01 - Doutorado - Patologia Experimental
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Item Produção e aplicação de anticorpos IGY anti-nucleoproteína para detecção do vírus influenza A em suínosSilva, Miriele Caroline da; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Itano, Eiko Nakagawa; Fernandes, Eduardo Vignoto; Loyola, WagnerResumo: Os anticorpos são importantes ferramentas em testes de diagnóstico A utilização de anticorpos IgY apresenta diversas vantagens em relação aos anticorpos de mamíferos e vários estudos mostram sua aplicação em técnicas de imunodiagnóstico Assim, esse trabalho teve como objetivo produzir anticorpos IgY anti-nucleoproteína do vírus influenza A (IAV) e avaliar sua aplicação na detecção do vírus IAV por imunocitoquímica (ICQ) e imunohistoquímica (IHQ) Para tanto, galinhas poedeiras da linhagem White Leghorn foram inoculadas com 2 µg da nucleoproteína (NP) nos dias 1, 14, 28, 42, 84, 126 e 168 do experimento Sete dias após a 3ª, 5ª e 7ª inoculação, os ovos foram coletados e os anticorpos IgY foram extraídos por precipitação com sulfato de amônio Os títulos e a especificidade dos anticorpos purificados foram determinados por ELISA, western blotting, ICC e IHC As galinhas poedeiras inoculadas com a proteína NP produziram altos níveis de anticorpos específicos anti-NP após a 7ª inoculação Além disso, foi detectada uma coloração positiva em células MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) infectadas com IAV e incubadas com anticorpo IgY anti-NP No entanto, em tecidos pulmonares de suínos infectados não foi observada nenhuma coloração através do teste IHC Os dados obtidos mostraram que os anticorpos IgY anti-NP purificados das gemas de ovos se ligam especificamente ao IAV, com o reconhecimento dos principais subtipos de vírus circulantes em suínos (H1N1, H1N2 e H3N2), reforçando sua utilidade no diagnóstico de IAVItem Mecanismos envolvidos na hiperalgesia mecânica induzida pelo fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) em camundongos e participação da IL-33 em modelo de doença de KawasakiCarvalho, Thacyana Teixeira de; Verri Junior, Waldiceu Aparecido [Orientador]; Campos, Cássia Calixto de; Ceravolo, Graziela Scalianti; Borghi, Sérgio Marques; Pavanelli, Wander RogérioResumo: O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é a abordagem terapêutica atual para aumentar a contagem de neutrófilos periféricos pós-quimioterapia A dor é o efeito adverso mais relevante da terapia com G-CSF Contudo, os mecanismos envolvidos nesta hiperalgesia ainda não foram completamente elucidados Este estudo investigou a participação das citocinas TNF-a, IL-1ß e IL-1, do NF?B e da via Nrf2/HO-1 na hiperalgesia induzida pelo G-CSF em camundongos O G-CSF induziu significativa hiperalgesia mecânica nos camundongos que foi reduzida pelo tratamento com etanercepte, IL-1ra, talidomida, pentoxifilina e rutina, também reduzida em camundongos deficientes para o receptor do TNF- a (TNFRI) Camundongos deficientes na citocina IL-1 apresentaram maior hiperalgesia após estímulo com G-CSF Além disso, o tratamento com talidomida e pentoxifilina inibiu a produção de TNFa, IL-1ß e IL-1 induzido pelo G-CSF no tecido plantar; o tratamento com rutina inibiu a produção de TNFa e IL-1ß e aumentou a produção de IL-1 O G-CSF induziu a ativação de NF?B e reduziu a expressão do RNAm de Nrf2 O tratamento com rutina inibiu a ativação de NF?B e aumentou a expressão do RNAm de Nrf2 e HO-1 O tratamento combinado da morfina ou indometacina com talidomida, pentoxifilina ou rutina, em doses que são ineficazes per se, inibiu a hiperalgesia induzida pelo G-CSF E ainda, o tratamento com estas drogas não afetou a mobilização de neutrófilos para o sangue periférico induzido pelo G-CSF Os presentes resultados indicam que a dor induzida pelo G-CSF pode se dar por mediar a produção periférica de citocinas pró-nociceptivas, TNF-a e IL-1ß, e sub-regular a citocina anti-nociceptiva IL-1, ativando o fator de transcrição NF?B e inibindo o Nrf2 Além disso, o tratamento com drogas que inibem citocinas ou flavonoides, como a rutina, são abordagens promissoras para o tratamento da dor induzida pelo G-CSF sem interferir no efeito terapêutico de mobilização de neutrófilos para o sangue periférico A doença de Kawasaki (KD) é uma doença inflamatória multissistêmica que afeta crianças menores de 5 anos de idade e leva a formação de aneurismas nas artérias coronárias e aorta abdominal (AA), sendo a principal causa de vasculite em países desenvolvidos A IL-33 é uma citocina membro da família da IL-1 que foi demonstrada estar aumentada no soro de pacientes com KD mesmo após tratamento, porém não são conhecidos os mecanismos envolvidos na participação da IL-33 nesta doença Neste estudo, o papel da IL-33 no modelo de vasculite induzida pelo Extrato da Parede Celular de Lactobacillus casei (LCWE) foi avaliado em camundongos Foi demonstrado que o gene da il33 estava aumentado no coração e na AA dos camundongos estimulados com LCWE A neutralização da IL-33 com anticorpo anti-IL-33, reduziu a formação das lesões na artéria coronária e dos aneurismas na AA induzidos pelo LCWE A expressão de IL-33 estava aumentada na AA e as células produtoras desta citocina neste modelo não são os macrófagos Não houve diferença na produção e na expressão do receptor de IL-33 (ST2) no soro e na AA, respectivamente Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a IL-33 tem um papel importante no desenvolvimento das lesões induzidas pelo LCWE, no entanto, mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos e células envolvidos neste processoItem Exposição aos agrotóxicos e níveis plasmáticos de cortisol, citocinas e perfil redox em pacientes com câncer de mamaKawassaki, Aedra Carla Bufalo; Pavanelli, Wander Rogério [Orientador]; Grassiolli, Sabrina; Mantovani, Mário Sérgio; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Pinge, Marli Cardoso Martins; Panis, Carolina [Coorientadora]Resumo: O câncer de mama é conhecido pela sua alta incidência entre as mulheres no mundo e muito já se conhece sobre os diversos fatores envolvidos no seu surgimento e desenvolvimento Entre os fatores ambientais, os agrotóxicos vêm ganhando destaque por se mostrarem capazes de atuar na progressão tumoral e gerar quadros de pior prognóstico Vários mecanismos de lesão ao DNA podem estar envolvidos, mas, pouco se sabe sobre os efeitos dos pesticidas nos níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias, hormônios e substâncias envolvidas com o perfil redox, as quais são importantes no contexto da carcinogênese, e, a relação destas substâncias com características prognósticas importantes no câncer de mama Além disso, fatores relacionados ao estilo de vida das pacientes, como a obesidade, também parecem contribuir para um desfecho de pior prognóstico, principalmente pela existência de um ambiente pró-inflamatório de baixo grau crônico instalado, o qual promove alterações hormonais importantes, como no eixo do cortisol Assim este trabalho teve como objetivos: avaliar se mulheres portadoras de câncer de mama expostas cronicamente aos agrotóxicos apresentam relação entre desregulação imunoendócrina e desbalanço redox com desfechos de pior prognóstico e, analisar a correlação dos níveis de cortisol sistêmico e parâmetros de pior prognóstico em pacientes com câncer de mama, levando em consideração a categorização das pacientes de acordo com IMC (Índice de Massa Corpórea) A população de estudo foram mulheres com indicativo de câncer de mama atendidas no Hospital do Câncer de Francisco Beltrão, Paraná, Brasil, entre os períodos de 215 e 217 Durante a cirurgia para retirada de material para biópsia, no período das 14 às 17 horas, amostras de sangue (1 mL) foram coletadas assim como, das pacientes com diagnóstico positivo para câncer de mama também foram coletadas características clinicopatológicas dos prontuários médicos Todos os dados foram analisados através do Graph Pad Prism 7 e SPSS Statistic 2, considerando significância estatística p= ,5 Para demonstrar se há relação dos agrotóxicos com marcadores endócrinos, imunológicos e de estresse oxidativo, iniciamente as pacientes (n=73), que responderam a um questionário sobre exposição direta aos agrotóxicos, foram categorizadas como expostas ou não-expostas Das amostras de sangue destas pacientes foram dosados: cortisol, citocinas (TNF-a e IL-1ß) e o perfil redox (hidroperóxidos, NO e TRAP), para posterior correlação com parâmetros clinicopatológicos