redutase (GSH). Além disso, o TMBP induziu estresse metabólico, evidenciado pela redução da captação de glicose, da lactato desidrogenase intracelular e dos níveis de lactato. Outros efeitos observados incluíram a despolarização mitocondrial, aumento na formação de gotículas lipídicas e a presença de vacúolos autofágicos. Notavelmente, o TMBP induziu a parada do ciclo celular na fase G2/M e a morte celular semelhante a apoptose, conforme indicado pelo aumento da atividade da caspase-3/7 e pela redução da marcação de STAT-3 por imunofluorescência. O impacto antitumoral do TMBP foi acompanhado por uma redução nos níveis proteicos de PI3K, AKT, ARG-1 e NF-?B, juntamente com um aumento de iNOS. Em relação ao tratamento com TBB, as previsões in silico revelaram um potencial promissor de similaridade com medicamentos para o composto, indicando alta biodisponibilidade oral e eficiente absorção intestinal. O tratamento in vitro, sob células humanas A549 e NCI-H460 (12-100 µM) reduziu a viabilidade celular, obtendo valores de IC50 de 73 e 54 µM para A549 e NCI-H460, respectivamente, os quais foram usados nas experimentações seguintes. Após a exposição ao tratamento com IC50 de 73 e 54 µM, as células apresentaram alterações morfológicas e estruturais, capacidade migratória reduzida e aumento do estresse oxidativo, caracterizado pelo aumento nos níveis de ERO, radicais ânion superóxido e ON, juntamente com uma redução nos marcadores antioxidantes chave, como superóxido dismutase e GSH. Encontramos também estresse celular induzido pelo TBB após tratamento, o qual resultou em mudanças notáveis no metabolismo celular, levando ao acúmulo de gotículas lipídicas e vacúolos autofágicos, bem como o comprometimento da integridade mitocondrial, um aspecto crucial da função celular. Adicionalmente, o TBB desencadeou uma morte celular semelhante a apoptose por meio da ativação das caspases 3/7. Essas descobertas destacam o grande potencial dos compostos TMBP e TBB como candidatos promissores para estudos futuros, consolidando sua posição como componentes adicionais no desenvolvimento de protótipos de novos medicamentos anticâncerItem Marcadores de estresse oxidativo, inflamação e hipóxia no carcinoma papilífero de tireoide(2025-04-24) Cavalcanti, Liara Freitas; Cecchini, Rubens; Venâncio, Emerson José; Andrade, Fábio Goulart de; Armani, André; Luiz, Rodrigo CabralO carcinoma papilífero de tireoide (CPT) é a neoplasia endócrina mais comum, representando de 80% a 90% dos casos de câncer de tireoide. Apesar do bom prognóstico, alguns casos apresentam risco de recorrência e metástases. Evidências sugerem que a patogênese do CPT está associada a fatores como estresse oxidativo, inflamação crônica e hipóxia, que atuam em sinergia para promover danos celulares, instabilidade genômica e adaptação tumoral ao microambiente. A inflamação, frequentemente exacerbada no contexto de estresse, pode levar a secreção de citocinas e quimiocinas que favorecem a proliferação celular, angiogênese e evasão do sistema imune. Nesse contexto, a hipóxia atua como um fator adicional, levando a adaptação metabólica, angiogênese e resistência celular no microambiente tumoral. Portanto, o presente estudo buscou investigar a presença desses fatores no CPT comparando com neoplasias benignas. Como objetivo secundário, buscou-se relatar um caso atípico da doença para contribuir com a literatura acerca do assunto. Para o primeiro objetivo, duas coortes de pacientes foram analisadas, divididas em dois grupos: benigno e CPT. Na primeira, avaliou-se o estresse oxidativo sistêmico em amostras de plasma (carbonilação de proteínas, peróxido de hidrogênio [H2O2], e tiol total), bem como os níveis de citocinas e quimiocinas Na segunda coorte, o estresse oxidativo (catalase, glutationa reduzida [GSH] e hidroperóxidos de membrana) foi analisado em amostras de tecido tireoidiano normal, benigno e CPT. Além disso, a presença de marcadores de estresse foi analisada nesses tecidos por imunofluorescência (fator induzível por hipóxia 1-alfa [HIF-1a], fator nuclear eritróide 2-related factor 2 [Nrf2] e glutationa peroxidase 3 [GPx3]). Os resultados mostraram que os marcadores de estresse oxidativo na primeira coorte estavam mais elevados no grupo CPT. Contudo, na segunda coorte, não houve diferença significativa entre os grupos. Em relação aos