01 - Doutorado - Patologia Experimental

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Consequências da administração de dimesilato de lisdexanfetamina sobre o desenvolvimento pós natal do sistema genital masculino de ratos wistar
(2024-02-16) Santos, Dayane Priscila dos; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Araújo, Eduardo José de Almeida; Andrade, Fábio Goulart de; Martins-Pinge, Marli Cardoso
O transtorno do Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) é caracterizado por excessiva desatenção, desorganização ou hiperatividade/impulsividade. Esses sintomas iniciam-se na infância produzindo prejuízos pessoais, sociais e acadêmicos. Para melhorar a qualidade de vida dos pacientes, medicamentos neuroestimulantes são recomendados. Dentre eles, encontra-se o dimesilato de lisdexanfetamina (LDX), um inibidor da recaptação de noradrenalina e dopamina prescrito para pacientes a partir dos 6 anos de idade. Nessa fase o sistema genital masculino não está completamente desenvolvido e o aumento da estimulação catecolaminérgica nos órgãos genitais poderia prejudicar seu desenvolvimento e funcionalidade. Esse estudo objetivou avaliar, em modelo animal, os efeitos da administração de LDX durante o período de desenvolvimento pós-natal do testículo e epidídimo e verificar se esses efeitos perduram até a vida adulta. Oitenta ratos Wistar foram divididos nos grupos experimentais controle imediato (C-I), LDX imediato (LDX-I), controle tardio (C-T) e LDX tardio (LDX-T). Os grupos LDX-I e LDX-T receberam 11,3 mg/kg/dia de LDX diluído em 500 µL de salina a 0,9% diariamente via gavagem do dia pós-natal (DPN)25 ao DPN65. Após o período de tratamento os grupos C-I e LDX-I foram eutanasiados no DPN66 e os grupos C-T e LDX-T permaneceram no biotério por um tempo de recuperação de 65 dias recebendo ração e água ad libidum até a data de sua eutanásia no DPN131. Os testículos foram utilizados para determinação da produção diária de espermatozoides (PDE), análises histopatológicas, morfométricas e de estresse oxidativo. Os epidídimos foram utilizados para análise de estresse oxidativo, estereologia, morfologia, histopatologia e determinação do tempo de trânsito espermático (TTE). Espermatozoides foram avaliados quanto a morfologia, integridade do acrossôma, atividade mitocondrial e motilidade. A testosterona foi determinada no plasma. Nos testículos, o LDX induziu hipoplasia de células de Leydig e consequente redução dos níveis plasmáticos de testosterona no grupo LDX-I. A baixa disponibilidade de testosterona neste grupo favoreceu o desprendimento de células imaturas do epitélio germinativo, culminando em aumento do percentual de túbulos seminíferos contendo vacúolos no epitélio e células imaturas na luz. Esses fatores contribuíram para redução da altura do epitélio germinativo, do diâmetro dos túbulos seminíferos e da PDE. O grupo LDX-T evidenciou que a hipoplasia de células de Leydig permanece após a interrupção do tratamento, causando atrofia gonadal e persistência da testosterona plasmática reduzida. Consequentemente, houve persistência do desprendimento de células imaturas do epitélio germinativo e da redução da altura do epitélio germinativo e da PDE nos animais adultos. No epidídimo, a administração de LDX gerou hipoplasia de células basais e retardou a expansão do ducto epididimário na região de cauda dos grupos LDX-I e LDX-T. O grupo LDX-I apresentou aceleração do TTE pelo epidídimo e redução na atividade de glutationa-S-transferase na região de cauda resultando em redução da atividade mitocondrial e motilidade espermática. Após a interrupção do tratamento o TTE foi reestabelecido no grupo LDX-T, mas a atividade da glutationa S-transferase na cauda se manteve reduzida levando ao aumento da peroxidação lipídica nessa região e persistência da redução da atividade mitocondrial e motilidade nos espermatozoides dos animais adultos. Em conclusão, esses resultados demonstram que a administração de LDX retarda o desenvolvimento pós-natal dos testículos e da cauda do epidídimo, levando a alterações irreversíveis na morfologia e funcionalidade desses órgãos
Atividade antitumoral do 3,3',5,5'-tetrametoxibifeenil-4,4'-diol e trilobolido-6-O-isobutirato em um modelo experimental in vitro em células A549 e NCI-H460: explorando os efeitos metabólicos e os mecanismos de ação
(2023-10-20) Concato-Lopes, Virgínia Márcia; Pavanelli, Wander Rogério; Kwasniewski, Fábio Henrique; Mantovani, Mário Sérgio; Bidoia, Danielle Lazarin; Providello, Maiara Voltarelli; Mantovani, Mário Sérgio
O câncer de pulmão, uma doença crônica e heterogênea, é a principal causa de morte relacionada ao câncer mundialmente. Apesar da disponibilidade de diversas opções terapêuticas, sua eficácia continua limitada, frequentemente acompanhada de alta toxicidade, efeitos colaterais significativos, além de resistência medicamentosa que as células cancerígenas desenvolvem. O composto fenólico 3,3',5,5'-tetrametoxibifenil-4,4'-diol (TMBP), obtido por meio da biotransformação do 2,6-dimetoxifenol, mediada por lacase fungica, e a lactona sesquiterpênica extraída de Sphagneticola trilobata, trilobolide-6-O-isobutirato (TBB), demonstraram na literatura efeitos leishmanicida, antitumorais e imunomoduladores. No entanto, seus mecanismos de ação em câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) não foram investigadas. Neste estudo, avaliamos o efeito antitumoral in vitro do TMBP e do TBB nas linhagens A549 e NCI-H460, elucidando os mecanismos indutores de morte celular. O tratamento com TMBP (12,5-200 µM) sobre as células NCI-H460 resultou na redução da proliferação em 24, 48 e 72 h. O IC50 (154 µM) foi obtido e utilizado para os demais experimentos. Após 24 h de exposição, o tratamento com IC50, induziu diversas alterações morfológicas e ultraestruturais nas células NCI-H460, reduziu a migração e a marcação de N-caderina e ß-catenina por imunofluorescência, aumento de espécies reativas de oxigênio (ERO) e óxido nítrico (ON), juntamente com a diminuição dos radicais ânion superóxido e atividade reduzida da glutationa redutase (GSH). Além disso, o TMBP induziu estresse metabólico, evidenciado pela redução da captação de glicose, da lactato desidrogenase intracelular e dos níveis de lactato. Outros efeitos observados incluíram a despolarização mitocondrial, aumento na formação de gotículas lipídicas e a presença de vacúolos autofágicos. Notavelmente, o TMBP induziu a parada do ciclo celular na fase G2/M e a morte celular semelhante a apoptose, conforme indicado pelo aumento da atividade da caspase-3/7 e pela redução da marcação de STAT-3 por imunofluorescência. O impacto antitumoral do TMBP foi acompanhado por uma redução nos níveis proteicos de PI3K, AKT, ARG-1 e NF-?B, juntamente com um aumento de iNOS. Em relação ao tratamento com TBB, as previsões in silico revelaram um potencial promissor de similaridade com medicamentos para o composto, indicando alta biodisponibilidade oral e eficiente absorção intestinal. O tratamento in vitro, sob células humanas A549 e NCI-H460 (12-100 µM) reduziu a viabilidade celular, obtendo valores de IC50 de 73 e 54 µM para A549 e NCI-H460, respectivamente, os quais foram usados nas experimentações seguintes. Após a exposição ao tratamento com IC50 de 73 e 54 µM, as células apresentaram alterações morfológicas e estruturais, capacidade migratória reduzida e aumento do estresse oxidativo, caracterizado pelo aumento nos níveis de ERO, radicais ânion superóxido e ON, juntamente com uma redução nos marcadores antioxidantes chave, como superóxido dismutase e GSH. Encontramos também estresse celular induzido pelo TBB após tratamento, o qual resultou em mudanças notáveis no metabolismo celular, levando ao acúmulo de gotículas lipídicas e vacúolos autofágicos, bem como o comprometimento da integridade mitocondrial, um aspecto crucial da função celular. Adicionalmente, o TBB desencadeou uma morte celular semelhante a apoptose por meio da ativação das caspases 3/7. Essas descobertas destacam o grande potencial dos compostos TMBP e TBB como candidatos promissores para estudos futuros, consolidando sua posição como componentes adicionais no desenvolvimento de protótipos de novos medicamentos anticâncer
Marcadores de estresse oxidativo, inflamação e hipóxia no carcinoma papilífero de tireoide
(2025-04-24) Cavalcanti, Liara Freitas; Cecchini, Rubens; Venâncio, Emerson José; Andrade, Fábio Goulart de; Armani, André; Luiz, Rodrigo Cabral