Observamos que os níveis de TNF-a, cortisol e TRAP variaram em relação ao status menopausal das pacientes Os níveis de TNF-a e TRAP foram aumentados nas pacientes menopausadas não expostas aos pesticidas quando comparadas às expostas (p=,443 e p=,488, respectivamente) Já nas pacientes na pré-menopausa, estas apresentaram um aumento significativo nos níveis de cortisol no grupo não exposto em relação aos expostos (p=,262) Ao contrário, o TRAP nas mulheres na pré-menopausa expostas apresentaram níveis aumentados em comparação com as não expostas (p=,6) Além disso, as pacientes não expostas portadoras de tumores de grau 2 apresentaram níveis reduzidos de hidroperóxidos quando comparadas as pacientes expostas do mesmo grau (p=,488) Outra diferença observada foi à redução dos níveis de TNF-a nas pacientes expostas quando comparadas as não expostas, em relação a presença de êmbolos angiolinfáticos (p = ,128) Em relação a IL-1ß, pacientes obesas não expostas apresentaram níveis aumentados em relação às expostas aos pesticidas (p=,247) Desta forma, podemos concluir que a exposição crônica aos pesticidas em mulheres com câncer de mama pode contribuir com desfechos de pior prognóstico, em decorrência de desregulação imunoendócrina e redox, influenciada principalmente pelo status menopausal das pacientes Em seguida, foi analisado se o nível de cortisol plasmático está associado a parâmetros de pior prognóstico quando as pacientes são categorizadas de acordo com o IMC (n=115), sem levar em consideração a exposição aos agrotóxicos Observou-se que o cortisol sistêmico foi significativamente aumentado nas pacientes com câncer de mama obesas em relação às eutróficas (p=,51) Pacientes obesas apresentaram cortisol elevado em associação com tumor Luminal B em relação às eutróficas (p=,211) e as sobrepesos (p=,191), enquanto as sobrepesos apresentaram níveis elevados de cortisol em associação com tumores Triplo Negativo em relação às eutróficas (p=,31) e as obesas (p=,296) Além disso, a presença de metástase linfonodal, de êmbolos angiolinfáticos e de tumores de alto grau foi relacionada com níveis aumentados de cortisol sérico em pacientes com excesso de peso corporal Assim, IMC elevado parece ter um efeito negativo sobre o câncer de mama, levando em consideração os níveis de cortisol sérico e parâmetros de pior prognósticoItem Polimorfismos intrônicos no gene do fator de transcrição FOXP3 e níveis da IL-10 como biomarcadores de susceptibilidade e prognóstico na oncogênese cervical induzida pelo HPVSantos, Fernando Cezar dos; Oliveira, Karen Brajão de [Orientador]; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Kishima, Marina Okuyama; Amarante, Marla Karine; Losi-Guembarovski, RobertaResumo: A infecção persistente pelo papilomavírus humano (HPV) de alto risco (hrHPV) inicia e, em conjunto com outros fatores, promove a carcinogênese na cérvice uterina, a progressão para lesões intraepiteliais escamosas (SIL) e consequentemente para câncer de colo de útero (CCU) Ainda que o vírus seja bem-sucedido em causar infecção produtiva no hospedeiro, sua presença é notada pelo sistema imune, que é hábil em estabelecer respostas epiteliais de defesa eficientes e eliminar o vírus No entanto, ao longo da evolução, o HPV desenvolveu a capacidade de se evadir da resposta imune, modulando a dinâmica imunológica, especialmente de células T, a seu favor Alvo desses mecanismos de evasão são as células T regulatórias (Treg), identificadas pela expressão constitutiva do fator de transcrição forkhead box P3 (FOXP3) Estas células possuem atividade supressora sobre respostas efetoras e contribuem para a persistência da in-fecção e progressão tumoral Neste contexto, variantes genéticas no gene FOXP3 podem alterar seus níveis intracelulares e sua função, estando associadas à diversas doenças humanas Desta forma, este estudo objetivou analisar os polimorfismos genéticos rs2232365 e rs3761548 em mulheres infectadas pelo HPV e portadoras de SIL e mulheres não infectadas livres de lesões e buscar uma possível correlação entre estes polimorfismos e os níveis plasmáticos e cervicais da interleucina 1 (IL-1) A detecção e genotipagem do HPV e genotipagem dos polimorfismos genéticos de FOXP3 foram realizadas através da técnica de reação em cadeia da polimerase seguida de digestão enzimática (PCR RFLP) A dosagem da IL-1 foi realizada pelo ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura O genótipo homozigoto do polimorfismo rs3761548 (A/A) (relacionado à diminuição da expressão de FOXP3) é um bom preditor de proteção na infecção pelo HPV em mulheres (ORAj = 6; IC95% = 36 – 99; p = 49); este genótipo é também um preditor independente de proteção para o desenvolvimento de lesão intraepitelial de alto grau (HSIL) (ORAj = 28; IC95% = 11 – 68; p = 6) Além disso, o genótipo homozigoto (G/G) do polimorfismo rs2232365 (relacionado ao aumento da expressão de FOXP3) mostrou ser um fator de risco independente para a infecção por HPV (ORAj = 21; IC95% = 16 – 415; p = 33) A análise de haplótipos não mostrou associação significativa em nosso estudo Além disso, não foram detectadas diferenças significativas entre os genótipos do FOXP3 e os níveis de IL-1 em nosso estudo Nós sugerimos que a presença de alelos poli-mórficos do gene FOXP3 não afeta a expressão de IL-1 O presente estudo demonstrou, pela primeira vez, associações significativas entre variantes genéticas de FOXP3 e a infecção por HPV e diagnóstico de SIL Estes dados revelam que o uso dos polimorfismos de FOXP3 podem ser úteis na prática clínica como marcadores moleculares de susceptibilidade e prognóstico à infecção pelo HPV e ao câncer de colo do útero, respectivamenteItem Perfil da recuperação do pâncreas e rins de ratos wistar diabéticos tratados com fração acetato de etila de Trichilia catigua : análise bioquímica, morfologia tecidual e estado redoxPaulo, Luis Fernando de; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Araújo, Eduardo José de Almeida; Tonon, Jair; Perles, Juliana Vanessa Colombo Martins; Luiz, Rodrigo Cabral; Zanoni, Jacqueline Nelisis [Coorientador]Resumo: O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica de distribuição mundial, e caracteriza-se pela deficiência ou não produção de insulina pelas células ß pancreáticas Essa deficiência apresenta como principal resultado a hiperglicemia crônica, que por sua vez produz alterações metabólicas e sistêmicas O diabetes apresenta 4 tipos básicos: o DM Tipo 1, DM Tipo 2, Diabetes Gestacional e outros tipos de DM Dentre as principais complicações do DM temos alterações bruscas nos níveis da glicose (hiperglicemia e hipoglicemia) e o desenvolvimento de doenças secundárias ao estado diabético, como a retinopatia, complicações cardiovasculares, neuropatia e nefropatia A nefropatia diabética caracteriza-se por alterações histopatológicas no tecido renal, que levam a lesão dos glomérulos e túbulos distais muitas vezes por mecanismos de estresse oxidativo, e juntamente com lesões pancreáticas criam um ambiente favorável para o desenvolvimento das complicações do DM A utilização de compostos naturais no tratamento de doenças crônicas tem sido bastante estudado A Catuaba (Trichilia catigua) é popularmente utilizada no tratamento de estresse, impotência, déficit de memória e fadigas, e estudos recentes mostram resultados promissores apresentando efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Fração de Acetato de Etila de Trichilia catigua (EAF) possui algum efeito atenuador ou farmacológico sobre as complicações decorrentes do DM Para isso, utilizou-se Ratos Wistar divididos em 4 grupos: N - normoglicêmico, N-EAF – normoglicêmico tratado com EAF (2 mg / kg); D: diabéticos e D-EAF: diabético tratado com EAF (2 mg / kg) O diabetes foi induzido por uma única injecção de estreptozotocina (STZ) (35 mg / kg) na veia peniana Dois dias após a injecção de STZ, o EAF foi administrado por gavagem, 7 dias por semana, durante 8 semanas Durante o período do experimento os animais foram analisados quanto a parâmetros metabólicos: peso, ingestão de água e ingestão de ração Após esse período foram coletados o sangue total dos animais para análises bioquímicas (glicemia, função renal, função hepática e função pancreática) e análises hematológicas O pâncreas e os rins foram coletados para análises morfométricas e histopatológicas Os ratos do grupo D apresentaram redução de peso corporal, tecido adiposo e massa muscular (p <,5) Estes animais apresentaram aumento na ingestão de alimentos