marcadores inflamatórios plasmáticos da primeira coorte, apenas a quimiocina regulada pelo timo e pela ativação (TARC) apresentou níveis plasmáticos mais elevados no grupo benigno, enquanto outras citocinas e quimiocinas não mostraram diferenças significativas entre os grupos. A intensidade de marcação de HIF-1a, Nrf2, e GPx3 foi significativamente mais intensa no grupo PTC da segunda coorte, evidenciando o ambiente de estresse oxidativo nesses tumores. Em conclusão, os achados desse trabalho destacam a importância do estresse oxidativo como potencial marcador para diferenciar tumores benignos do CPT, enquanto o resultado da imunofluorescência ressalta a participação do estresse oxidativo na patogênese dessa doença. Além dos resultados evidenciados nas coortes de pacientes, o presente estudo também contribui com o relato de um caso atípico de carcinoma papilífero de tireoide de variante folicular infiltrativa. O paciente apresentou sinais e sintomas iniciais inespecíficos, evoluindo rapidamente para insuficiência respiratória e parada cardiorrespiratória. A confirmação diagnóstica revelou um tumor invasivo com extensão para estruturas adjacentes. A evolução clínica favorável sugere que, mesmo em casos avançados, intervenções terapêuticas adequadas podem controlar a progressão da doença. Os resultados do primeiro artigo contribuem para uma compreensão mais profunda da interação entre estresse oxidativo, inflamação e progressão tumoral no CPT, fornecendo bases para futuras abordagens terapêuticas e prognósticas. E, por fim, o relato amplia o conhecimento sobre as apresentações clínicas atípicas do CPT, contribuindo para o reconhecimento precoce e manejo clínico mais eficienteItem Análise das variantes rs1800896, rs1800871 e rs1800872 e haplótipos do gene IL10, e sua associação com a gravidade e desfecho da COVID-19(2025-03-17) Oliveira, Janaina Nicolau de; Oliveira, Karen Brajão de; Venâncio, Emerson José; Guembarovski, Roberta Losi; Galhardi, Lígia Carla Faccin; Serpeloni, Juliana MaraGravidade e letalidade são manifestações observadas em parte dos casos de doença do coronavírus-19 (COVID-19), e estão ligadas a fatores como hipercitocinemia, linfopenia e Síndrome Respiratória Aguda Grave (SRAG). Nesse contexto, a IL-10, uma citocina com função imunorreguladora, surgiu como um potencial marcador de gravidade da doença, sendo observada em concentrações elevadas em pacientes com COVID-19. Variações genéticas na região proximal do gene, particularmente variantes de nucleotídeo único (SNVs) como rs1800896 (–1082A>G), rs1800871 (–819C>T) e rs1800872 (–592C>A), juntamente com seus haplótipos GCC, ACC e ATA, estão associadas a diferenças em níveis de IL-10 e suscetibilidade a doenças virais. Embora diversos estudos tenham explorado a relação entre essas variações genéticas e doenças virais, incluindo a COVID-19, os resultados são contraditórios. Desta forma, parte deste estudo foi dedicado a revisar dados da literatura afim de compreender de forma mais abrangente os efeitos destas SNVs e seus haplótipos na produção de IL-10 e em associação com doenças virais. E ainda, este estudo teve como objetivo avaliar a associação desses SNVs e seus haplótipos em pacientes com diagnóstico de COVID-19 em Londrina, Paraná, com a gravidade e os desfechos da doença, visto que nenhum estudo investigou tais associações entre as SNVs e a COVID-19 na população brasileira. Desta forma, este estudo envolveu 367 pacientes selecionados do Hospital Universitário da Universidade Estadual de Londrina (HU-UEL). Os pacientes foram categorizados em grupos denominados leve (n=165), moderado (n=72) e grave (n=130), de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS). O grupo grave foi ainda classificado nos subgrupos recuperado (n=64) e óbito (n=66). A genotipagem dos SNVs foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real com sondas TaqMan. Os haplótipos foram inferidos pelo software PHASE e as análises de associação foram realizadas com teste Qui-quadrado ou regressão logística multinomial. O genótipo GG (1082 A>G) foi independentemente associado aos casos graves de COVID-19 (P=0,038, OR= 2,522, IC 95% 1,053 – 6,038), enquanto o haplótipo GCC em homozigose também foi associado aos casos graves (P=0,037, OR 2,767, IC 95% 1,065 – 7,191). Portanto, este estudo demonstrou que a presença do genótipo GG da SNV 1082 A>G (rs1800896) ou do haplótipo GCC está associada à gravidade da COVID-19 em uma amostragem brasileira.Item Avaliação das respostas biológicas frente à exposição aos nano- e micro-plásticos.