O carcinoma papilífero de tireoide (CPT) é a neoplasia endócrina mais comum, representando de 80% a 90% dos casos de câncer de tireoide. Apesar do bom prognóstico, alguns casos apresentam risco de recorrência e metástases. Evidências sugerem que a patogênese do CPT está associada a fatores como estresse oxidativo, inflamação crônica e hipóxia, que atuam em sinergia para promover danos celulares, instabilidade genômica e adaptação tumoral ao microambiente. A inflamação, frequentemente exacerbada no contexto de estresse, pode levar a secreção de citocinas e quimiocinas que favorecem a proliferação celular, angiogênese e evasão do sistema imune. Nesse contexto, a hipóxia atua como um fator adicional, levando a adaptação metabólica, angiogênese e resistência celular no microambiente tumoral. Portanto, o presente estudo buscou investigar a presença desses fatores no CPT comparando com neoplasias benignas. Como objetivo secundário, buscou-se relatar um caso atípico da doença para contribuir com a literatura acerca do assunto. Para o primeiro objetivo, duas coortes de pacientes foram analisadas, divididas em dois grupos: benigno e CPT. Na primeira, avaliou-se o estresse oxidativo sistêmico em amostras de plasma (carbonilação de proteínas, peróxido de hidrogênio [H2O2], e tiol total), bem como os níveis de citocinas e quimiocinas Na segunda coorte, o estresse oxidativo (catalase, glutationa reduzida [GSH] e hidroperóxidos de membrana) foi analisado em amostras de tecido tireoidiano normal, benigno e CPT. Além disso, a presença de marcadores de estresse foi analisada nesses tecidos por imunofluorescência (fator induzível por hipóxia 1-alfa [HIF-1a], fator nuclear eritróide 2-related factor 2 [Nrf2] e glutationa peroxidase 3 [GPx3]). Os resultados mostraram que os marcadores de estresse oxidativo na primeira coorte estavam mais elevados no grupo CPT. Contudo, na segunda coorte, não houve diferença significativa entre os grupos. Em relação aos marcadores inflamatórios plasmáticos da primeira coorte, apenas a quimiocina regulada pelo timo e pela ativação (TARC) apresentou níveis plasmáticos mais elevados no grupo benigno, enquanto outras citocinas e quimiocinas não mostraram diferenças significativas entre os grupos. A intensidade de marcação de HIF-1a, Nrf2, e GPx3 foi significativamente mais intensa no grupo PTC da segunda coorte, evidenciando o ambiente de estresse oxidativo nesses tumores. Em conclusão, os achados desse trabalho destacam a importância do estresse oxidativo como potencial marcador para diferenciar tumores benignos do CPT, enquanto o resultado da imunofluorescência ressalta a participação do estresse oxidativo na patogênese dessa doença. Além dos resultados evidenciados nas coortes de pacientes, o presente estudo também contribui com o relato de um caso atípico de carcinoma papilífero de tireoide de variante folicular infiltrativa. O paciente apresentou sinais e sintomas iniciais inespecíficos, evoluindo rapidamente para insuficiência respiratória e parada cardiorrespiratória. A confirmação diagnóstica revelou um tumor invasivo com extensão para estruturas adjacentes. A evolução clínica favorável sugere que, mesmo em casos avançados, intervenções terapêuticas adequadas podem controlar a progressão da doença. Os resultados do primeiro artigo contribuem para uma compreensão mais profunda da interação entre estresse oxidativo, inflamação e progressão tumoral no CPT, fornecendo bases para futuras abordagens terapêuticas e prognósticas. E, por fim, o relato amplia o conhecimento sobre as apresentações clínicas atípicas do CPT, contribuindo para o reconhecimento precoce e manejo clínico mais eficiente
Análise das variantes rs1800896, rs1800871 e rs1800872 e haplótipos do gene IL10, e sua associação com a gravidade e desfecho da COVID-19
(2025-03-17) Oliveira, Janaina Nicolau de; Oliveira, Karen Brajão de; Venâncio, Emerson José; Guembarovski, Roberta Losi; Galhardi, Lígia Carla Faccin; Serpeloni, Juliana Mara
Gravidade e letalidade são manifestações observadas em parte dos casos de doença do coronavírus-19 (COVID-19), e estão ligadas a fatores como hipercitocinemia, linfopenia e Síndrome Respiratória Aguda Grave (SRAG). Nesse contexto, a IL-10, uma citocina com função imunorreguladora, surgiu como um potencial marcador de gravidade da doença, sendo observada em concentrações elevadas em pacientes com COVID-19. Variações genéticas na região proximal do gene, particularmente variantes de nucleotídeo único (SNVs) como rs1800896 (–1082A>G), rs1800871 (–819C>T) e rs1800872 (–592C>A), juntamente com seus haplótipos GCC, ACC e ATA, estão associadas a diferenças em níveis de IL-10 e suscetibilidade a doenças virais. Embora diversos estudos tenham explorado a relação entre essas variações genéticas e doenças virais, incluindo a COVID-19, os resultados são contraditórios. Desta forma, parte deste estudo foi dedicado a revisar dados da literatura afim de compreender de forma mais abrangente os efeitos destas SNVs e seus haplótipos na produção de IL-10 e em associação com doenças virais. E ainda, este estudo teve como objetivo avaliar a associação desses SNVs e seus haplótipos em pacientes com diagnóstico de COVID-19 em Londrina, Paraná, com a gravidade e os desfechos da doença, visto que nenhum estudo investigou tais associações entre as SNVs e a COVID-19 na população brasileira. Desta forma, este estudo envolveu 367 pacientes selecionados do Hospital Universitário da Universidade Estadual de Londrina (HU-UEL). Os pacientes foram categorizados em grupos denominados leve (n=165), moderado (n=72) e grave (n=130), de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS). O grupo grave foi ainda classificado nos subgrupos recuperado (n=64) e óbito (n=66). A genotipagem dos SNVs foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real com sondas TaqMan. Os haplótipos foram inferidos pelo software PHASE e as análises de associação foram realizadas com teste Qui-quadrado ou regressão logística multinomial. O genótipo GG (1082 A>G) foi independentemente associado aos casos graves de COVID-19 (P=0,038, OR= 2,522, IC 95% 1,053 – 6,038), enquanto o haplótipo GCC em homozigose também foi associado aos casos graves (P=0,037, OR 2,767, IC 95% 1,065 – 7,191). Portanto, este estudo demonstrou que a presença do genótipo GG da SNV 1082 A>G (rs1800896) ou do haplótipo GCC está associada à gravidade da COVID-19 em uma amostragem brasileira.
Avaliação das respostas biológicas frente à exposição aos nano- e micro-plásticos.
(2023-12-08) Brito, Walison Augusto da Silva; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Guarnier, Flávia Alessandra; Perobelli, Juliana Elaine; Marinello, Poliana Camila; Bekeschus, Sander
A presença de partículas de nano e micro-plásticos (NMPs) é uma preocupação ambiental e ecológica cada vez maior devido aos seus possíveis impactos negativos sobre a saúde humana. Os seres humanos são expostos diariamente aos NMPs por ingestão, inalação e contato tópico. No entanto, devido às limitações nas metodologias de amostragem, detecção e quantificação da exposição aos NMPs em matrizes biológicas e complexas, os roedores e os modelos de cultura de células são ferramentas importantes para a avaliação toxicológica. Estudos in vitro e in vivo descreveram a bioacumulação, o estresse oxidativo, a inflamação e a perturbação metabólica após a exposição aos NMPs como as principais respostas biológicas. Os NMPs ambientais são difíceis de serem amostrados e identificados, portanto, os NMPs disponíveis comercialmente têm sido amplamente utilizados em estudos toxicológicos. No entanto, esses NMPs geralmente apresentam propriedades físico- químicas homogêneas, diferindo das misturas heterogêneas dos NMPs encontrados no meio ambiente, que apresentam diversos tipos de polímeros, tamanhos e formas. Portanto, é necessário desenvolver novos métodos para produzir NMPs ambientalmente relevantes para servir como materiais de referência para pesquisas toxicológicas e investigar seus possíveis efeitos na saúde humana. Considerando isso, produzimos NMPs de polietileno tereftalato (PET) usando um tratamento de ultrassom em condições alcalinas, adotando algumas modificações ao protocolo convencional. Além disso, nosso estudo teve como objetivo investigar os possíveis efeitos biológicos da exposição aguda de PET NMPs em duas linhas de células humanas, A549 e HaCaT, abordando a inalação e as rotas de exposição humana tópica in vitro. O tratamento por ultrassom em condições alcalinas induziu a degradação do polímero em PET NMPs menores, formando fragmentos heterogêneos em forma e, em geral, semelhanças nas superfícies químicas entre o PET antes e depois da sonicação. Em um sistema aquoso, os PET NMPs apresentaram um tamanho médio de 781 nm, uma suspensão polidispersa e uma carga de superfície negativa. Suspenção monodispersa de poliestireno amino-modificado (PS-NH2) de 55 nm foi utilizado como controle positivo para as análise in vitro. Após a exposição aguda de PET NMPs, o metabolismo das células A549 foi ligeiramente aumentado, enquanto o HaCaT não sofreu alteração. Ambas as linhas celulares interagiram e absorveram PET NMPs, o que foi observado pelo aumento da granularidade celular. Além disso, a viabilidade celular foi reduzida e o aumento da necrose foi observado apenas nas células A549. O aumento da formação de micronúcleos em alta concentração foi observado nas células HaCaT. A exposição aos PET NMPs não foi capaz de alterar os níveis de ERO intracelulares, em contraste com os PS-NH2 NMPs. No entanto, a redução dos níveis de tiois foram observadas somente nas células HaCaT após exposição. Além disso, em alta concentração, os PET NMPs induziram a ativação do Nrf2 em ambas as linhagens celulares. Os PET NMPs induziram diferentes perfis de secreção de citocinas e os principais efeitos observados ocorreram em alta concentração e em citocinas pró-inflamatórias. Assim, ambas as linhagens celulares apresentaram alterações significativas com relação à ativação do NF-?B. Os PET NMPs induziram alterações na morfologia celular apenas nas células HaCaT. Ainda, os marcadores de autofagia (mTOR, ULK1, ATG5 e LC3B) foram afetados de formas diferentes em ambas as linhagens celulares, sendo que marcadores iniciais (mTOR e ULK1) estavam significativamente reduzidos. Curiosamente, as análise de componentes principais revelaram que as alterações relacionadas à autofagia ocorreram independentemente da concentração. Em conclusão, os PET NMPs ambientalmente relevantes produzidos por sonicação foram internalizados pelas linhagens celulares humanas e afetaram de forma diferente as respostas biológicas em relação à linhagem celular.