e água e hiperglicemia com atrofia das ilhotas pancreáticas (p <,5) No entanto, a administração EAF no grupo D-EAF atenuou a perda de massa corporal e redução da ingestão de alimentos e de água (p<,5) Além disso, o tratamento EAF em ratos D-EAF promoveu um efeito hipoglicemiante com redução de 24% da glicose no sangue (P <,5) e melhora a outros parâmetros bioquímicos A análise da imuno-histoquímica para marcação da insulina mostra aumento do número de células ß e ilhotas tamanho significativo no grupo D-EAF por proliferação de células-ß marcado com PCNA Além disso, os nossos estudos histopatológicos mostraram que EAF promove redução nos danos do tecido renal (glomeruloesclerose, degeneração glicogênica e depósito de colágeno) em ratos com diabetes tratados com EAF as análises do estresse oxidativo aprsentaram a capacidade da T catigua proteger os rins da peroxidação lipídica O presente estudo mostrou que extrato de T catigua melhora a homeostase da glicose, protege o pâncreas das ações da STZ sobre as células ß, e protege os rins da peroxidação liídica inibindo o desenvolvimento da nefropatia diabética em ratos induzidos por STZItem Polimorfismo genético, expressão gênica e proteica do receptor CXCR4 : implicações na patogênese do câncer de mama e possível correlação com o gene TP53Kishima, Marina Okuyama; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Reiche, Edna Maria Vissoci; Herrera, Ana Cristina do Amaral; Ariza, Carolina Batista; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi [Coorientadora]Resumo: Os tumores de mama são caracterizados por um padrão metastático distinto, envolvendo linfonodos, medula óssea, fígado e pulmão A migração das células tumorais metastáticas apresenta muita semelhança com o tráfego de leucócitos Tem sido relatado que estas podem ser guiadas através da circulação até órgãos distantes que expressam quimiocinas, pois tais células possuem receptores específicos, como o CXCR4 (C-X-C motif chemokine receptor 4) Este receptor vem sendo implicado na disseminação de tumores malignos, sendo visto como um marcador promissor em vários tipos de neoplasias, incluindo as da mama O objetivo do presente estudo foi investigar a influência do polimorfismo genético de CXCR4 (C/T rs222814) sobre sua própria expressão gênica e protéica, bem como em relação a parâmetros prognósticos da doença, em 74 amostras de pacientes com câncer de mama geral Tivemos ainda como objetivo avaliar um polimorfismo (rs142522) no gene TP53, procurando estabelecer uma correlação com a expressão gênica de CXCR4, bem como com parâmetros prognósticos em uma amostra de 33 pacientes com câncer de mama, luminal/HER2 (-) DNA e RNA foram extraídos a partir de tecido tumoral e normal obtidos por ressecção cirúrgica utilizando-se kits específicos A genotipagem de CXCR4 foi realizada por reação em cadeia da polimerase seguida de análise de fragmentos de restrição(RFLP-PCR) A expressão gênica foi avaliada por PCR quantitativa em Tempo Real (q-PCR) e a expressão proteica por imunohistoquímica As frequências genotípicas das pacientes demonstraram que 88,24% apresentaram genótipo homozigoto CC e 11,76% apresentaram genótipo heterozigoto CT Nenhuma diferença significativa na distribuição dos genótipos foi observada de acordo com as características clinicopatológicas (grau histológico, grau nuclear, comprometimento de linfonodo, receptor de estrógeno e/ou progesterona, p53, Ki67 e superexpressão do oncogene HER2) Em geral, as amostras de câncer de mama apresentaram maior expressão de CXCR4 (5,7 vezes) em relação ao RNAm de mama normal, mas não foram observadas diferenças significativas em relação à variante alélica polimórfica, quanto à expressão proteica e também em relação aos parâmetros acima citados No ensaio imunohistoquímico, foi observada uma marcação citoplasmática mais intensa de CXCR4 nas amostras tumorais em relação ao tecido normal de mama (p<,1), mas esta não foi associada ao comprometimento linfonodal, expressão gênica ou ao polimorfismo rs222814 O estudo caso controle indicou uma associação positiva para o genótipo heterozigoto e para o portador do alelo C (modelo dominante) do gene TP53 em relação à suscetibilidade em amostras luminal/HER2(-) Foi verificada uma correlação significativa para a variante genética (alelo C) de TP53 em relação ao tamanho tumoral e ao índice de proliferação celular, e a expressão de CXCR4 apresentou correlação significativa com presença de metástase, nesta mesma amostra Adicionalmente, nenhum dos genótipos de TP53 influenciou a expressão gênica de CXCR4 De um modo geral, o presente estudo mostrou um aumento da expressão de CXCR4 nos tecidos tumorais de mama, tanto em nível gênico quanto proteico, o qual não foi influenciado pelo polimorfismo avaliado no mesmo gene Tais resultados sugerem que este receptor pode ser um marcador promissor no contexto geral da carcinogênese mamária, em especial no que se refere ao processo de metástase, mas deve ser investigado se esse padrão se repete nos outros subtipos tumorais da mamaItem Detecção molecular de espécies de Candida por semi-nested PCRPitz, Amanda de Fáveri; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Silva, Carla Cristiane da; Carrara, Floristher Elaine; Panagio, Luciano AparecidoResumo: O diagnóstico da candidemia é complexo, e a confirmação da infecção por meio de diagnósticos laboratoriais é fundamental A técnica padrão para o diagnóstico é a hemocultura com o isolamento de fungos, entretanto, devido ao longo tempo requerido para a obtenção do resultado, confere-se a candidemia como uma infecção fúngica sistêmica com alta taxa de mortalidade Visando agilizar o diagnóstico laboratorial, nos quesitos de tempo de obtenção do resultado, aumento da especificidade e da sensibilidade, bem como a monitorização epidemiológica das candidemias, o uso de testes baseados em PCR para detectar o DNA de Candida spp é atualmente considerado promissor na investigação em amostras clínicas, considerando baixas concentrações em pequenos volumes de sangue Neste trabalho investigamos a utilização da técnica de semi-nested PCR para o diagnóstico da candidemia por meio de uma revisão sistemática com metanálise Foram acessadas as bases: Medline, Web of Science, Scopus, LILACS, Scielo, Embase e Cochrane que identificou um total de 196 estudos Destes, 5 foram incluídos na revisão sistemática e analisados quanto ao risco de viés utilizando-se a ferramenta QUADAS-2 Ainda destes estudos incluídos, 3 preencheram os critérios para a metanálise, fazendo-se a comparação direta da semi-nested PCR com a cultura por meio de tabelas 2x2 e extração de resultados verdadeiro positivo (VP), falso positivo (FN), verdadeiro negativo (VN) e falso negativo (FN) em 5 pacientes com candidemia confirmada (controle positivo) e em 38 indivíduos saudáveis (controle negativo) A sensibilidade e especificidade nos estudos foram calculadas com um intervalo de confiança de 95% e foi encontrada especificidade de 1% e sensibilidade variável de 88 a 1% Além disso, os estudos também testaram um total de 77 amostras de pacientes em suspeita de candidemia com hemoculturas negativas, e estes obtiveram uma positividade de 52% Baseando-se nestes resultados podemos sugerir que a semi-nested PCR em amostras clínicas pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico de candidemias na rotina laboratorial Foi também padronizada uma semi-nested PCR em única etapa (OTsn-PCR) utilizando como alvo as sequências das regiões espassadoras internas – Internal Transcriber Spacer (ITS1 e ITS2), caracterizadas por ter regiões altamente conservadas e regiões altamente específicas para cinco espécies de importância clínica para o gênero Candida: Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida krusei e Candida tropicalis A reação apresentou especificidade ao ser testada com outras espécies fúngicas e ótimo limite de detecção, alcançando ,25pg de DNA por amostra Quando comparada com ensaios convencionais de nested ou semi-nested PCR, a OTsn-PCR mostra vantagens pois é mais rápida e apresenta menor risco de contaminação pela menor manipulação dos tubos, tendo um grande potencial para ser utilizada no âmbito do diagnóstico molecular de candidíases e candidemiasItem Fusarium verticillioides : identificação de antígeno espécie-específico e desenvolvimento de PCR-ELISA para detecção do fungoOmori, Aline Myuki; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Santos, Joice Sifuentes dos; Sartori, Daniele; Itano, Eiko