(2023-12-08) Brito, Walison Augusto da Silva; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Guarnier, Flávia Alessandra; Perobelli, Juliana Elaine; Marinello, Poliana Camila; Bekeschus, SanderA presença de partículas de nano e micro-plásticos (NMPs) é uma preocupação ambiental e ecológica cada vez maior devido aos seus possíveis impactos negativos sobre a saúde humana. Os seres humanos são expostos diariamente aos NMPs por ingestão, inalação e contato tópico. No entanto, devido às limitações nas metodologias de amostragem, detecção e quantificação da exposição aos NMPs em matrizes biológicas e complexas, os roedores e os modelos de cultura de células são ferramentas importantes para a avaliação toxicológica. Estudos in vitro e in vivo descreveram a bioacumulação, o estresse oxidativo, a inflamação e a perturbação metabólica após a exposição aos NMPs como as principais respostas biológicas. Os NMPs ambientais são difíceis de serem amostrados e identificados, portanto, os NMPs disponíveis comercialmente têm sido amplamente utilizados em estudos toxicológicos. No entanto, esses NMPs geralmente apresentam propriedades físico- químicas homogêneas, diferindo das misturas heterogêneas dos NMPs encontrados no meio ambiente, que apresentam diversos tipos de polímeros, tamanhos e formas. Portanto, é necessário desenvolver novos métodos para produzir NMPs ambientalmente relevantes para servir como materiais de referência para pesquisas toxicológicas e investigar seus possíveis efeitos na saúde humana. Considerando isso, produzimos NMPs de polietileno tereftalato (PET) usando um tratamento de ultrassom em condições alcalinas, adotando algumas modificações ao protocolo convencional. Além disso, nosso estudo teve como objetivo investigar os possíveis efeitos biológicos da exposição aguda de PET NMPs em duas linhas de células humanas, A549 e HaCaT, abordando a inalação e as rotas de exposição humana tópica in vitro. O tratamento por ultrassom em condições alcalinas induziu a degradação do polímero em PET NMPs menores, formando fragmentos heterogêneos em forma e, em geral, semelhanças nas superfícies químicas entre o PET antes e depois da sonicação. Em um sistema aquoso, os PET NMPs apresentaram um tamanho médio de 781 nm, uma suspensão polidispersa e uma carga de superfície negativa. Suspenção monodispersa de poliestireno amino-modificado (PS-NH2) de 55 nm foi utilizado como controle positivo para as análise in vitro. Após a exposição aguda de PET NMPs, o metabolismo das células A549 foi ligeiramente aumentado, enquanto o HaCaT não sofreu alteração. Ambas as linhas celulares interagiram e absorveram PET NMPs, o que foi observado pelo aumento da granularidade celular. Além disso, a viabilidade celular foi reduzida e o aumento da necrose foi observado apenas nas células A549. O aumento da formação de micronúcleos em alta concentração foi observado nas células HaCaT. A exposição aos PET NMPs não foi capaz de alterar os níveis de ERO intracelulares, em contraste com os PS-NH2 NMPs. No entanto, a redução dos níveis de tiois foram observadas somente nas células HaCaT após exposição. Além disso, em alta concentração, os PET NMPs induziram a ativação do Nrf2 em ambas as linhagens celulares. Os PET NMPs induziram diferentes perfis de secreção de citocinas e os principais efeitos observados ocorreram em alta concentração e em citocinas pró-inflamatórias. Assim, ambas as linhagens celulares apresentaram alterações significativas com relação à ativação do NF-?B. Os PET NMPs induziram alterações na morfologia celular apenas nas células HaCaT. Ainda, os marcadores de autofagia (mTOR, ULK1, ATG5 e LC3B) foram afetados de formas diferentes em ambas as linhagens celulares, sendo que marcadores iniciais (mTOR e ULK1) estavam significativamente reduzidos. Curiosamente, as análise de componentes principais revelaram que as alterações relacionadas à autofagia ocorreram independentemente da concentração. Em conclusão, os PET NMPs ambientalmente relevantes produzidos por sonicação foram internalizados pelas linhagens celulares humanas e afetaram de forma diferente as respostas biológicas em relação à linhagem celular.Item Efeitos de uma dieta hiperproteica sobre parâmetros histopatológicos do cólon de camundongos C57BL/6 com Retocolite Ulcerativa induzida por Dextran Sulfato de Sódio (DSS).