Efeitos de uma dieta hiperproteica sobre parâmetros histopatológicos do cólon de camundongos C57BL/6 com Retocolite Ulcerativa induzida por Dextran Sulfato de Sódio (DSS).
(2023-04-26) Machado, Camila Cristina Alves; Araújo, Eduardo José de Almeida; Armani, Alessandra L. Cecchini; Sant Ana, Débora de Mello Gonçales; Zanoni, Jacqueline Nelisis; Natali, Maria Raquel Marçal
A incidência de Retocolite Ulcerativa (RCU) aumentou nos últimos anos e a tendência é que em países cuja prevalência da doença é alta, o número se estabilize com passar do tempo, enquanto nos demais ele continue aumentando. Frente a isto, é essencial compreender como os diferentes fatores que podem estar relacionados ao seu desenvolvimento e/ou exacerbação, como é o caso da dieta hiperproteica. Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do consumo de uma dieta hiperproteica durante a indução experimental de RCU para o intestino grosso de camundongos C57BL/6. Para isto camundongos C57BL/6 machos foram distribuídos em 4 grupos experimentais: DP (alimentados com dieta padrão); HP (alimentados com dieta hiperproteica); DP/DSS (alimentados com dieta padrão e induzidos a RCU); e, HP/DSS (alimentados com dieta hiperproteica e induzido a RCU). Para indução da RCU experimental, os camundongos forma mantidos em gaiolas com livre acesso à água contendo dextran sulfato de sódio a 3% durante sete dias. A ração hiperproteica continha o dobro de teor proteico que a padrão e a fonte utilizada foi a caseína e a proteína de soja. Foram avaliados o índice de atividade da doença (DAI), trânsito gastrointestinal, análise de fenótipo de fezes e avaliação dos neurônios do plexo mioentérico e submucoso do cólon. Como resultado observou-se que os camundongos que ingeriram a dieta hiperproteica apresentaram sinais clínicos da doença mais intensos e isso resultou em DAI maior quando comparado aos demais grupos. Encurtamento do cólon foi observado em ambos os grupos induzidos a RCU, alimentados com a dieta hiperproteica e com a dieta padrão. O escore histológico entre os grupos DSS também foi semelhante e diferiu em relação aos controles. Todavia, as alterações a nível de sistema nervoso entérico foram mais intensas no cólon distal de camundongos alimentados com a dieta hiperproteica. Foram observadas mudanças numéricas e morfológicas em todas as populações neuronais avaliadas indicando possíveis alterações funcionais. Embora o trânsito gastrointestinal, o peso bruto e o percentual de água nas fezes não tenham diferido entre os grupos experimentais, a expressiva alteração na consistência das fezes e diminuição no número de pellets expelidos por dia pelos camundongos que ingeriram a dieta hiperproteica demonstram que perturbações podem estar ocorrendo no intestino grosso como resultado das alterações no plexo mioentérico e submucoso. Logo, para uma maior compreensão de como a dieta hiperprotéica pode influenciar a saúde dos indivíduos com RCU, a interação entre proteínas da alimentação e sistema nervosos entérico precisa ser mais bem explorada. Todavia, os resultados encontrados destacam que os nutrientes presentes no lúmen intestinal podem modular a atividade dos diferentes componentes presentes na parede intestinal, principalmente em indivíduos com RCU.
Sepse polimicrobiana na Síndrome metabólica murina: efeitos da aspirina sobre a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), marcadores inflamatórios e parâmetros cardiovasculares.
(2025-02-06) Nakama, Raquel Pires; Pinge Filho, Phileno; Verri Junior, Waldiceu Aparecido; Dionísio, Andressa de Freitas Mendes; Ceravolo, Graziela Scalianti; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Martins-Pinge, Marli Cardoso
A obesidade é um problema de saúde pública, caracterizada pelo acúmulo excessivo de tecido adiposo, e está fortemente associada à síndrome metabólica (SMet), que inclui hipertensão, dislipidemia e resistência à insulina. Outra condição de alta relevância é a sepse, com elevada incidência em unidades de terapia intensiva (UTIs) e alto risco de mortalidade, especialmente em indivíduos obesos. No entanto, dados recentes sugerem um "paradoxo da obesidade", em que a obesidade pode exercer efeitos protetores em infecções críticas, como a sepse. Além disso, o uso prévio de aspirina em doses baixas tem sido associado à redução da morbimortalidade na sepse. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do pré-tratamento com aspirina e da síndrome metabólica em um modelo de sepse severa. Foi utilizado modelo murino de Smet induzido por injeção de glutamato monossódico (4 mg/g) em camundongos Swiss do 1° ao 5° dia de vida. Os animais machos receberam aspirina (40 mg/kg) durante 15 dias antes da indução da sepse, que ocorreu no 75° dia, pelo método de ligadura e punção do ceco (CLP). Foram avaliados parâmetros hematológicos e glicêmicos, indicadores cardiovasculares, além de análises de citocinas, óxido nítrico e lactato plasmático. Neutrófilos da medula óssea foram isolados para investigar a liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). No lavado peritoneal, foram avaliadas a migração leucocitária, os níveis de citocinas inflamatórias, óxido nítrico e a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Observou-se que tanto a SMet quanto o pré-tratamento com aspirina em animais controle, conferiram proteção contra a sepse severa, aumentando a sobrevida dos animais e atenuando alterações características, como hipotensão, hipoglicemia e inflamação exacerbada. Concluímos que a Smet e o pré-tratamento com ASA em animais controle, exercem efeitos que fortalecem o “paradoxo da obesidade” após indução da sepse severa, compartilhando similaridades protetoras sistêmicas e imunoregulatórias Esses achados contribuem para o entendimento da fisiopatologia da sepse e apontam para possíveis estratégias terapêuticas para mitigar seus efeitos deletérios.