Nakagawa; Watanabe, Maria Angelica EharaResumo: Fusarium verticillioides é o principal patógeno de milho e pode causar desde uma infecção assintomática até o apodrecimento de todas as partes da planta Além disso, esse fungo é o principal produtor de fumonisinas, que estão relacionadas a doenças em humanos e animais Os métodos tradicionais utilizados para detectar fungos baseado em suas características morfológicas são demorados e apresentam baixa especificidade e sensibilidade A identificação e a caracterização de possíveis antígenos espécie-específicos com potencial para serem utilizados em métodos imunológicos bem como o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos para detecção desse fungo são importantes para o controle de qualidade do milho destinado à alimentação humana e animal Portanto, os objetivos deste trabalho foram identificar e caracterizar um antígeno de 67 kDa possivelmente espécie-específico de F verticillioides e desenvolver uma PCR-ELISA baseada no gene FUM21 A proteína de 67 kDa (p67) foi analisada por espectrometria de massa e sua atividade enzimática foi determinada em gel de poliacrilamida copolimerizado com amido, gelatina e soro albumina bovina A PCR-ELISA foi desenvolvida utilizando primers e sonda específicos para o gene FUM21 A especificidade da PCR-ELISA e da PCR convencional foi determinada analisando DNA de isolados de F verticillioides, F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, Aspergillus niger, A ochraceus, A carbonarius e Penicillium variabile e a sensibilidade dos métodos foi avaliada utilizando concentrações de 25 fg a 25 ng de DNA de F verticillioides 13G O efeito de matriz e a sensibilidade da PCR-ELISA e da PCR convencional em milho também foram analisados inoculando de 1 a 17 conídeos de F verticillioides 13G em milho triturado Duas possíveis proteínas resultaram da análise da p67 por espectrometria de massa: a proteína relacionada ao precursor da aminopeptidase Y de F fujikuroi e a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A análise da atividade enzimática da p67 revelou que a proteína apresenta atividade de amilase, sugerindo, portanto, que a p67 é a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A PCR-ELISA não apresentou positividade com DNA de F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, A niger, A ochraceus, A carbonarius e P variabile, e foi capaz de detectar cinco isolados de F verticillioides apresentando sensibilidade de 2,5 pg e 14 conídeos/g para DNA de cultura pura e para DNA de milho inoculado com suspensão de conídeos de F verticillioides, respectivamente, sendo 1 vezes mais sensível do que a PCR convencional Portanto, a p67 foi identificada como provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides o que permitirá a produção dessa proteína em sua forma recombinante em larga escala visando o desenvolvimento de método imunológico espécie-específico A PCR-ELISA foi específica para F verticillioides, foi mais sensível que a PCR convencional e apresentou potencial para ser utilizada na detecção de F verticillioides em amostras de milhoItem Detecção da co-infecção por Paracoccidioides brasiliensis e Leishmania spp em cãesPetroni, Tatiane Ferreira; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Itano, Eiko Nakagawa; Costa, Ivete Conchon; Fertonani, Luciane Holsback Silveira; Watanabe, Maria Angelica EharaResumo: Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica prevalente na América Latina, causada pelos fungos termodimórficos P brasiliensis e P lutzii O habitat desses fungos ainda não esta definido e o uso de animais sentinelas poderia contribuir para o esclarecimento do mesmo Considerando que a PCM e a leishmaniose visceral são endêmicas na região de estudo, este trabalho teve como objetivo avaliar a ocorrência de infecção por P brasiliensis em cães incluídos no Inquérito Epidemiológico para Leishmaniose Visceral Canina (LVC) na região de Araçatuba-SP Do total de 3 amostras de soro analisadas (66% positivas e 33% negativas para LVC), 22 (7,3%) foram positivas em ensaio de imunodifusão (ID) para P brasiliensis, das quais todas eram positivas para LVC (teste rápido e ELISA) Ao analisar as amostras positivas na ID (exoantígeno) por Western blotting (gp43 recombinante), 19 (84%) das amostras apresentaram positividade Foi observado uma correlação positiva (r=96) entre as positividades para LVC e PCM Estes dados sugerem uma maior suscetibilidade de cães com LVC ao desenvolvimento da PCM A fim de confirmar a hipótese de co-infecção, um segundo trabalho foi realizado, e de 128 novas amostras de soro canino analisadas, 7 (5,4%) foram positivas na ID para PCM, sendo 6 (85%) positivos para ambas infecções (PCM e LVC) Amostras de tecidos, linfonodos e lesões de pele, de um dos cães soropositivos para ambas infecções foram cultivados em ágar Saboraud com cloranfenicol e analisados por PCR Uma colônia com características macroscópicas de P brasiliensis foi recuperada a partir da cultura da lesão de pele deste cão, e a análise microscópica apresentou leveduras similares a P brasiliensis O novo isolado de P brasiliensis foi confirmado por PCR (genes alfa-tubulina, PbITSE/R e p27) e a co-infecção através da PCR para detecção de minicírculos de k-DNA de Leishmania spp Estes dados confirmam a ocorrência de co-infecção por P brasiliensis em cão com LVCItem Efeitos anti-inflamatório, antioxidante, analgésico e mecanismos de ação dos flavonóides Trans-Chalcona, Hesperidina Metil-Chalcona e Quercetina em modelo de artrite gotosa em camundongosMiyazawa, Kenji William Ruiz; Verri Junior, Waldiceu Aparecido [Orientador]; Pavanelli, Wander Rogério; Dionisio, Andressa de Freitas Mendes; Kwasniewski, Fábio Henrique; Borghi, Sérgio MarquesResumo: Artrite gotosa é uma doença inflamatória que acomete articulações e caracteriza-se pela deposição de cristais de ácido úrico (MSU) intra e periarticular Os sinais mais comuns são o edema articular e o aumento da sensibilidade à dor nas articulações (hiperalgesia) Uma nova abordagem terapêutica para o tratamento da doença é a inclusão de compostos químicos naturais presentes em plantas como os flavonoides Trans-chalcona (TC), Hesperidina metil-chalcona (HMC) e Quercetina (QC) são flavonoides, presentes principalmente em vegetais e frutas, que apresentam diversas propriedades biológicas capazes de modular processos inflamatórios por meio de suas atividades antioxidantes e anti-inflamatórias e, além disso, atuam sobre fatores de transcrição, como Nrf2 e NF?B Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos e mecanismos de ação dos flavonoides TC e HMC, além de avaliar se os efeitos apresentados pela QC eram dependentes de receptores opioides no modelo de artrite gotosa induzida por MSU em camundongos O estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal da Universidade Estadual de Londrina (CEUA-UEL- processo nº 1327921176 e nº 14621373) A artrite gotosa foi induzida pela injeção intra-articular (1 µg/1 µL) de MSU e foram avaliados a hiperalgesia mecânica, edema articular, migração leucocitária, histologia articular (H/E), estresse oxidativo, produção de citocinas, ativação do NF?B e expressão de RNAm do inflamassoma NLRP3 (qPCR) e, in vitro, a produção de IL-1ß madura no sobrenadantes de macrófagos derivados da medula (BMDMs) Inicialmente foi realizada uma dose reposta dos flavonoides TC (3, 1 e 3 mg/kg), HMC (3, 1 e 3 mg/kg) por via oral e QC (1, 3 e 1 mg/kg) por via subcutânea para determinar a dose mais eficaz Além disso, foi realizado uma dose resposta da naloxona, um inibidor não seletivo de receptores opioide nas doses de (3, 1 e 3 mg/kg) por via intraperitoneal, juntamente ao modelo de gota e quercetina, para avaliar se os efeitos da quercetina eram dependentes de receptores opioides Desta forma as doses selecionadas foram TC (3 mg/kg), HMC (3 mg/kg), QC (1 mg/kg) e naloxona (3 mg/kg) O tratamento com esses três flavonoides foram capazes de reduzir a hiperalgesia mecânica e o edema induzidos por MSU Além disso, quando avaliada a migração leucocitária, foi possível observar que os flavonoides diminuíram o recrutamento de leucócitos para a cavidade e tecido articular, reduzindo assim a sinovite O tratamento com os flavonoides foram capazes de proteger contra o estresse oxidativo induzido pela injecção ia de MSU A quercetina foi capaz de promover a restauração dos niveis de GSH, aumento do Frap, ABTS e redução de anions superóxidos (NBT), além disso, os tratamentos com TC e HMC também reduziram a produção de óxido