(2023-04-26) Machado, Camila Cristina Alves; Araújo, Eduardo José de Almeida; Armani, Alessandra L. Cecchini; Sant Ana, Débora de Mello Gonçales; Zanoni, Jacqueline Nelisis; Natali, Maria Raquel MarçalA incidência de Retocolite Ulcerativa (RCU) aumentou nos últimos anos e a tendência é que em países cuja prevalência da doença é alta, o número se estabilize com passar do tempo, enquanto nos demais ele continue aumentando. Frente a isto, é essencial compreender como os diferentes fatores que podem estar relacionados ao seu desenvolvimento e/ou exacerbação, como é o caso da dieta hiperproteica. Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do consumo de uma dieta hiperproteica durante a indução experimental de RCU para o intestino grosso de camundongos C57BL/6. Para isto camundongos C57BL/6 machos foram distribuídos em 4 grupos experimentais: DP (alimentados com dieta padrão); HP (alimentados com dieta hiperproteica); DP/DSS (alimentados com dieta padrão e induzidos a RCU); e, HP/DSS (alimentados com dieta hiperproteica e induzido a RCU). Para indução da RCU experimental, os camundongos forma mantidos em gaiolas com livre acesso à água contendo dextran sulfato de sódio a 3% durante sete dias. A ração hiperproteica continha o dobro de teor proteico que a padrão e a fonte utilizada foi a caseína e a proteína de soja. Foram avaliados o índice de atividade da doença (DAI), trânsito gastrointestinal, análise de fenótipo de fezes e avaliação dos neurônios do plexo mioentérico e submucoso do cólon. Como resultado observou-se que os camundongos que ingeriram a dieta hiperproteica apresentaram sinais clínicos da doença mais intensos e isso resultou em DAI maior quando comparado aos demais grupos. Encurtamento do cólon foi observado em ambos os grupos induzidos a RCU, alimentados com a dieta hiperproteica e com a dieta padrão. O escore histológico entre os grupos DSS também foi semelhante e diferiu em relação aos controles. Todavia, as alterações a nível de sistema nervoso entérico foram mais intensas no cólon distal de camundongos alimentados com a dieta hiperproteica. Foram observadas mudanças numéricas e morfológicas em todas as populações neuronais avaliadas indicando possíveis alterações funcionais. Embora o trânsito gastrointestinal, o peso bruto e o percentual de água nas fezes não tenham diferido entre os grupos experimentais, a expressiva alteração na consistência das fezes e diminuição no número de pellets expelidos por dia pelos camundongos que ingeriram a dieta hiperproteica demonstram que perturbações podem estar ocorrendo no intestino grosso como resultado das alterações no plexo mioentérico e submucoso. Logo, para uma maior compreensão de como a dieta hiperprotéica pode influenciar a saúde dos indivíduos com RCU, a interação entre proteínas da alimentação e sistema nervosos entérico precisa ser mais bem explorada. Todavia, os resultados encontrados destacam que os nutrientes presentes no lúmen intestinal podem modular a atividade dos diferentes componentes presentes na parede intestinal, principalmente em indivíduos com RCU.Item Sepse polimicrobiana na Síndrome metabólica murina: efeitos da aspirina sobre a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), marcadores inflamatórios e parâmetros cardiovasculares.(2025-02-06) Nakama, Raquel Pires; Pinge Filho, Phileno; Verri Junior, Waldiceu Aparecido; Dionísio, Andressa de Freitas Mendes; Ceravolo, Graziela Scalianti; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Martins-Pinge, Marli CardosoA obesidade é um problema de saúde pública, caracterizada pelo acúmulo excessivo de tecido adiposo, e está fortemente associada à síndrome metabólica (SMet), que inclui hipertensão, dislipidemia e resistência à insulina. Outra condição de alta relevância é a sepse, com elevada incidência em unidades de terapia intensiva (UTIs) e alto risco de mortalidade, especialmente em indivíduos obesos. No entanto, dados recentes sugerem um "paradoxo da obesidade", em que a obesidade pode exercer efeitos protetores em infecções críticas, como a sepse. Além disso, o uso prévio de aspirina em doses baixas tem sido associado à redução da morbimortalidade na sepse. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do pré-tratamento com aspirina e da síndrome metabólica em um modelo de sepse severa. Foi utilizado modelo murino de Smet induzido por injeção de glutamato monossódico (4 mg/g) em camundongos Swiss do 1° ao 5° dia de vida. Os animais machos receberam aspirina (40 mg/kg) durante 15 dias antes da indução da sepse, que ocorreu no 75° dia, pelo método de ligadura e punção do ceco (CLP). Foram avaliados parâmetros hematológicos e glicêmicos, indicadores cardiovasculares, além de análises de citocinas, óxido nítrico e lactato plasmático. Neutrófilos da medula óssea foram isolados para investigar a liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). No lavado peritoneal, foram avaliadas a migração leucocitária, os níveis de citocinas inflamatórias, óxido nítrico e a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Observou-se que tanto a SMet quanto o pré-tratamento com aspirina em animais controle, conferiram proteção contra a sepse severa, aumentando a sobrevida dos animais e atenuando alterações características, como hipotensão, hipoglicemia e inflamação exacerbada. Concluímos que a Smet e o pré-tratamento com ASA em animais controle, exercem efeitos que fortalecem o “paradoxo da obesidade” após indução da sepse severa, compartilhando similaridades protetoras sistêmicas e imunoregulatórias Esses achados contribuem para o entendimento da fisiopatologia da sepse e apontam para possíveis estratégias terapêuticas para mitigar seus efeitos deletérios.Item Explorando a terapêutica da resolução do processo inflamatório na artrite gotosa: efeito analgésico da resolvina D1, um mediador lipídico pró-resolução, e do TPPU, um inibidor de epóxido-hidrolase solúvel em camundongos(2022-11-28) Zaninelli, Tiago Henrique; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Ferraz, Camila Rodrigues; Ribeiro, Felipe Almeida de Pinho; Manchope, Marília Fernandes; Fattori, VictorA resolução da inflamação é um processo ativo e altamente regulado por mediadores lipídicos pró-resolução (SPMs). SPMs são lipídeos derivados dos ácidos graxos ômega-3 ou ômega-6, os quais são divididos em quatro principais famílias “lipoxinas, resolvinas, maresinas e protectinas”. Na presente tese, inicialmente buscamos estabelecer uma relação dos níveis de SPMs e as características clínicas de doenças reumáticas. Por meio de um artigo de revisão discutimos a relação entre os níveis endógenos de SPMs e os sinais e sintomas de doenças reumáticas intermitentes, como a artrite reumatoide e gotosa. Baixos níveis de SPMs estão relacionados com uma percepção elevada da dor, por exemplo. Ademais elencamos os estudos pré-clínicos demonstrando os efeitos farmacológicos dos SPMs, e a importância dos SPMs para o monitoramento da eficácia de drogas modificadoras de doenças (DMARDs) que são potentes aliadas no tratamento e controle da progressão de doenças reumáticas. Por fim, vislumbramos quatro possíveis abordagens terapêuticas utilizando SPMs para o tratamento de artrites. Nos demais trabalhos investigamos os efeitos da Resolvina D1 (RvD1) e do inibidor de epóxido-hidrolase solúvel (sEH), TPPU, em um modelo de artrite gotosa induzido por cristais de urato monossódico (MSU, estímulo intra-articular no joelho) em camundongos Swiss. A gota afeta aproximadamente 10% da população mundial e é caracterizada por ataques agudos intercalados por fases assintomáticas. Dor articular excruciante, recrutamento de leucócitos e edema são os principais sintomas, e os mais desafiadores no tratamento. As terapias disponíveis para o tratamento da gota comummente oferecem efeitos colaterais severos, alto custo, e eficácia analgésica limitada em muitos pacientes. Portando além de contribuir na investigação dos efeitos e mecanismos de ação de novos fármacos para modulação dos sinais e sintomas, baseados na literatura atualizamos os mecanismos patofisiológicos da artrite gotosa, assim como as novas perspectivas para o tratamento dessa doença em uma segunda revisão. Em nosso segundo artigo pautamos a discussão na lacuna existente entre uma vasta quantidade de dados pré-clínicos e a medicina translacional, além de revisamos os efeitos benéficos de produtos naturais, drogas com múltiplos alvos e os SPMs como perspectivas futuras no controle da doença. Os dois