Explorando a terapêutica da resolução do processo inflamatório na artrite gotosa: efeito analgésico da resolvina D1, um mediador lipídico pró-resolução, e do TPPU, um inibidor de epóxido-hidrolase solúvel em camundongos
(2022-11-28) Zaninelli, Tiago Henrique; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Ferraz, Camila Rodrigues; Ribeiro, Felipe Almeida de Pinho; Manchope, Marília Fernandes; Fattori, Victor
A resolução da inflamação é um processo ativo e altamente regulado por mediadores lipídicos pró-resolução (SPMs). SPMs são lipídeos derivados dos ácidos graxos ômega-3 ou ômega-6, os quais são divididos em quatro principais famílias “lipoxinas, resolvinas, maresinas e protectinas”. Na presente tese, inicialmente buscamos estabelecer uma relação dos níveis de SPMs e as características clínicas de doenças reumáticas. Por meio de um artigo de revisão discutimos a relação entre os níveis endógenos de SPMs e os sinais e sintomas de doenças reumáticas intermitentes, como a artrite reumatoide e gotosa. Baixos níveis de SPMs estão relacionados com uma percepção elevada da dor, por exemplo. Ademais elencamos os estudos pré-clínicos demonstrando os efeitos farmacológicos dos SPMs, e a importância dos SPMs para o monitoramento da eficácia de drogas modificadoras de doenças (DMARDs) que são potentes aliadas no tratamento e controle da progressão de doenças reumáticas. Por fim, vislumbramos quatro possíveis abordagens terapêuticas utilizando SPMs para o tratamento de artrites. Nos demais trabalhos investigamos os efeitos da Resolvina D1 (RvD1) e do inibidor de epóxido-hidrolase solúvel (sEH), TPPU, em um modelo de artrite gotosa induzido por cristais de urato monossódico (MSU, estímulo intra-articular no joelho) em camundongos Swiss. A gota afeta aproximadamente 10% da população mundial e é caracterizada por ataques agudos intercalados por fases assintomáticas. Dor articular excruciante, recrutamento de leucócitos e edema são os principais sintomas, e os mais desafiadores no tratamento. As terapias disponíveis para o tratamento da gota comummente oferecem efeitos colaterais severos, alto custo, e eficácia analgésica limitada em muitos pacientes. Portando além de contribuir na investigação dos efeitos e mecanismos de ação de novos fármacos para modulação dos sinais e sintomas, baseados na literatura atualizamos os mecanismos patofisiológicos da artrite gotosa, assim como as novas perspectivas para o tratamento dessa doença em uma segunda revisão. Em nosso segundo artigo pautamos a discussão na lacuna existente entre uma vasta quantidade de dados pré-clínicos e a medicina translacional, além de revisamos os efeitos benéficos de produtos naturais, drogas com múltiplos alvos e os SPMs como perspectivas futuras no controle da doença. Os dois artigos de revisão reiteram que o papel dos SPMs para doenças reumáticas e a necessidade no desenvolvimento de novas terapias. Portanto para o terceiro artigo, os camundongos foram tratados com RvD1 em dois protocolos experimentais, utilizando duas vias de administração (intraperitoneal [i.p.] e intratecal [i.t.]). A dose e o tempo de pré-tratamento foram selecionados baseado nos dados de redução da hiperalgesia mecânica (versão eletrônica dos filamentos do von Frey) e edema articular (paquímetro). O efeito analgésico da dose de 3 ng (72 horas antes do estímulo) foram confirmados pela distribuição do peso das patas traseiras do animal (ensaio com o Static weight bearing), um método não reflexivo de análise de dor. Dessa forma, a dose de 3 ng e pré-tratamento de 72 horas foram selecionados para os próximos experimentos. Tratamentos com RvD1 local (i.t.) ou sistêmico (i.p.) reduziram o recrutamento de leucócitos (contagem no lavado articular) e os níveis de IL-1? no tecido articular por ELISA. Em cultura de macrófagos derivados da medula óssea, o tratamento in vitro com RvD1 reduziu a fosforilação e translocação do fator de transcrição NF-?B para o núcleo, diminuiu a expressão da molécula adaptadora ASC e a maturação da citocina pró-inflamatória IL-1??avaliados por imunofluorescência e ELISA, respectivamente. Estes resultados demonstram que a RvD1 bloqueia a ativação de macrófagos, que são células chave na fisiopatologia da doença. Além disso, nós demonstramos que o tratamento i.t. com RvD1 reduz a expressão de mRNA para canais iônicos (Trpv1 e Nav1.8) e neuropeptídios (substância P e Cgrp) no gânglio da raiz dorsal (DRG) através do RT-qPCR. RvD1 também reduz a ativação de neurônios peptidergicos (CGRP+) no DRG, e bloqueia a liberação de CGRP in vitro (determinado por EIA, em cultura de neurônios do DRG) e in vivo (por imunofluorescência). Por fim, nós também demonstramos que o CGRP aumenta a fagocitose de cristais de MSU por macrófagos, e consequente aumenta os níveis de IL-1? maturada, fenômenos que são reduzidos com o tratamento com RvD1. Portanto, neste estudo, além de demonstrar o importante efeito farmacológico da RvD1, nós também revelamos um mecanismo neuroimune nunca estudado na artrite gotosa. Em conclusão, nossos achados sugerem que RvD1 é um forte candidato para o controle da dor e inflamação na artrite gotosa, e que a comunicação entre nociceptor e células imunes são também alvo para abordagens terapêuticas. Para o quarto artigo nos propusemos a investigar os efeitos farmacológicos do inibidor de epóxido-hidrolase solúvel (sEH), TPPU, no mesmo modelo experimental. Durante o metabolismo do ácido araquidônico, via citocromo P450, são originados os ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs) que exercem atividade protetiva e são moléculas precursoras na geração de SPMs, como a lipoxina A4, por exemplo. Embora esses mediadores apresentem atividades biológicas protetivas eles são rapidamente metabolizados em compostos não ativos através da ação de epóxi hidrolases solúveis (sEH). Portando, utilizando o tratamento com TPPU, é possível avaliar indiretamente os efeitos endógenos dos EETs na dor induzida por cristais de MSU. Neste estudo demonstramos que o tratamento com TPPU reduz a hiperalgesia mecânica (versão eletrônica dos filamentos do von Frey) e térmica (placa quente e Hargreaves), edema (paquímetro), e restabelece as mudanças na distribuição de peso nos membros traseiros (ensaio com o Static weight bearing), indicando que o TPPU reduz a dor e inflamação na artrite gotosa. Em conclusão, neste trabalho demonstramos o papel analgésico de duas moléculas explorando a resolução do processo inflamatório. Além disso, desvendamos um eixo de comunicação neuroimune na artrite gotosa, contribuindo na compreensão de novos mecanismos fisiopatológicos e novos alvos terapêuticos
Detecção de infecção por Paracoccidioides brasiliensis em cães e animais silvestres da região norte do estado do Paraná
(2022-06-20) Ishiuchi, Giovana Gomes de Carvalho; Ono, Mário Augusto; Itano, Eiko Nakagawa; Caldart, Eloiza Teles; Baeza, Lilian Cristiane; Viana, Kelvinson Fernandes
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica de importância médica ocasionada por fungos termo-dimórficos do gênero Paracoccidioides. A PCM é endêmica em países da América Latina e o Brasil é o país com o maior número de casos. O estado do Paraná é uma região endêmica para PCM humana. A infecção por P. brasiliensis também tem sido descrita em animais domésticos e silvestres. O objetivo deste trabalho foi avaliar a infecção por P. brasiliensis em cães e animais silvestres da região Norte do Estado do Paraná. Um total de 627 amostras de soros de cães das regiões norte (n= 186), sul (n= 94), leste (n= 100), oeste (n= 172) e central (n= 75) da área urbana da cidade de Londrina foram avaliados pelos métodos de imunodifusão (ID) e ELISA utilizando exoantígeno e Western Blot (WB) com gp43 recombinante (gp43r). Amostras de fígado (n= 65), linfonodos (n= 37), pulmões (n= 78) e baço (n= 28) pertencentes a 87 animais silvestres atropelados em rodovias de cidades da Região Norte do Paraná foram analisadas por Nested PCR utilizando os primers panfungais ITS 4/5 na primeira reação e primers específicos Pb ITS E/R na segunda reação. Em relação aos estudo soroepidemiológico com cães, 55,5% das amostras foram positivas no ELISA com exoantígeno. A PCM infecção foi confirmada por WB com gp43r em 216 (34,4%) animais. Quatro cães (0,64%) foram positivos no teste de ID, sugerindo PCM doença ativa. No estudo com animais silvestres atropelados, houve amplificação de DNA de P. brasiliensis em amostras de fígado e baço de um urubu (Coragyps atratus) e uma amostra de pulmão de uma lebre (Lepus europaeus). O urubu foi coletado em área rural da cidade de Uraí e a lebre, em zona urbana da cidade de Londrina, ambos em áreas arborizadas ou de plantação e próximo a córregos. Os hábitos destas espécies de animais aumentam sua exposição à infecção por Paracoccidioides spp. e suas distribuições geográficas se sobrepõem às áreas endêmicas para PCM humana. Os resultados reforçam a importância do uso de cães e animais silvestres como sentinelas da PCM em áreas urbanas e rurais
Atividade terapêutica e mecanismos de ação do mediador lipídico pró-resolução lipoxina A4 e do polifenol curcumina na dor e inflamação em modelo animal de artrite por componente de prótese
(2022-12-20) Santos, Telma Saraiva dos; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Ceravolo, Graziela Scalianti; Borghi, Sérgio Marques; Campos, Cássia Calixto de; Ferraz, Camila Rodrigues
Lipoxina A4 (LXA4) é um mediador lipídico pró-resolução (MLPR) e a curcumina é um polifenol com importante efeito anti-inflamatório e a com funções anti-inflamatórias e resolutivas na inflamação. Nós avaliamos os efeitos de ambos os tratamentos na artrite induzida por dióxido de titânio (TiO2). Camundongos foram estimulados com TiO2 (3mg) na articulação do joelho e vinte e quatro horas após, os animais foram tratados diariamente com curcumina (100µl de 10 ou 100 mg/kg, via oral) ou com veículo (20% tween 80 em salina), e com administração de LXA4 (0,1, 1 ou 10 ng/animal) ou veículo (etanol 3,2% em salina) a cada dois dias, por 30 dias. A hiperalgesia mecânica e térmica, inflamação e dosagens foram realizadas para avaliar os efeitos dos tratamentos. O tratamento com LXA4 também reduziu a hiperalgesia mecânica e térmica, dano histopatológico, edema e recrutamento de leucócitos sem induzir toxicidade. LXA4 reduziu a migração de leucócitos e modulou a produção de TNF-a, IL-1ß, IL-6 e IL-10. Esses efeitos foram explicados pela ativação reduzida do fator nuclear kappa B (NF-?B) nos leucócitos do líquido sinovial. A LXA4 melhorou os parâmetros antioxidantes (níveis reduzidos de glutationa [GSH] e 2,2-azino-bis 3-etilbenzotiazolina-6 sulfonato [ABTS], expressão do fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 [Nrf2]) reduzindo a detecção de espécies reativas de oxigênio [ROS] induzida por TiO2. Demonstramos o aumento da marcação do receptor ALX/FPR2 em neurônios TRPV1 positivos induzidos por TiO2. O tratamento com LXA4 modulou negativamente a ativação neuronal e a resposta à capsaicina (agonista TRPV1) e AITC (agonista TRPA1) de neurônios do GRD, além de reduzir expressão de TRPV1 e TRPA1 induzida por TiO2, bem como TRPV1 colocalizado com p-NF?B, indicando ativação neuronal. A curcumina reduziu a hiperalgesia mecânica e térmica, edema e alterações histopatológicas (pela coloração de hematoxilina-eosina [HE]) na articulação do joelho induzida por TiO2. A curcumina também reduziu o recrutamento de leucócitos (atividade de MPO e NAG, contagem total e diferencial), nível de IL-1ß e estresse oxidativo (peroxidação lipídica [TBARS], ânion superóxido [redução de nitroazul tetrazólio], bem como detecção de ROS e NO) induzido por TiO2 na articulação do joelho e líquido sinovial. A curcumina inibiu a ativação neuronal induzida por TiO2 e responsividade à capsaicina e AITC em neurônios DRG, diminuindo a marcação de TRPV1 em neurônios GRD, bem como TRPV1 colocalizado com p-NF?B. Concluindo, a curcumina e o LXA4 podem ter como alvo leucócitos recrutados e neurônios nociceptivos aferentes primários para exercer atividades analgésicas e anti-inflamatórias em um modelo de inflamação semelhante ao observado em pacientes com inflamação induzida por prótese.