nítrico (NO) na articulação Os tratamentos com os flavonoides foram capazes de reduzir a expressão do RNAm de gp91phox ao mesmo tempo que induziram a ativação da via Nrf2/HO-1 conferindo à essas moléculas propriedades antioxidantes A produção de citocinas pro-inflamatórias como IL-1ß e TNFa foram reduzidas pelo tratamento com QC, ademais IL-6 foi reduzida pelo tratamento com TC e HMC Em relação ás citocinas anti-inflamatórias os dados demonstram que os níveis de IL-1 foram reduzidos pelo tratamento HMC e não alterados no tratamento com TC, além disso, os tratamentos com TC e HMC foram capazes de aumentar os níveis de TGF-ß na articulação O estímulo com MSU foi capaz de ativar vias de sinalizações inflamatórias ativados pelo NF?B; os flavonoides, por sua vez, inibiram a ativação, contribuindo com a redução de citocinas pro-inflamatórias Quando avaliada a expressão dos RNAm das moléculas do inflamassoma NLRP3, ASC, Pro-caspase e Pro-IL1ß todos os flavonoides avaliados inibiram sua expressão de maneira significativa Entretanto, no modelo in vivo, os efeitos promovidos pelo tratamento com a quercetina na dose de 1 mg/kg, sc, foram revertidos de maneira siginificativa pelo pre-tratamento com a naloxona na dose de 3 mg/kg, ip em todos os ensaios realizados In vitro, foi avaliado os níveis de IL-1ß madura no sobrenadante de BMDMs co-estimuladas com LPS (sinal 1) e MSU (sinal 2) Esta estimulação levou ao aumento nos níveis de IL-1ß, sendo que o tratamento com quercetina (3 µM) inibiu a produção de IL-1ß madura no sobrenadante de BMDMs, contudo, o seu efeito foi revertido pela naloxona na concentração de (2 µM) Entretanto o tratamento com HMC em nenhuma das concentrações testadas foram capazes de inibir a sua produção de maneira significativa, logo o efeito da HMC não é depentende da inibição da ativação do inflamassoma, mas sim pela inibição da ativação do NF?B Assim, os dados do presente trabalho sugerem que os tratamentos com os flavonoides TC e HMC exibem efeito analgésico, anti-inflamatório e antioxidante que podem estar associados com a inibição do NF?B no modelo in vivo, assim como a quercetina atuou sobre a inibição tanto de NF?B quanto de Inflamassoma NLRP3 no modelo in vivo e in vitro, sendo os seus efeitos dependentes da participação dos receptores opioide no modelo de artrite gotosa induzida por MSUItem Análise de polimorfismos genéticos, expressão gênica e metilação da região promotora do fator de transcrição FOXP3 : implicações na patogênese de subtipos agressivos do câncer de mamaHirata, Bruna Karina Banin; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Oda, Julie Massayo Maeda; Amarante, Marla Karine; Losi-Guembarovski, Roberta; Victorino, Vanessa Jacob; Oliveira, Karen Brajão de [Coorientadora]Resumo: O grau de heterogeneidade molecular e celular no câncer de mama e o grande número de eventos genéticos envolvidos no controle do crescimento celular, diferenciação, proliferação e metástase dependem da interação tumor-hospedeiro O câncer de mama consiste em um microambiente complexo que inclui, além das células neoplásicas e o estroma circundante, células do sistema imunológico As células T reguladoras (Tregs) são importantes na supressão de resposta imune efetora e desta forma podem contribuir para a tumorigênese Inicialmente acreditava-se que a proteína forkheadbox 3 (FOXP3) fosse exclusiva dessas células, no entanto alguns estudos têm encontrado expressão deste fator de transcrição também em células epiteliais, inclusive de mama, onde pode atuar como um gene supressor tumoral Sabe-se que polimorfismos genéticos podem modificar funcionalmente ou quantitativamente o FOXP3 Por outro lado, estudos tem mostrado que a regulação epigenética, como a metilação do DNA, é crucial para o controle de expressão do locus FOXP3 O presente estudo teve por objetivo analisar as variantes alélicas g143A>G (rs2232365) e g848A>C (rs3761548) entre pacientes com câncer de mama e mulheres livres de neoplasia mamária, o perfil de metilação da região promotora do gene, bem como sua expressão gênica O genótipo AA do polimorfismo g143A>G foi associado com maior chance de desenvolvimento do câncer de mama (p=,46) Enquanto o genótipo GG foi correlacionado com maior Ki-67 (p=,19) no subtipo HER2-superexpresso (HER2+) e estadiamento TNM mais avançado no subtipo triplo-negativo (TN) (p=32) O genótipo AA do polimorfismo g848A>C foi correlacionado com maior Ki-67 (p=18) e menor grau histológico no subtipo HER2+ (p=26) O haplótipo GA foi correlacionado com menor grau histológico (p=9) e maior Ki-67 (p=36) no subtipo HER2+ e maior estadiamento em TN (p=44), enquanto o haplótipo AC foi correlacionado com menor Ki-67 (p=5) e estadiamento (p=27), nos subtipos HER2+ e TN, respectivamente Além disso, o haplótipo AC foi correlacionado com maior expressão de RNAm de FOXP3 (p=39) O subtipo Luminal B HER2+ (LB) apresentou 2,6 vezes menos expressão de RNAm de FOXP3 comparado ao controle, enquanto o TN e HER2+ apresentaram uma expressão ligeiramente maior (1,6 e 1,8 vezes, respectivamente) A expressão de RNAm de FOXP3 não foi correlacionada com os parâmetros prognósticos das pacientes Não houve diferença do perfil de metilação entre os tumores benignos, carcinoma ductal in situ e invasivo (p=96), assim como não houve diferença entre o tecido tumoral e normal adjacente (p=63) O perfil de metilação também não foi correlacionada com a expressão de RNAm e proteica de FOXP3, bem como com parâmetros prognósticos Foi observada correlação significativa entre a expressão proteica citoplasmática de FOXP3 em células tumorais de mama com maior comprometimento de linfonodos (p=1) e uma tendência de correlação entre o infiltrado de células mononucleares FOXP3-positivas com maior grau histológico (p=68) Nossos resultados sugerem que no tumor de mama o perfil de metilação de FOXP3 não está unicamente relacionado com a regulação transcricional deste gene, podendo outros mecanismos estar envolvidos, como polimorfismos genéticos, uma vez que o haplótipo AC dos polimorfismos estudados mostrou correlação com a expressão gênica Além disso, este haplótipo foi correlacionado com menor índice de proliferação celular Ki67 e estadiamento, indicando que o RNAm de FOXP3 aumentado no tumor pode conferir melhor prognóstico No entanto, ao analisar a expressão proteica, observamos que quando localizado no citoplasma da célula tumoral o FOXP3 pode estar correlacionado à pior prognóstico, como comprometimento de linfonodos Desta maneira, sua influência no prognóstico pode depender da sua localização, assim como do subtipo tumoral de mamaItem Avaliação da infecção por Paracoccidioides brasiliensis e Leishmania sp. em animais silvestres de pequeno porteSbeghen, Mônica Raquel; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Tatibana, Berenice Tomoko; Itano, Eiko Nakagawa; Fertonani, Luciane Holsback Silveira; Watanabe, Maria Angelica EharaResumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é a principal micose sistêmica prevalente na América Latina, causada pelos fungos termo-dimórficos Paracoccidioides brasiliensis e P lutzii Considerando que o habitat destes fungos na natureza permanece indefinido, animais silvestres podem ser úteis como indicadores da presença de Paracoccidioides sp no ambiente Outra doença endêmica no estado do Paraná é a leishmaniose tegumentar americana (LTA) A LTA é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania e os animais silvestres podem ser hospedeiros e reservatórios biológicos destes patógenos O objetivo deste estudo foi avaliar a infecção de mamíferos silvestres de pequeno porte por P brasiliensis e Leishmania sp em uma área endêmica para PCM e LTA Os mamíferos silvestres (n=38) foram capturados por meio de armadilhas, em uma Reserva Nacional do Patrimônio Natural (RPPN) no município de Mauá da Serra-PR e a infecção por P brasiliensis e Leishmania sp foi avaliada por meio de métodos sorológicos (ELISA e imunodifusão), reação em cadeia da polimerase (Nested-PCR), cultura e exame histopatológico Os animais utilizados para investigação da infecção por P brasiliensis e Leishmania sp foram: Akodon sp (n=12), Thaptomys nigrita (n=8), Euryoryzomys russatus (n=7), Oligorizomys nigripes (n=3), Monodelphis sp (n=3), Sooretamys angouya (n=2), Abrawayaomys angouya (n=1), Abrawayaomys ruschii (n=1) e Akodontinae sp (n=1) Além destes animais, um tatu atropelado Dasypus novemcinctus foi avaliado quanto à infecção por Leishmania sp A análise das amostras de soro por ELISA demonstrou