artigos de revisão reiteram que o papel dos SPMs para doenças reumáticas e a necessidade no desenvolvimento de novas terapias. Portanto para o terceiro artigo, os camundongos foram tratados com RvD1 em dois protocolos experimentais, utilizando duas vias de administração (intraperitoneal [i.p.] e intratecal [i.t.]). A dose e o tempo de pré-tratamento foram selecionados baseado nos dados de redução da hiperalgesia mecânica (versão eletrônica dos filamentos do von Frey) e edema articular (paquímetro). O efeito analgésico da dose de 3 ng (72 horas antes do estímulo) foram confirmados pela distribuição do peso das patas traseiras do animal (ensaio com o Static weight bearing), um método não reflexivo de análise de dor. Dessa forma, a dose de 3 ng e pré-tratamento de 72 horas foram selecionados para os próximos experimentos. Tratamentos com RvD1 local (i.t.) ou sistêmico (i.p.) reduziram o recrutamento de leucócitos (contagem no lavado articular) e os níveis de IL-1? no tecido articular por ELISA. Em cultura de macrófagos derivados da medula óssea, o tratamento in vitro com RvD1 reduziu a fosforilação e translocação do fator de transcrição NF-?B para o núcleo, diminuiu a expressão da molécula adaptadora ASC e a maturação da citocina pró-inflamatória IL-1??avaliados por imunofluorescência e ELISA, respectivamente. Estes resultados demonstram que a RvD1 bloqueia a ativação de macrófagos, que são células chave na fisiopatologia da doença. Além disso, nós demonstramos que o tratamento i.t. com RvD1 reduz a expressão de mRNA para canais iônicos (Trpv1 e Nav1.8) e neuropeptídios (substância P e Cgrp) no gânglio da raiz dorsal (DRG) através do RT-qPCR. RvD1 também reduz a ativação de neurônios peptidergicos (CGRP+) no DRG, e bloqueia a liberação de CGRP in vitro (determinado por EIA, em cultura de neurônios do DRG) e in vivo (por imunofluorescência). Por fim, nós também demonstramos que o CGRP aumenta a fagocitose de cristais de MSU por macrófagos, e consequente aumenta os níveis de IL-1? maturada, fenômenos que são reduzidos com o tratamento com RvD1. Portanto, neste estudo, além de demonstrar o importante efeito farmacológico da RvD1, nós também revelamos um mecanismo neuroimune nunca estudado na artrite gotosa. Em conclusão, nossos achados sugerem que RvD1 é um forte candidato para o controle da dor e inflamação na artrite gotosa, e que a comunicação entre nociceptor e células imunes são também alvo para abordagens terapêuticas. Para o quarto artigo nos propusemos a investigar os efeitos farmacológicos do inibidor de epóxido-hidrolase solúvel (sEH), TPPU, no mesmo modelo experimental. Durante o metabolismo do ácido araquidônico, via citocromo P450, são originados os ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs) que exercem atividade protetiva e são moléculas precursoras na geração de SPMs, como a lipoxina A4, por exemplo. Embora esses mediadores apresentem atividades biológicas protetivas eles são rapidamente metabolizados em compostos não ativos através da ação de epóxi hidrolases solúveis (sEH). Portando, utilizando o tratamento com TPPU, é possível avaliar indiretamente os efeitos endógenos dos EETs na dor induzida por cristais de MSU. Neste estudo demonstramos que o tratamento com TPPU reduz a hiperalgesia mecânica (versão eletrônica dos filamentos do von Frey) e térmica (placa quente e Hargreaves), edema (paquímetro), e restabelece as mudanças na distribuição de peso nos membros traseiros (ensaio com o Static weight bearing), indicando que o TPPU reduz a dor e inflamação na artrite gotosa. Em conclusão, neste trabalho demonstramos o papel analgésico de duas moléculas explorando a resolução do processo inflamatório. Além disso, desvendamos um eixo de comunicação neuroimune na artrite gotosa, contribuindo na compreensão de novos mecanismos fisiopatológicos e novos alvos terapêuticosItem Detecção de infecção por Paracoccidioides brasiliensis em cães e animais silvestres da região norte do estado do Paraná(2022-06-20) Ishiuchi, Giovana Gomes de Carvalho; Ono, Mário Augusto; Itano, Eiko Nakagawa; Caldart, Eloiza Teles; Baeza, Lilian Cristiane; Viana, Kelvinson FernandesA paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica de importância médica ocasionada por fungos termo-dimórficos do gênero Paracoccidioides. A PCM é endêmica em países da América Latina e o Brasil