Associação entre as variantes genéticas rs2241043, rs2241049 e rs6518661 do IL17RA e a suscetibilidade e gravidade da psoríase
(2023-07-18) Alcantara, Camila Cataldi de; Simão, Andréa Name Colado; Oliveira, Karen Brajão de; Amarante, Marla Karine; Bello, Valéria Aparecida; Luz, Tamires Flauzino; Almeida, Elaine Regina Delicato de; Oliveira, Sayonara Rangel
INTRODUÇÃO: A psoríase (PsO) é uma doença inflamatória crônica, mediada pelo sistema imunológico e de etiologia desconhecida. A resposta inflamatória normalmente tem início com um fator nocivo aos queratinócitos, estimulando a produção e secreção de citocinas. A indução da diferenciação das células T auxiliadoras dá início à uma produção de citocinas capazes de ativar e recrutar células do sistema imunológico para o local da lesão. Nesse microambiente, a Interleucina (IL) 17 exerce um papel primordial para a fisiopatologia da doença. O caráter multifatorial da PsO e a importância da IL-17 para a sua fisiopatologia evidenciam a necessidade de investigar como o fator genético pode influenciar na suscetibilidade à PsO e na resposta de pacientes aos novos tratamentos desenvolvidos contra essas moléculas. OBJETIVO: Revisar a literatura e avaliar a associação entre as variantes genéticas rs2241043, rs2241049 e rs6518661 do gene IL17RA e a suscetibilidade e gravidade da PsO. SUJEITOS E MÉTODOS: Este é um estudo caso-controle que incluiu 308 participantes de ambos os sexos, com idade entre 18 e 70 anos, sendo 154 pacientes com diagnósticos de PsO e 154 indivíduos saudáveis. O diagnóstico de PsO foi feito por um dermatologista e o Índice de Gravidade e Extensão das Lesões Psoriáticas (PASI) foi usado para determinar a gravidade da doença. Os dados clínicos, epidemiológicos e antropométricos foram obtidos durante consulta clínica através do preenchimento de uma ficha de avaliação previamente estabelecida. As variantes genéticas do gene IL17RA foram genotipadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando sondas TaqMan®. Três variantes genéticas localizados na região intrônica do IL17RA foram genotipados: T>C rs2241043, A>G rs2241049 e G>A rs6518661. RESULTADOS: Os pacientes com PsO eram mais velhos (p<0,001), tinham maior Índice de Massa Corporal (IMC) (p<0,001) e maiores níveis séricos de Proteína C Reativa (p<0,001) e Ferritina (p=0,002) quando comparados aos controles. A presença do alelo G em homozigose par o rs2241049 A>G demonstrou estar associado à proteção contra a PsO nos modelos dominante (OR=0,37, 95% IC 0,18-0,76, p=0,017) e recessivo (OR=0,39, 95% IC 0,20-0,76, p=0,005). A frequência do alelo A foi maior no grupo com PsO e o alelo C, no grupo controle (OR=0,799, 95% IC 0,67-0,95, p=0,0151). O genótipo CC do rs2241043 T>C demonstrou ser um fator de proteção contra o desenvolvimento de PsO grave (OR=0,30, 95% IC 0,10-0,093, p=0,020). Esta associação se manteve independentemente de idade, sexo, etnia e IMC (OR=0,303, 95% IC 0,095-0,965, p=0,043). A presença do alelo A em homozigose para o rs6518661 G>A demonstrou estar associado à proteção contra o desenvolvimento de PsO grave (OR=0,22, 95% IC 0,05-0,99, p=0,020). CONCLUSÃO: Este estudo demonstrou que o genótipo GG do IL17RA A>G rs2241049 é um fator protetor contra o desenvolvimento de PsO. Além disso, o alelo C em homozigose da variante IL17RA T>C rs2241043 e o genótipo AA do IL17RA G>A rs6518661 foram associados à proteção contra o desenvolvimento de PsO grave. Mais estudos são necessários para elucidar quais mecanismos genéticos e epigenéticos podem estar envolvidos nas associações, uma vez que esses genes estão localizados em regiões intrônicas.
Effects of standard of care drugs and resolvin D2 on cellular senescence in pulmonary fibrosis
(2022-05-10) Garcia, Stephanie Badaró; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Guarnier, Flávia Alessandra; Deminice, Rafael; Zuttion, Marília Sanches Santos Rizzo; Raposo, Larissa Staurengo Ferrari; Hogaboam, Cory M
Cellular senescence is pivotal in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) progression. Still, it is yet unknown the effects of standard-of-care (SOC) drugs nintedanib and pirfenidone on senescence lung fibroblasts. In addition, specialized pro-resolving lipid mediators have been shown to be effective at improving infection clearance and hold strong therapeutic potential in the management of COVID-19. However, its mechanisms of action on proliferative and senescent fibroblasts were not yet explored. In this study, we elucidated the effects of SOC drugs on senescent normal and IPF lung fibroblasts in vitro and the effects of Resolvin D2 on proliferative and senescent lung fibroblasts from normal and IPF patients. Colorimetric/fluorimetric assays, qRT-PCR, and western blotting were used to evaluate the effect of SOC drugs on senescent normal and IPF lung fibroblasts. SOC drugs did not induce apoptosis without death ligands in normal or IPF senescent cells. SOC drugs increased caspase-3 activity in the presence of FasL in normal but not in IPF senescent fibroblasts. Conversely, nintedanib enhanced Bcl-2 expression in senescent IPF lung fibroblasts. Moreover, in senescent IPF cells, pirfenidone alone induced MLKL phosphorylation, provoking necroptosis. In addition, fragmented gasdermin D, indicating pyroptosis, was not detected under any condition. In addition, SOC drugs increased transcript levels of fibrotic and senescence markers in senescent IPF fibroblasts, whereas D+Q inhibited all these markers. Finally, D+Q enhanced GDF15 transcript and protein levels in both normal and IPF senescent fibroblasts. Conversely, RvD2 drugs significantly decrease transcript levels of BIRC5, CCR10, COL1A1, COL3A1, FN1, GDF15, and WNT16 in senescent IPF fibroblasts. However, further studies are necessary to elucidate the therapeutic implications of RvD2 in IPF fully.
Mecanismos centrais envolvidos na hiperalgesia induzida pelos vírus Dengue e Chikungunya e proteína E2 do vírus Chikungunya em camundongos
(2019-07-31) Vendrameto, Carina Zerbetto Segato; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Guidoni, Ana Carolina Rossananeis; Borghi, Sérgio Marques; Dionísio, Andressa de Freitas Mendes; Kwasniewski, Fábio Henrique
As arboviroses Dengue e Febre Chikungunya são duas das viroses mais comuns afetando centenas de países por todo o mundo, seguindo a área endêmica de seus vetores, os mosquitos do gênero Aedes. Como não existem medicamentos específicos para ambas as viroses, novas estratégias terapêuticas são necessárias para tratar os principais sintomas como a dor por exemplo. Neste trabalho nós investigamos os mecanismos pelos quais estes vírus induzem dor e buscamos possíveis alvos terapêuticos para este sintoma. O vírus Chikungunya é conhecido por causar uma incapacitante dor articular que pode perdurar durante anos, mesmo após a eliminação completa do vírus, e nós investigamos se a proteína E2 do envelope viral pode estar envolvida nesse processo de indução da dor. Nossos resultados mostraram que o vírus inativado e a proteína E2 recobinante induzem hiperalgesia mecânica e térmica em camundongos, e o tratamento com anticorpos monoclonais anti-rE2 reduziu de forma efetiva a dor induzida pelos estímulos. Também observamos que na ausência ou bloqueio dos canais TRPV1 ocorre redução da hiperalgesia induzida pelo vírus inativado e pela proteína. Por último, encontramos que os neurônios dos gânglios da raiz dorsal apresentaram maior influxo de cálcio em nível basal após a estimulação com o vírus inativado e com a proteína recombinante, indicando ativação neuronal direta através destes estímulos. Pacientes infectados com dengue também apresentam a dor como um dos principais sintomas, então nós investigamos a participação de citocinas e das células da glia na indução da hiperalgesia após a infecção. Nossos dados mostraram que a infecção sistêmica com o vírus dengue induziu hiperalgesia mecânica, aumento na produção das citocinas TNF-a, IL-1ß e IL-10 e ativação de astrócitos e micróglias (aumento na expressão de mRNA para GFAP e Iba-1). O tratamento com moduladores destas citocinas e das células da glia confirmou de maneira efetiva a importância destas células e moléculas na hiperalgesia induzida pelo vírus Dengue em camundongos, demonstrando um grande potencial terapêutico que merece investigação futura.