uma positividade de 237% (n=9) para gp43 de P brasiliensis e 36,8% (n=14) para antígeno bruto de Leishmania sp Amostras de coração e fígado de um O nigripes apresentaram positividade para P brasiliensis na PCR e o animal também apresentou positividade para o fungo no ELISA O exame histopatológico, a imunodifusão e a cultura foram negativos P brasiliensis Amostras de tecidos de Dasypus novemcinctus (baço), Akodon sp (fígado) e de Thaptomys nigrita (baço) apresentaram positividade para Leishmania sp na PCR e estes mesmos animais também apresentaram positividade para Leishmania sp no teste de ELISA Estes dados sugerem que mamíferos silvestres de pequeno porte são reservatórios de P brasiliensis e Leishmania spItem Tratamento com baixas doses de aspirina nas fases aguda e crônica da infecção murina por trypanosoma cruzi promove neuroproteção entéricaOda, Juliano Yasuo; Araújo, Eduardo José de Almeida [Orientador]; Sant´Ana, Débora de Mello Gonçales; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Ceravolo, Graziela Scalianti; Pavanelli, Wander Rogério; Pinge Filho, Phileno [Coorientador]Resumo: A doença de Chagas (DC) representa um importante problema de saúde pública no Brasil, devido ao surgimento de novos casos e também por ainda não possuir cura A DC acomete o controle nervoso do trato gastrointestinal, resultando em severos distúrbios de motilidade Essas alterações de motilidade devem-se, principalmente, à perda de neurônios do plexo mientérico, o qual é um dos plexos ganglionados do sistema nervoso entérico Neste estudo, objetivou-se avaliar se o uso de baixas doses de aspirina (ASA) durante a fase aguda (2 mg/kg) ou crônica (5 mg/kg) da infecção experimental por T cruzi seria capaz de proteger neurônios mientéricos do cólon de camundongos Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Londrina (UEL) Camundongos Swiss foram distribuídos em grupos que receberam PBS ou foram tratados com baixas doses de aspirina durante a fase aguda (2 mg/Kg, ASAEarly) ou crônica (5 mg/Kg, ASADelayed) da infecção causada pela cepa Y de T cruzi Após 75 dias de infecção, coletou-se o cólon para quantificar focos inflamatórios em cortes histológicos e neurônios mientéricos gerais, nitrérgicos, VIPérgicos e colinérgicos evidenciados por imunofluorescência Além disso, avaliou-se o trânsito gastrointestinal Contou-se o número total de corpos celulares de neurônios gerais, nitrérgicos e VIPérgicos presentes em 24,6 mm2 de cada animal, valor que projetado para 1 cm2 O número de neurônios colinérgicos foi estimado pela diferença entre o número de neurônios gerais e o número de neurônios nitrérgicos Foi também realizada a mensuração da área do corpo celular de 3 neurônios evidenciados em cada marcação de cada animal Foram mensuradas 7 varicosidades nervosas mientéricas VIPérgicas e contendo Substância P O tempo de trânsito intestinal foi avaliado com a administração de um marcador não absorvível, via gavagem (tempo zero), até a eliminação do primeiro pelete de fezes na cor vermelha Os dados foram expressos por média ± desvio padrão, e os grupos foram comparados utilizando ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey, considerando significante p<,5 O tratamento com ASA na fase aguda provocou uma significativa redução no pico de parasitemia (p<,5) Com relação a quantidade de foco inflamatório, ambos tratamentos foram eficientes para reduzi-los Os camundongos infectados do grupo PBS apresentaram intensa perda neuronal mientérica, tanto na população geral (6,67%), como também nas subpopulações nitrérgica (49,%), colinérgica (67%) e VIPérgica (38,%) (p<,5) Essa morte de neurônios foi significativamente reduzida pelo tratamento com ASA tanto na fase aguda (ASAEarly) como na fase crônica (ASADelayed) da infecção (p<,5) A intensa morte de neurônios colinérgicos nos animais do PBS provocou significativo retardo do trânsito do tubo digestório (p<,5) O tratamento com ASA contribuiu para que o tempo de trânsito gastrointestinal dos animais infectados permanecesse semelhantes aos animais saudáveis A infecção por T cruzi, provocou uma hipertrofia no corpo celular dos neurônios remanescentes O tratamento com ASA na fase aguda da infecção contribuiu de forma mais expressiva para manutenção da área do corpo celular dos neurônios mientéricos remanescentes Camundongos infectados com T cruzi não tratados com ASA apresentaram varicosidades nervosas mientéricas VIPérgicas atrofiadas e as contendo substância P estavam hipertrofiadas Além disso, as fibras nervosas apresentaram maior intensidade de brilho para SP Conclui-se que a administração de ASA apresentou efeito neuroprotetor para os neurônios do plexo mientérico do cólon de camundongos infectados por T cruziItem Detecção da infecção por Paracoccidioides brasiliensis por meio de PCR-ELISA e ELISA com antígenos recombinante rGp43 e sintético e reatividade à rGp43 na leishmaniose humanaBorges, Isabele Kazahaya; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Furlaneto, Márcia Cristina; Sartori, Daniele; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Itano, Eiko NakagawaResumo: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina O diagnóstico da PCM apresenta dificuldades como reatividade cruzada com outras micoses sistêmicas como a histoplasmose ou doenças parasitárias como a leishmaniose Adicionalmente, PCM e leishmaniose são doenças que compartilham as mesmas áreas endêmicas Este estudo teve como objetivos desenvolver métodos de detecção da infecção por P brasiliensis por meio de PCR-ELISA e ELISA baseado em antígenos recombinante e sintéticos e avaliar anticorpos contra P brasiliensis em indivíduos soropositivos e soronegativos para leishmaniose Embora a glicoproteína 43 kDa (gp43) de P brasiliensis seja o antígeno mais utilizado no imunodiagnóstico da PCM, podem ocorrer reações cruzadas devido principalmente a epítopos carboidrato A gp43 recombinante produzida em Escherichia coli não é glicosilada e, portanto, pode contribuir para a redução das reações cruzadas Os peptídeos sintéticos baseados na sequência da gp43 também constituem uma alternativa interessante, pois apresentam vantagens como baixo custo de produção, altas sensibilidade e especificidade Amostras de soro humano positivas (n=2) e negativas (n=22) na imunodifusão com exoantígeno de P brasiliensis foram analisadas por ELISA utilizando gp43 recombinante (rGp43) e peptídeo sintético como antígenos, respectivamente Todas as amostras positivas na imunodifusão também foram positivas para a rGp43 enquanto 75% das amostras foram positivas no ELISA com peptídeo sintético As amostras negativas na imunodifusão apresentaram positividade no ELISA com rGp43 e peptídeo sintético de 36,4% e 4,9%, respectivamente Técnicas de biologia molecular também podem contribuir para o diagnóstico preciso e rápido da PCM Uma amostra de escarro (negativa para P brasiliensis por Nested-PCR) foi inoculada com células de P brasiliensis diluídas em série (1 a 15 células/mL) e o DNA foi extraído e amplificado por Nested-PCR O produto da amplificação foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida e por PCR-ELISA e ambas as formas de detecção permitiram a detecção de baixa quantidade de DNA, embora a PCR-ELISA tenha permitido a análise em menor tempo Amostras de soro humano soropositivas (n=14) e soronegativas (n=39) para leishmaniose foram analisadas por ELISA e imunodifusão utilizando gp43 recombinante e exoantígeno, respectivamente As amostras soropositivas e soronegativas para leishmaniose apresentaram positividade para rGp43 de 64,3% e 53,8%, e a diferença não foi significativa O ELISA baseado em rGp43 e peptídeo sintético, bem como a PCR-ELISA, constituem alternativas promissoras para a detecção da infecção por P brasiliensisItem Efeito imunotoxicopatológico de ocratoxina A e associado a fumonisina B1 em modelo experimental em pintainhosKhan, Shahzad Akbar; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Marquez, Audrey de Souza; Headley, Selwyn Arlington; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson José [Coorientador]Resumo: Ocratoxina A (OTA) e fumonisina B1 (FB1) são metabolitos secundários tóxicos produzidos por fungos e a ingestão de stas micotoxinas estão relacionados com diversas doenças em seres humanos, bem como em outras espécies O objetivo de este estudo foi investigar os efeitos imunotoxicopatológicos de OTA isoladamente ou em combinações com FB1 em pintinhos de corte do experimento-1 para avaliar as respostas imunopatológicos de