é o país com o maior número de casos. O estado do Paraná é uma região endêmica para PCM humana. A infecção por P. brasiliensis também tem sido descrita em animais domésticos e silvestres. O objetivo deste trabalho foi avaliar a infecção por P. brasiliensis em cães e animais silvestres da região Norte do Estado do Paraná. Um total de 627 amostras de soros de cães das regiões norte (n= 186), sul (n= 94), leste (n= 100), oeste (n= 172) e central (n= 75) da área urbana da cidade de Londrina foram avaliados pelos métodos de imunodifusão (ID) e ELISA utilizando exoantígeno e Western Blot (WB) com gp43 recombinante (gp43r). Amostras de fígado (n= 65), linfonodos (n= 37), pulmões (n= 78) e baço (n= 28) pertencentes a 87 animais silvestres atropelados em rodovias de cidades da Região Norte do Paraná foram analisadas por Nested PCR utilizando os primers panfungais ITS 4/5 na primeira reação e primers específicos Pb ITS E/R na segunda reação. Em relação aos estudo soroepidemiológico com cães, 55,5% das amostras foram positivas no ELISA com exoantígeno. A PCM infecção foi confirmada por WB com gp43r em 216 (34,4%) animais. Quatro cães (0,64%) foram positivos no teste de ID, sugerindo PCM doença ativa. No estudo com animais silvestres atropelados, houve amplificação de DNA de P. brasiliensis em amostras de fígado e baço de um urubu (Coragyps atratus) e uma amostra de pulmão de uma lebre (Lepus europaeus). O urubu foi coletado em área rural da cidade de Uraí e a lebre, em zona urbana da cidade de Londrina, ambos em áreas arborizadas ou de plantação e próximo a córregos. Os hábitos destas espécies de animais aumentam sua exposição à infecção por Paracoccidioides spp. e suas distribuições geográficas se sobrepõem às áreas endêmicas para PCM humana. Os resultados reforçam a importância do uso de cães e animais silvestres como sentinelas da PCM em áreas urbanas e ruraisItem Atividade terapêutica e mecanismos de ação do mediador lipídico pró-resolução lipoxina A4 e do polifenol curcumina na dor e inflamação em modelo animal de artrite por componente de prótese(2022-12-20) Santos, Telma Saraiva dos; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Ceravolo, Graziela Scalianti; Borghi, Sérgio Marques; Campos, Cássia Calixto de; Ferraz, Camila RodriguesLipoxina A4 (LXA4) é um mediador lipídico pró-resolução (MLPR) e a curcumina é um polifenol com importante efeito anti-inflamatório e a com funções anti-inflamatórias e resolutivas na inflamação. Nós avaliamos os efeitos de ambos os tratamentos na artrite induzida por dióxido de titânio (TiO2). Camundongos foram estimulados com TiO2 (3mg) na articulação do joelho e vinte e quatro horas após, os animais foram tratados diariamente com curcumina (100µl de 10 ou 100 mg/kg, via oral) ou com veículo (20% tween 80 em salina), e com administração de LXA4 (0,1, 1 ou 10 ng/animal) ou veículo (etanol 3,2% em salina) a cada dois dias, por 30 dias. A hiperalgesia mecânica e térmica, inflamação e dosagens foram realizadas para avaliar os efeitos dos tratamentos. O tratamento com LXA4 também reduziu a hiperalgesia mecânica e térmica, dano histopatológico, edema e recrutamento de leucócitos sem induzir toxicidade. LXA4 reduziu a migração de leucócitos e modulou a produção de TNF-a, IL-1ß, IL-6 e IL-10. Esses efeitos foram explicados pela ativação reduzida do fator nuclear kappa B (NF-?B) nos leucócitos do líquido sinovial. A LXA4 melhorou os parâmetros antioxidantes (níveis reduzidos de glutationa [GSH] e 2,2-azino-bis 3-etilbenzotiazolina-6 sulfonato [ABTS], expressão do fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 [Nrf2]) reduzindo a detecção de espécies reativas de oxigênio [ROS] induzida por TiO2. Demonstramos o aumento da marcação do receptor ALX/FPR2 em neurônios TRPV1 positivos induzidos por TiO2. O tratamento com LXA4 modulou negativamente a ativação neuronal e a resposta à capsaicina (agonista TRPV1) e AITC (agonista TRPA1) de neurônios do GRD, além de reduzir expressão de TRPV1 e TRPA1 induzida por TiO2, bem como TRPV1 colocalizado com p-NF?B, indicando ativação neuronal. A curcumina reduziu a hiperalgesia mecânica e térmica, edema e alterações histopatológicas (pela coloração de hematoxilina-eosina [HE]) na articulação do joelho induzida por TiO2. A curcumina também reduziu o recrutamento de leucócitos (atividade de MPO e NAG, contagem