Alterações morfológicas e fisiológicas no cólon de camundongos com retocolite ulcerativa aguda e crônica induzida por dextran sulfato de sódio
(2021-02-25) Watanabe, Paulo da Silva; Araújo, Eduardo José de Almeida; Fernandes, Glaura Scantamburlo A.; Melo, Gessilda de Alcantara Nogueira de; Sant Ana, Debora de Mello Gonçales; Santos, Armenio Aguiar dos
A doença inflamatória intestinal é uma inflamação recorrente que afeta o trato gastrointestinal, causando alterações na motilidade colônica. A evolução dessas alterações não é completamente compreendida e possivelmente está relacionada a sintomas que aparecem em diferentes graus da inflamação intestinal. Os estudos realizados em modelos animais para avaliar motilidade colônica usualmente utilizam apenas uma porção do cólon, e logo, os resultados geralmente não refletem as alterações que ocorrem em todo o órgão. Mais estudos são necessários para avaliar o desenvolvimento da colite, investigando as alterações causadas no epitélio intestinal e na parede do cólon, no modelo agudo e crônico da doença e investigar se essas alterações morfológicas interferem na motilidade de diferentes porções do cólon. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações estruturais e de motilidade do cólon durante o desenvolvimento da retocolite ulcerativa (RCU) aguda e crônica induzida por DSS em camundongos C57Bl/6. Os animais foram distribuídos em 5 grupos, sendo um grupo controle e os demais grupos expostos ao DSS 3% por 2, 5, 7 dias (RCU aguda) ou 2 semanas (RCU crônica). Durante a indução da RCU, os animais foram monitorados diariamente para obter o índice de atividade da doença (IAD). Após eutanásia, os cólons foram removidos e processados para análises histológicas e para as técnicas de imunofluorecência para avaliação de células tuft e neurônios mioentéricos. A motilidade do cólon foi determinada usando um aparelho de manometria convencional de perfusão multilúmen. De acordo com o IAD, o modelo foi eficaz em induzir a RCU tanto de forma aguda como crônica. Houve um aumento na espessura das camadas mucosa, submucosa, dos estratos da camada muscular, na parede total e redução no número de células tuft. Além disso, observou-se depleção de células caliciformes e um aumento na densidade de fibras de colágeno, bem como aumento numérico de neurônios colinérgicos no plexo mioentérico dos animais com RCU crônica. Tanto a população total como as subpopulações avaliadas de neurônios mioentéricos estavam atrofiadas nos grupos com RCU. A exposição progressiva ao DSS foi acompanhada de acúmulo de ajustes no padrão de motilidade colônica. O avanço da RCU provocou, dentre outros aspectos característicos de dismotilidade, redução no número de contrações, no número de complexos motores de migração colônica e no tempo total de trânsito gastrointestinal. De uma forma geral, a inflamação progressiva fez com que as contrações se tornaram mais vigorosas nas extremidades e mais longas na região medial do cólon. Concluímos que durante o progresso da RCU induzida por DSS ocorrem alterações estruturais no cólon, incluindo aumento no número de neurônios mioentéricos colinérgicos, seguidas de variações no padrão de motilidade de diferentes regiões do cólon que, em conjunto, caracterizam dismotilidade colônica
Níveis séricos de homocisteína e sua relação com o estresse oxidativo em pacientes com acidente vascular encefálico
(2019-08-07) Cossentini, Luana Aparecida; Simão, Andréa Name Colado; Bregano, José Wander; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Mari, Naiara Lourenço; Costa, Neide Tomimura; Dichi, Isaías
O acidente vascular encefálico (AVE) é uma das principais causas de 8 morbimortalidade em muitos paísese devido à suas sequelas apresenta 9 importantes implicações socioeconômicas. O AVE possui duas formas 10 principais de apresentação: o AVE isquêmico, o mais frequente, e o AVE 11 hemorrágico, o mais grave. No momento desses eventos o suprimento de 12 oxigênio e nutrientes diminui ou cessa por completo, causando danos ao tecido 13 cerebral caracterizado por morte celular rápida na microrregião. A reperfusão, 14 onde ocorre a retomada do fluxo sanguíneo, pode sobrecarregar a respiração 15 mitocondrial, levando a um pico na produção de espécies reativas de oxigênio 16 (ERO) pelas mitocôndrias causando cada vez mais danos. Estudo prévio com 17 pacientes com AVE isquêmico verificou a existência de valores de 18 homocisteína plasmáticos mais altos do que o relatado no grupo controle, o 19 que sugere a associação entre níveis de homocisteína plasmáticos e a 20 ocorrência de AVE. A homocisteína é um produto intermediário na biossíntese 21 normal dos aminoácidos metionina e cisteína. Está bem estabelecido que a 22 homocisteína plasmática elevada seja um fator de risco vascular. Objetivo: 23 Verificar os níveis de homocisteína sérica e do estresse oxidativo em pacientes 24 acometidos com AVE, atendidos no Hospital Universitário de Londrina – PR e 25 desenvolver uma revisão bibliográfica a cerca do assunto. Materiais e 26 Métodos: 170 pacientes com AVE e 220 controles saudáveis da mesma área 27 geográfica foram recrutados no Hospital Universitário de Londrina da 28 Universidade Estadual de Londrina. Inicialmente, foram comparados os níveis 29 de homocisteína dos pacientes com AVE e dos controles. A seguir, os 30 pacientes com AVE foram divididos em dois grupos de 85 pacientes 31 semhiperhomocisteínemia (<13,59µmol/L) e com (= 13,59µmol/L) 32 hiperhomocisteínemia. Os dados demográficos e os biomarcadores 33 inflamatórios foram analisados nos dois gruposdepacientes com AVE sem e 34 com hiperhomocisteínemia. Os pacientes foram classificados segundo a escala 1 de Rankin, q a qual determina o estado físico do paciente. Para a revisão foram 2 selecionados artigos de 1996 a 2019, disponíveis na base de dados Pubmed e 3 LILACS, optou-se pela busca por termos livres, sem o uso de vocabulário 4 controlado (descritores). Resultados: Os pacientes com AVE apresentaram 5 altos níveis de homocisteinemia quando comparados com o grupo controle 6 (p<0,001) ajustado para as variáveis sexo, etnia e idade. Em análise posterior, 7 quando os grupos foram divididos de acordo com os níveis de homocisteína, 8 houve diferenças significativas em relação ao sexo (p <0,001), escala 9 modificada de Rankin no início do estudo (p<0,034) e glicose (p <0,020). Em 10 análise dos marcadores de estresse oxidativo verificou-se tendência à 11 diminuição nos níveis de NOx (p <0,071) eum significativo aumento no TRAP 12 (p <0,003) no grupo de pacientes com hiperhomocisteinemia. Após a 13 realização das análises de regressão logística binomial verificou-se que glicose 14 (0,017) e TRAP (p <0,019) foram independentemente associados à hiper-15 homocisteinemia em pacientes com AVE. Conclusão: Pacientes com AVE 16 apresentam altas taxas de homocisteína sérica. TRAP e 17 glicemiaestãoassociados à hiper-homocisteinemia. Com o artigo de revisão 18 concluímos que existe uma grande quantidade de referências sobre o estudo 19 do AVE, entretanto são escassos quando o assunto é a relação entre AVE, 20 estresse oxidativo e homocisteína, tornando de grande importância a pesquisa 21 e publicações que ampliem essa discussão.