pintinhos de corte submetidos a diferentes níveis de contaminação de OTA por meio da ração Para este efeito, os pintinhos de 42 dias foram divididos em sete grupos (A, B, C, D, E, F, G) O grupo A foi composto de animais controle; enquanto que nos grupos B, C, D, E, F e G, de animais alimentados com ração contaminada com OTA nas concentrações ,1; ,3; ,5; ,7; ,9 e 1,1 mg/Kg de ração, respectivamente, durante 21 dias Pesos relativos do fígado, rins, bursa de Fabricius, timo e baço foram registrados no final do experimento Perfil hematológico e alterações histopatológicas no fígado, rins, baço, timo e bursa das aves foram determinados para avaliar os danos causados por OTA Os níveis de IgY e IgA séricas totais foram avaliados por ELISA para determinação da resposta imune humoral Os sinais clínicos observados incluíram diarreia grave, apatia, depressão, diminuição do consumo de ração, aumento na ingestão de água e penas onduladas Lesões macroscópicas patológicas no fígado e nos rins demonstraram coloração clara, friável e hemorrágico O aumento significativo no peso relativo dos rins e do fígado (grupo C, D, E, F e G), enquanto diminuição significativa no peso do baço (grupo F e G), da bursa de Fabricius e do timo (todos os grupos tratados) foram observadas nos grupos tratados com OTA (p <,5) Histologicamente, fígado e rins demonstraram alterações degenerativas e infiltrativas, enquanto baço, bursa e timo demonstraram redução acentuada de células linfóides O perfil hematológico indicou diminuição no número de hematócrito, eritrócitos, hemoglobina, leucócitos e linfócitos, enquanto foi observado aumento significativo em heterófilos e monócitos (p<,5) Além disso, eosinófilos foram detectados em grupos tratados com concentrações mais elevadas de OTA Níveis de IgY e IgA foram reduzidos significamente em todos os grupos tratados com OTA em dosedependência (p<,5) A redução do consumo de ração, ganho de peso corporal dos pintinhos e perfil bioquímico sérico indicaram um dano severo ao fígado e rins em aves alimentadas com ração contaminada por OTA No entanto, osníveis de glicose e proteína total no soro foram significativamente menores (p <,5) em todos os grupos tratados com OTA Este estudo indica que houve efeitos imunopatológicos de OTA em pintinhos tanto em baixa quanto em concentrações mais elevadas de OTA na dieta, mesmo em ração contaminada com ,1 mg de OTA/kg de peso corporal Além disso, os resultados sugerem que houve efeitos patológicos de forma depressor no crescimento e imunossupressores devido a ingestão de OTA, sendo de forma crescente com aumento da concentração de OTA na dieta O experimento-2 foi realizado em 36 pintinhos de corte, não sexados, 1 dia de idade e livres de agents patogênicos específicos (Cobb) por um período de 21 dias Os animais do estudo eram do mesmo bando de reprodução No primeiro dia, os pintinhos foram separados em seis grupos (A, B, C, D, E e F), com 6 animais em cada grupo Com cinco dias, os pintinhos dos grupos B, C, D, E e F foram inoculados subcutaneamente com concentração de ,1; ,5; ,9; 1,3 e 1,7 mg de OTA /Kg de peso corporal respectivamente, o grupo controle não inoculado-grupo A Os animais do grupoA, B, C e D demonstraram-se, interesse normal pela água e apresentaram penas brilhantes durante todo o período do experimento, enquanto os grupos experimentais E e F demonstraram-se deprimidos, abatidos, com penas onduladas e letárgico e, o grau dessas alterações aumentou após duas semanas da inoculação de OTA Similarmente, graves lesões foram também mais severas nos grupos experimentais E e F, enquanto alterações de menores graus foram observadas em rins, fígado, bursa de Fabricius, baço e timo nos grupos B, C e D O peso relativo dos rins e fígado aumentou significativamente nos grupos B, C, D, E e F inoculados com OTA em comparação com o grupo controle A (p <,5) Similarmente, o peso relativo da bursa de Fabricius, timo e baço foi significativamente reduzido em todos os grupos tratados com OTA em comparação ao grupo controle A (p <,5) Histologicamente, os rins do grupo E e F demonstraram leve a moderado grau de congestionamento, focos de núcleos picnóticos, degeneração e congestionamento no parênquima Nos fígados do grupo D e E foram observados congestionamento, alteração de gordura, espaços sinusoidais dilatadas e infiltração de células mononucleares em torno dos vasos sanguíneos, com algumas células com núcleos picnóticos Bursas demonstraram grandes danos degenerativos como cariopicnose, cariorrexe, depleção de células linfóides nos folículos e atrofia de alguns folículos nos animais dos grupos D, E e F Os timos do grupo D, E e F apresentaram depleção de células linfóides, congestão dos vasos sanguíneos e alterações degenerativas No baço, as principais alterações patológicas foram observados nos centros germinais, predominantemente em pintinhos do grupo E e F Os níveis de hematócrito, eritrócitos, hemoglobina e leucócitos foram reduzidos significativamente nos pintinhos dos grupos B, C, D, E e F em comparação com o grupo controle (A) (p<,5)Do mesmo modo, nível de heterófilo no grupo E e F foram significativamente reduzidos em relação ao grupo controle A (p<,5) Nível de monócitos foi significativamente aumentado no grupo tratado F em comparação com grupo controle (A) (p <,5) Contudo um aumento significativo não foi detectado em pintinhos do grupo B, C, D e E em comparação com grupo contole A O aumento de eosinófilos foi detectado em pintinhos do grupo D, E e F Os linfócitos foram significativamente reduzidos (p<,5) em pintinhos dos grupos D, E e F, em comparação com grupo controle (A) Na resposta immune humoral, os níveis de IgY e IgA séricas foram determinados no 14° e 21° dia após inoculação de OTAOs resultados referente sao nível de IgY do 14° ou 21° dia após a inoculação de OTA mostraram redução significativa (p <,5) em pintinhos de grupos B, C, D, E e F após 14° dia em comparação com o grupo controle (A) Nível de IgA foi significativamente reduzida (p<,5) nos grupos C, D, E e F no 14° dia e em todos os grupos (B, C, D, E e F) no 21° dia em comparação ao grupo controle A Os níveis de diferentes parâmetros bioquímicos como ureia, triglicéridos, ácido úrico, creatinina, ALT, AST, AP e GGT foram aumentados (p<,5) e, glicose e proteína total no soro diminuíram significativamente (p <,5) em todos os grupos tratados com OTA No pós-morte, lesões graves como hemorragias, alteração da cor dos órgãos e posição alterada foram observadas em grupos tratados com OTA O consumo de ração, peso corporal e conversão alimentar também foram alterados em todos os grupos tratados com OTA em relação ao controle Portanto, conclui-se que independente da via de contaminação, OTA possui efeitos multifacetados na análise bioquímica, alterações macroscópicas em órgãos viscerais e no consumo de ração, peso corporal e conversão alimentar em frangos de corte Para avaliar o efeito de OTA na resposta a vacinação contra Eimeria, o experimento-3 foi realizado com 6 pintinhos de corte fêmeas com 1 dia de idade e livres de agentes patogênicos específicos, divididos em 5 grupos (A, B, C, D e E), com 12 aves em cada grupo Todos os grupos foram imunizados com vacina comercial contra Eimeria e os grupos B, C, D e E foram alimentados com ração contaminada nas concentrações de ,1mg de OTA+,1 mg de FB1; ,3mg de FB1;,5 mg OTA+FB1 e ,9 mg de FB1/Kg de ração, respectivamente, por um período de 21 dias No término do experimento, o peso relativo do órgão, parâmetros hematológicose bioquímicos foram determinados NívelItem Anticorpos e imunocomplexos aos antígenos dentinários em ratos e anticorpos salivares e resposta linfoproliferativa para frações de dentina humana associados à reabsorção dentária no tratamento ortodônticoCosta, Tânia Maris Pedrini Soares da; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Hidalgo, Mirian Marubayashi; Lima, Carlos Eduardo Oliveira; Marquez, Audrey de SouzaResumo: O potencial imunogênico da dentina tem sido atribuído a antígenos que estariam presentes na dentina, os quais poderiam ser expostos ao sistema imune durante os processos de reabsorção radicular como consequência do tratamento ortodôntico Este estudo teve como objetivo investigar em modelo animal, a resposta imune humoral sistêmica e local aos antígenos dentinários, a formação de imunocomplexos e os níveis séricos de antígenos dentinários solúveis; e em humano, os níveis de IgG salivar, a resposta linfoproliferativa à frações de dentina humana e a correlação entre os dados