total e diferencial), nível de IL-1ß e estresse oxidativo (peroxidação lipídica [TBARS], ânion superóxido [redução de nitroazul tetrazólio], bem como detecção de ROS e NO) induzido por TiO2 na articulação do joelho e líquido sinovial. A curcumina inibiu a ativação neuronal induzida por TiO2 e responsividade à capsaicina e AITC em neurônios DRG, diminuindo a marcação de TRPV1 em neurônios GRD, bem como TRPV1 colocalizado com p-NF?B. Concluindo, a curcumina e o LXA4 podem ter como alvo leucócitos recrutados e neurônios nociceptivos aferentes primários para exercer atividades analgésicas e anti-inflamatórias em um modelo de inflamação semelhante ao observado em pacientes com inflamação induzida por prótese.Item Associação entre as variantes genéticas rs2241043, rs2241049 e rs6518661 do IL17RA e a suscetibilidade e gravidade da psoríase(2023-07-18) Alcantara, Camila Cataldi de; Simão, Andréa Name Colado; Oliveira, Karen Brajão de; Amarante, Marla Karine; Bello, Valéria Aparecida; Luz, Tamires Flauzino; Almeida, Elaine Regina Delicato de; Oliveira, Sayonara RangelINTRODUÇÃO: A psoríase (PsO) é uma doença inflamatória crônica, mediada pelo sistema imunológico e de etiologia desconhecida. A resposta inflamatória normalmente tem início com um fator nocivo aos queratinócitos, estimulando a produção e secreção de citocinas. A indução da diferenciação das células T auxiliadoras dá início à uma produção de citocinas capazes de ativar e recrutar células do sistema imunológico para o local da lesão. Nesse microambiente, a Interleucina (IL) 17 exerce um papel primordial para a fisiopatologia da doença. O caráter multifatorial da PsO e a importância da IL-17 para a sua fisiopatologia evidenciam a necessidade de investigar como o fator genético pode influenciar na suscetibilidade à PsO e na resposta de pacientes aos novos tratamentos desenvolvidos contra essas moléculas. OBJETIVO: Revisar a literatura e avaliar a associação entre as variantes genéticas rs2241043, rs2241049 e rs6518661 do gene IL17RA e a suscetibilidade e gravidade da PsO. SUJEITOS E MÉTODOS: Este é um estudo caso-controle que incluiu 308 participantes de ambos os sexos, com idade entre 18 e 70 anos, sendo 154 pacientes com diagnósticos de PsO e 154 indivíduos saudáveis. O diagnóstico de PsO foi feito por um dermatologista e o Índice de Gravidade e Extensão das Lesões Psoriáticas (PASI) foi usado para determinar a gravidade da doença. Os dados clínicos, epidemiológicos e antropométricos foram obtidos durante consulta clínica através do preenchimento de uma ficha de avaliação previamente estabelecida. As variantes genéticas do gene IL17RA foram genotipadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando sondas TaqMan®. Três variantes genéticas localizados na região intrônica do IL17RA foram genotipados: T>C rs2241043, A>G rs2241049 e G>A rs6518661. RESULTADOS: Os pacientes com PsO eram mais velhos (p<0,001), tinham maior Índice de Massa Corporal (IMC) (p<0,001) e maiores níveis séricos de Proteína C Reativa (p<0,001) e Ferritina (p=0,002) quando comparados aos controles. A presença do alelo G em homozigose par o rs2241049 A>G demonstrou estar associado à proteção contra a PsO nos modelos dominante (OR=0,37, 95% IC 0,18-0,76, p=0,017) e recessivo (OR=0,39, 95% IC 0,20-0,76, p=0,005). A frequência do alelo A foi maior no grupo com PsO e o alelo C, no grupo controle (OR=0,799, 95% IC 0,67-0,95, p=0,0151). O genótipo CC do rs2241043 T>C demonstrou ser um fator de proteção contra o desenvolvimento de PsO grave (OR=0,30, 95% IC 0,10-0,093, p=0,020). Esta associação se manteve independentemente de idade, sexo, etnia e IMC (OR=0,303, 95% IC 0,095-0,965, p=0,043). A presença do alelo A em homozigose para o rs6518661 G>A demonstrou estar associado à proteção contra o desenvolvimento de PsO grave (OR=0,22, 95% IC 0,05-0,99, p=0,020). CONCLUSÃO: Este estudo demonstrou que o genótipo GG do IL17RA A>G rs2241049 é um fator protetor contra o desenvolvimento de PsO. Além disso, o alelo C em homozigose da variante IL17RA T>C rs2241043 e o genótipo AA do IL17RA G>A rs6518661 foram associados à proteção contra o desenvolvimento de PsO grave. Mais estudos são necessários para elucidar quais mecanismos genéticos e epigenéticos podem estar envolvidos nas associações, uma vez que esses genes estão localizados em regiões intrônicas.