Efeito do diabetes e exposição hiperglicêmica na susceptibilidade à leishmaniose experimental
(2022-03-04) Silva, Taylon Felipe; Conchon-Costa, Ivete; Kwasniewski, Fábio Henrique; Tomiotto-Pellissier, Fernanda; Bordignon, Juliano; Miranda-Sapla, Milena Menegazzo
A leishmaniose é um grupo de doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania e sua imunopatogênese resulta de fatores do hospedeiro e do parasita que desencadeiam uma resposta imune desequilibrada durante a infecção. O diabetes é uma doença crônica resultante da disfunção da produção de insulina pelo organismo ou da capacidade de utilizá-la adequadamente, levando à hiperglicemia, cujo descontrole crônico causa diversas lesões nos tecidos e prejudica o sistema imunológico. Assim, devido ao delicado equilíbrio imunológico necessário no combate e resistência à infecção por Leishmania e a desregulação crônica da resposta inflamatória observada no diabetes, o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de PBMC de pacientes diabéticos, de celulas de linhagem THP-1 exposta a um ambiente hiperglicêmico e camundongos C57BL/6 diabéticos contra a infecção por Leishmania amazonensis e como essas condições alteram a resposta imune frente ao parasito. Para isso, foi coletado sangue periférico de 25 pacientes diabéticos e 25 controles saudáveis para extração de PBMC e posterior infecção experimental com Leishmania amazonensis por 2 ou 24 h, após isso foi analisada a capacidade leishmanicida e a resposta imune dessas células. Também realizamos um modelo de estímulo hiperglicêmico in vitro com células THP-1 e as infectamos com a mesma espécie de parasito por diversos tempos. Além disso, induzimos diabetes experimental com streptozotocina (STZ) em camundongos C57BL/6 e avaliamos a infecção cutânea no coxim plantar por 5 semanas. Observamos que o diabetes e a hiperglicemia prejudicam a capacidade leishmanicida de PBMC e macrófagos derivados de células THP-1, principalmente por manter o efeito antioxidante do NRF2 e aumentar a atividade das enzimas sequestradoras de radicais livres SOD e catalase, respectivamente, além de reverter o perfil de resistencia que camundongos C57BL/6 apresentam frente a infecção por L. amazonensis, induzindo lesões mais exacerbadas em comparação a animais não diabéticos. Além disso, o estímulo hiperglicêmico favoreceu o aumento de marcadores relacionados ao fenótipo de macrófagos M2 de maneira mediada pelo parasito. No mesmo sentido, a indução de diabetes experimental em camundongos C57BL/6 resultou em falha na produção de oxido nitrico (NO) frente a infecção, além de gerar uma respota semelhante a Th2/Th2 nestes animais, em comparação com animais controle que geraram uma respota semelhantente o perfil Th1. Ainda observamos que macrófagos de animais diabéticos falharam em processar e apresentar antígenos de Leishmania durante a infecção, sendo incapazes de ativar e induzir a proliferação de linfócitos antígeno-específicos. Juntos, esses dados demonstram que o diabetes e a hiperglicemia podem prejudicar a resposta imune celular, principalmente dos macrófagos, contra a infecção por parasitas do gênero Leishmania.
Avaliação transgeracional do efeito da exposição materna a mistura de ftalatos sobre parâmetros testiculares e epididimários de ratos machos pré-púberes e adultos.
(2022-10-20) Umbelino, Ana Paula Franco Punhagui; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Brajão, Karen; Guerra, Marina Trevisan; Perobelli, Juliana Elaine; Borges, Fernando Henrique; Scarano, Wellerson Rodrigo
Ftalatos são compostos químicos derivados do ácido ftálico em que são utilizados amplamente na indústria para garantir a flexibilidade do plástico, como em utensílios domésticos, cosméticos e brinquedos. Devido ao aumento na utilização de produtos compostos por ftalatos pelo ser humano diversos estudos têm sido realizados para avaliar os efeitos imediatos, tardios e transgeracionais dos ftalatos em animais pré- púberes e adultos, principalmente os efeitos sobre funções reprodutivas. Isto posto, o objetivo do presente estudo é verificar se a mistura de ftalatos é capaz de alterar o desenvolvimento testicular e epididimário de ratos machos em idade neonatal e adulta em duas gerações. Para isso, a mistura contém dietil-ftalato, di-(2-etilhexil)-ftalato, dibutil-ftalato, di-isononil-ftalato, di-isobutil-ftalato, e benzil-butil-ftalato. As fêmeas grávidas da linhagem Sprangue-Dawley foram divididas em 4 grupos e doseadas oralmente diariamente de DG10 a DPN21 com óleo de milho (Control:C) ou a mistura de ftalato em três doses (20µg/kg/d:T1; 200µg/kg/d:T2; 200mg/kg/d:T3). Após o período de tratamento, os machos da geração F1 foram submetidos à eutanásia em dois períodos, com DPN22 e DPN120. Os machos F1 com DPN90 foram acasalados com fêmeas não expostas para obtenção da geração F2, em que os machos com DPN22 foram submetidos à eutanásia. Foram coletados ducto deferente, epidídimo, próstata e testículo para dados de peso. Os testículos e epidídimos foram coletados para análise histológica e gênica. A análise histopatológica dos órgãos manteve semelhante entre os grupos, bem como a morfometria testicular de ratos F1 DPN120. No testículo podemos observar aumento de espermatozoides com anormalidade de cabeça na menor dose e alterações nos estágios da dinâmica espermatogênica em todas as doses de ftalato. A contagem de células de Sertoli não teve alteração significativa nos animais F1 DPN22, reduziu nas menores doses nos animais F1 DPN120 e manteve essa redução nas maiores doses nos animais F2 DPN22. A contagem de células de Leydig aumentou nas maiores doses nos animais F1 DPN22, diminuiu nos animais F1 DPN120 e não teve alteração nos animais F2 DPN22. O diâmetro dos túbulos seminíferos aumentou nos animais de DPN22 em todas as doses de ftalato. O padrão de expressão gênica de GPR30, HSD3B1, CYP19A1, BCL2 e PUMA ficaram praticamente inalterados nos animais F1 DPN22, reduziu nos animais F1 DPN120 e reduziu mais ainda nos animais F2 DPN22. No epidídimo podemos observar remodelamento tecidual na esterologia epididimária, e alteração na expressão gênica de GPR30, GPX3, GSR, IL10 e TNFa. Com isso podemos concluir que a mistura de ftalatos é capaz de causar danos significativos em tecido testicular e epididimário em efeito imediato, tardio e transgeracional.
Avaliação do potencial analgésico e antinflamatório das maresinas em modelos experimentais de atrite [i.e. artrite] e colite ulcerativa.
(2022-10-25) Franciosi, Anelise; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Kwasniewski, Fábio Henrique; Borghi, Sérgio; Rossaneis, Ana Carolina; Campos, Cássia Calixto de
A dor é uma experiência sensorial e emocional desagradável, produto do processo inflamatório que pode acometer indivíduos em diversas situações, sendo na maioria delas um agente incapacitante. O processo inflamatório e dor foram avaliados através dos modelos experimentais de artrite induzida por dióxido de titânio (TiO2) e modelo de colite ulcerativa (CU) induzida por ácido acético. Para investigar o objetivo de avaliação do potencial analgésico e anti-inflamatório, foram utilizados mediadores lipídicos pró resolução, as maresinas 1 (MaR1) e 2 (MaR2), como abordagem terapêutica. A artrite foi induzida em camundongos com Titânio (TiO2) intra-articular (i.a) (3mg/articulação). Após 24 horas, os animais foram tratados com MaR1 (1, 3 e 10ng – intraperitoneal i.p), e os tratamentos seguiram até o 30º dia pós indução. Ao longo dos 30 dias, a dose-resposta da droga foi avaliada pela realização de testes comportamentais (hiperalgesia mecânica e térmica, avaliação de incapacitação estática). Foi escolhida a dose de 10ng para o tratamento devido sua eficácia pelo período de 72 horas. A avaliação da ativação de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) por imageamento de cálcio foi realizado no segundo dia (48 hr) pós indução. Outros parâmetros inflamatórios foram avaliados como o edema, o recrutamento de leucócitos no lavado articular foram avaliados durante os 30 dias, e após a eutanásia respectivamente. Parâmetros histológicos como o recrutamento celular, hiperplasia sinovial, neovascularização e degradação da cartilagem, demonstraram a capacidade anti-inflamatória da MaR1. A MaR1 mostrou-se uma excelente abordagem terapêutica, já que não confere toxicidade gástrica, hepática ou renal, atuando ainda na modulação de hiperalgesia e inflamação. A CU foi desencadeada em camundongos com ácido acético (AAC) intraperitoneal (i.p) (na concentração de 6%). Os camundongos foram tratados com MaR2 (300pg e 3ng/animal) antes e após a indução da inflamação com ácido acético via intraretal. Para observar o potencial analgésico e anti-inflamatório por meio da droga-resposta, foram avaliados a hiperalgesia mecânica visceral, e atividade da mieloperoxidase (MPO). Devido a sua eficácia, escolheu-se a dose de 3 ng, e assim o efeito anti-inflamatório foi avaliado por parâmetros histológicos como a destruição das células caliciformes, a atrofia das criptas, distanciamento das camadas musculares e mucosa, o recrutamento de leucócitos e mastócitos. Foi avaliada população de macrófagos no tecido colônico por meio de imunomarcação de F4/80 para macrófagos, e iNOS para células produtoras de óxido nítrico sintase induzível (iNOS). A MaR2 age como analgésica reduzindo a hiperalgesia mecânica visceral, e anti-inflamatória diminuindo o recrutamento celular e os demais parâmetros histológicos, bem como a quantidade de macrófagos positivos para iNOS no tecido colônico. Conclui-se que as Maresinas são potencias alternativas terapêuticas, tanto na inflamação aguda causada pela colite induzida por ácido acético, quanto na inflamação crônica, produto da artrite induzida pelo TiO2.
Efeito protetor da maresina 2 (MaR2) e da resolvina D5 (RvD5) em modelo de endotoxemia induzido pelo lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos.
(2022-05-25) Cardoso, Renato Daniel Ramalho; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Pinge Filho, Phileno; Ferrari, Larissa Staurengo
Os mediadores lipídicos pró-resolução (SPMs) têm a capacidade de regular e reduzir a resposta inflamatória através de diferentes vias, modulando a produção de citocinas pró-inflamatórias, inibindo o recrutamento de células inflamatórias e diminuindo a lesão mediada por espécies reativas de oxigênio (EROs). Portanto, considerando o potencial protetor, anti-inflamatório e antioxidante desses mediadores lipídicos, e que a endotoxemia via LPS pode induzir lesões inflamatórias e oxidantes, entende-se que esses mediadores possuem potencial para serem utilizados terapeuticamente em casos de endotoxemia. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o efeito terapêutico dos mediadores lipídicos pró-resolução Maresina 2 (MaR2) e Resolvina D5 (RvD5) em um modelo de endotoxemia induzida por LPS. Os animais foram tratados com MaR2 (1ng ou 10 ng/animal) ou RvD5 (0,1ng, 1ng ou 10 ng/animal) 60 minutos antes de receber LPS (10mg/kg) por via intravenosa. O sangue foi coletado por punção cardíaca 6 horas após o tratamento e os níveis séricos da ureia, creatinina, ALT e AST foram quantificados. A atividade da MPO e da NAG foram observadas no fígado, pulmões e rins, bem como os níveis de citocinas pró-inflamatórias. Os testes de FRAP, ABTS, GSH, TBARS e NBT foram realizados nos mesmos órgãos para avaliar a capacidade antioxidante total dessas amostras e para observar a atividade e lesão oxidativa. Além disso, fígado, pulmões e rins foram avaliados histologicamente e o resultado foi quantificado por meio de um escore histopatológico. Demonstramos que a MaR2 diminuiu os níveis séricos de ureia e creatinina, atuando de forma protetora, principalmente nos rins, moderando a atividade inflamatória, aumentando a capacidade antioxidante total dessas amostras, diminuindo os níveis de peroxidação lipídica e evitando alterações histológicas severas. Portanto, a MaR2 demonstrou um papel protetor nos rins, reduzindo a inflamação e o estresse oxidativo. Em paralelo, a RvD5 exerceu atividade protetora renal, pulmonar e hepática com melhora dos parâmetros histológicos, diminuição dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, redução da peroxidação lipídica e dos da produção do ânion superóxido. Além disso, a RvD5 também reduziu a atividade de NAG e MPO, restaurou os níveis de antioxidantes totais, assim como os níveis de GSH. Portanto, nossos dados sugerem que MaR2 e RvD5 seriam uma possibilidade terapêutica para endotoxemia/choque endotoxêmico.
A exposição ao cyantraniliprole prejudica parâmetros reprodutivos masculinos na idade juvenil e parâmetros femininos na idade adulta em ratos wistar
(2021-06-25) Scarton, Suellen Ribeiro da Silva; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Arena, Arielle Cristina; Ceravolo, Graziela Scalianti; Goes, Rejane Maira; Beu, Célia Cristina Leme
O Brasil é um dos países que mais utiliza agrotóxicos no mundo e conta com legislação favorável a liberação de compostos de ação pouco conhecida sobre o organismo de mamíferos ou banidos em outras regiões do mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do inseticida Cyantraniliprole sobre parâmetros reprodutivos masculino e feminino de ratos Wistar púberes e adultos, após autorização OF. CIRC. CEUA nº134/2017, processo n° CEUA-UEL 211.062017-4. Em todos os experimentos o Cyantraniliprole foi utilizado em baixa dose de 10 mg / kg (grupo Low dose – LD) ou alta dose 150 mg / kg (grupo High dose – HD), água de torneira foi utilizada como veículo. No primeiro experimento machos, no dia pós-natal (DPN) 21, foram distribuídos nos grupos LD, HD ou controle (C), que recebeu somente veículo. O exposição se iniciou no DPN25, via intragástrica e a eutanásia ocorreu por saturação anestésica no DPN67. Espermatozoides foram coletados do ducto deferente para as análises de atividade mitocondrial da peça intermediaria, atividade da colinesterase – ChE, peroxidação lipídica – LPO, atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase - G6PD e atividade da malato desidrogenase – MDH. No segundo experimento machos, DPN21, foram distribuídos nos grupos exposição: LD, HD e C. O tratamento se iniciou no DPN25, via intragástrica. A eutanásia de metade dos animais de cada grupo ocorreu por saturação anestésica no DPN67. Os outros animais de cada grupo foram mantidos vivos por mais 42 dias, sem receber o cyantraniliprole, originando os grupos recuperação, a eutanásia desses animais ocorreu por saturação anestésica no DPN110. De todos os grupos foram coletados plasma para determinação da concentração de testosterona. Os testículos foram pesados e utilizados para contagem espermática, avaliação do sistema antioxidante e de parâmetros histológicos e estereológicos. Espermatozoides do ducto deferente foram utilizados para avalição morfológica. No terceiro experimento, os efeitos do cyantraniliprole foram observados em fêmeas adultas, DPN67, distribuídas nos grupos C, LD e HD (n=6 por grupo). A eutanásia ocorreu no DPN95, foram coletados sangue, para dosagem de progesterona, útero e ovários para avaliação morfométrica e histopatológica, contagem de folículos ovarianos e marcadores bioquímicos de estresse oxidativo. Foi realizada a mensuração da massa (g) do fígado, rins, glândulas hipófise e adrenal. A concentração de progesterona e o peso do útero, ovário, fígado, rins, glândula adrenal e a foram maiores em LD. O número de ciclos estrais diminuiu e a duração do ciclo aumentou nos animais HD. O epitélio glandular do útero foi maior e o número de folículos ovarianos, primordial + primário, pré-antral, antral e atrésico foi reduzido em LD. A análise histopatológica revelou a ocorrência de metaplasia do epitélio luminal do útero com presença de mitose e polimorfismo das células do epitélio glandular, além da presença de infiltrado inflamatório no endométrio. Nos ovários, vasos sanguíneos congestos e hiperplasia da rete ovarii foram observados. A atividade da colinesterase no útero foi menor em ambas as doses. Maior ocorrência de lipoperoxidação e da atividade da enzima SOD ocorreram apenas em LD, e a atividade da GST foi aumentada em LD e HD. No ovário, a atividade da colinesterase foi aumentada nos animais tratados com ambas as doses, e a atividade da GPx foi maior apenas com LD. Como resultados observamos que no primeiro experimento a atividade mitocondrial e da MDH diminuíram nos espermatozoides expostos a LD, sem o aumento da peroxidação lipídica. A atividade da G6PDH e da ChE foram similar entre os grupos. No segundo experimento a atividade do sistema antioxidante entre os grupos exposição e recuperação foi similar, no entanto a produção de testosterona in vitro aumentou em LD e HD e diminuiu em LDR e HDR. O número de células de Sertoli foi menor em todos os grupos que receberam cyantraniliprole tanto na fase de exposição como na recuperação. A fase I-V do ciclo do epitélio seminífero foi aumentada e a fase VII-VIII, diminuída nos grupos que receberam o tratamento nos dois períodos. A proporção do lúmen e estroma foi maior, e do epitélio menor, apenas em LD, no entanto o número de espermatozoides por grama de testículo e a produção diária de espermatozoides foi diminuiu nos animais que receberam ambas as doses de cyantraniliprole, independente da fase do experimento. Como consequência o número de espermatozoides normais foi menor nos grupos que receberam Cyantraniliprole em relação ao controle. As principais anormalidades morfológicas observadas nos espermatozoides foram: falta de curvatura e cabeças isoladas, caudas quebradas e enroladas, e falta de integridade do acrossoma. No terceiro experimento, a concentração de progesterona e o peso do útero, ovário, fígado, rins, glândula adrenal foram maiores em LD. O número de ciclos estrais diminuiu e a duração do ciclo aumentou nos animais HD. O epitélio glandular do útero foi maior e o número de folículos ovarianos, primordial + primário, pré-antral, antral e atrésico foi reduzido em LD. A análise histopatológica revelou a ocorrência de metaplasia do epitélio luminal do útero com presença de mitose e polimorfismo das células do epitélio glandular, além da presença de infiltrado inflamatório no endométrio. Nos ovários, vasos sanguíneos congestos e hiperplasia da rete ovarii foram observados. A atividade da colinesterase no útero foi menor em ambas as doses. Maior ocorrência de lipoperoxidação e da atividade da enzima SOD ocorreram apenas em LD, e a atividade da GST foi aumentada em LD e HD. No ovário, a atividade da colinesterase foi maior nos animais tratados com ambas as doses, e a atividade da GPx foi maior apenas com LD. Esses resultados mostram que a baixa dose de cyantraniliprole prejudicou a membrana celular e a produção de energia dos espermatozoides e que os danos gerados pela exposição ao cyantraniliprole na puberdade foram mantidos ou acentuados, mesmo após o período de recuperação, ou seja, na vida adulta. O trato genital feminino também sofreu alterações, o que pode representar prejuízos fertilidade a esses indivíduos.

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