encontrados Em modelo experimental, quarenta ratos Wistar machos escolhidos aleatóriamente foram submetidos ao movimento de inclinação mesial do primeiro molar superior direito, por aplicação de uma força ortodôntica de 55 cN por 3, 7, 14 e 21 dias ou deixado sem tratamento (controle) Após cada periodo experimental, amostras de saliva, sangue e a maxila direita de cada animal foram coletadas para análise O estudo humano constituiu-se de 3 grupos Grupo I, formado por pacientes adolescentes (n=1) onde amostras de saliva foram coletadas em 4 periodos: antes (T), 3 (T3), 6 (T6) e 12 (T12) meses de tratamento ortodôntico, para análise dos níveis de reatividade da IgG salivar para as frações FI, FII ou FIII de extrato dentinário humano No grupo II (n=3), amostras de soro e células mononucleares do sangue periférico de pacientes adolescentes com 6 meses de tratamento ortodôntico foram coletadas para análise dos níveis de IgG sérica e resposta linfoproliferativa às frações de extrato dentinário humano FI ou FIII No terceiro grupo (n=16), voluntários adolescentes que nunca haviam se submetido à tratamento ortodôntico e sem sinais radiográficos de reabsorção radicular, serviram de controle para o segundo grupo de estudo O extrato dentinário total foi obtido à partir de incisivos de rato Wistar ou de dentes terceiros molares humano, respectivamente, sendo que em humano o extrato dentinário foi submetido à cromatografia de gel filtração, Sephadex G-12-15 A reabsorção radicular foi avaliada por análise histopatológica em microscópio óptico em modelo animal e através do método de subtração radiográfica digital dos incisivos superiores, em humano Os níveis de anticorpos, imunocomplexos e antígenos dentinários solúveis no soro foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA) Para o estudo da resposta linfoproliferativa, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humano estimuladas com frações dentinárias foram analisadas por ensaio MTT Níveis mais elevados de IgG sérica em ratos foram detectados em 14 e 21 dias em relação ao controle (p < 5) No entanto, em saliva foram detectados um aumento dos níveis de IgG salivar em 3 e 7 dias em comparação com o controle (p < 1) e uma diminuição de seus níveis em 21 dias em relação a 3 e 7 dias (p < 5) Níveis mais elevados de imunocomplexos no soro foram detectados em 14 e 21 dias (p < 1) e na saliva em 14 dias (p < 5) em relação ao controle, com uma diminuição em 21 dias em relação à 14 dias (p < 5) No grupo I humano foi observado uma maior reactividade da IgG salivar para a fração FII em relação à FIII em T6 e T12 (P < 5) e no grupo II houve uma correlação positiva significante entre proliferação de linfócitos e níveis de IgG sérica para a fração III (r = 58) Em conclusão, houve imunomodulação na resposta de anticorpos IgG salivar a antígenos dentinários durante o tratamento ortodôntico em ratos que diferem secreção sistêmica, da externa (saliva) Os níveis de imunocomplexos em soro ou saliva tem potencial para servir de marcadores biológicos, por indicar a fase ativa da reabsorção radicular Em humanos, mudança na reatividade IgG salivar para FII no decorrer do tratamento ortodôntico também sugerem o potencial desses anticorpos como marcadores biológicos para a detecção precoce da reabsorção radicularItem Doadores de óxido nítrico na patogênese da Doença de Chagas ExperimentalTatakihara, Vera Lúcia Hideko; Pinge Filho, Phileno [Orientador]; Nakamura, Celso Vataru; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Kwasniewski, Fábio Henrique; Pavanelli, Wander RogérioResumo: A infecção por Trypanosoma cruzi produz uma intensa resposta inflamatória em diversos tecidos, inclusive no coração A reação inflamatória é crítica para o controle da proliferação dos parasitos e evolução da Doença de Chagas (DC) Antiinflamatórios não esteróides liberadores de NO (AINES-NO) compõem uma nova classe de fármacos disponível para o tratamento de doenças inflamatórias Pesquisas realizadas em nosso laboratório mostraram que antiinflamatórios não esteroides (AINES) convencionais como indometacina, aspirina e celecoxibe promovem aumento da carga parasitária no sangue e no tecido cardíaco de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados por T cruzi A capacidade do óxido nítrico (NO) em mediar a atividade anti-T cruzi e o estresse oxidativo em eritrócitos durante a fase aguda da infecção, nos levou a investigar qual o impacto da administração de doadores de NO sobre a anemia, carga parasitária e estresse oxidativo em eritrócitos no inicio da infecção por T cruzi Camundongos C57BL/6 foram infectados por T cruzi (Cepa Y, 5 x 13 formas tripomastigotas sanguíneos) via intraperitoneal Após 3 minutos de infecção e nos subsequentes 12 dias, os animais foram tratados com indometacina-NO (indo-NO, 5 ppm/animal) ou sal de Angeli 15 minutos após infecção e diariamente por 12 dias (6 µg, 6 µg ou 6 µg) ip O grupo controle recebeu 1 µL de PBS pela mesma via O tratamento com indo-NO mostrou diminuição da sobrevida, aumento da anemia e do estresse oxidativo, diminuição da produção de NO ‘in vivo’ e ‘in vitro’, além do aumento de internalização e saída de formas tripomastigotas de T cruzi em macrófagos O tratamento com sal de Angeli na concentração de 6µg/Kg diminuiu a parasitemia, o número de ninhos no tecido cardíaco, a produção de NO plasmático, e o estresse oxidativo Por outro lado, melhorou a leucopenia e a trombocitopenia O tratamento ‘in vitro’ na concentração de 6 µM foi capaz de reduzir a produção de NO em cultura de macrófagos, diminuir a internalização e saída de formas tripomastigotas de macrófagos e diminuir a produção de IL-1Item Avaliação da exposição humana à aflatoxina B1 e M1 em lactantes e infantes e efeito imunotoxicopatológico de aflatoxina B1 em camundongos C57Bl/6Ishikawa, Angélica Tieme; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Elisabete Yurie Sataque; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Costa, Marcio Carvalho da; Venâncio, Emerson JoséResumo: A exposição humana e animal às aflatoxinas (AFs), por meio de alimentos e rações contaminados, é um problema mundial devido ao seu potente efeito carcinogênico, hepatotóxico e imunossupressivo A identificação do padrão de dieta, frequência de consumo, bem como determinação de níveis de metabólitos de AFs, como por exemplo aflatoxina M1 (AFM1), permitem fazer predições das relações entre dieta e saúde humana Dessa forma, considerando a maior vulnerabilidade de infantes às micotoxinas, um questionário de frequência de consumo alimentar foi aplicado em mães lactantes (n = 93, Norte do Estado do Paraná, Brasil), visando avaliar o consumo de alimentos comumente contaminados com aflatoxina B1 (AFB1) e AFM1, assim como foi estimada a exposição de infantes à AFM1 em amostras de leite materno (BM) e leite em pó infantil (IPM) comercial A média de consumo por mães lactantes foi de 2,73 g de milho/pessoa/dia e ,79 g de amendoim/pessoa/dia, consumo considerado abaixo da média da América Latina A extração de AFM1 em BM (n = 94) e IPM (n = 16) foi realizada em coluna de imunoafinidade (CIA) homemade e à contaminação avaliada por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) (BM, LOD: ,4 ng/g, LOQ: ,21 ng/g; IPM, LOD: ,3 ng/g, LOQ: ,16 ng/g) A AFM1 foi detectada em 5,3% e 43,8% das amostras de BM e IPM, com níveis médios de ,3 ng/g e ,11 ng/g, respectivamente Todas as amostras de IPM apresentaram níveis de AFM1 abaixo daqueles estabelecidos pela legislação Brasileira (5 ng/g) Consequentemente, a ingestão diária estimada (EDI) de AFM1 por infantes ( a 12 meses) apresentaram valores baixos (,19 a ,347 ng/kg peso corpóreo/dia) Em paralelo, os efeitos imunotoxicopatológicos de AFB1 foram investigados em camundongos C57Bl/6 (n = 5 cada grupo) utilizando uma única dose subclínica (44, 442 e 663 µg/kg de peso corpóreo, p c) administrado via gavagem Cinco dias após a exposição de AFB1, os seguintes parâmetros foram avaliados: a) função hepática por meio de análise de níveis séricos bioquímicos (ALT, ?-GT, proteína total) e histopatologia do fígado; b) resposta linfoproliferativa de células de baço aos mitógenos concanavalina A (ConA) e lipopolissacarídeo (LPS) por teste de MTT, níveis de citocinas hepáticas (IL-4, IFN-? e IL-17) por ELISA e contagem de células da medula óssea e, c) possível interferência de AFB1 na comunidade bacteriana fecal pelo sequenciamento em Ilumina MiSeq Todos os animais experimentais tratados mostraram alterações histológicas no fígado, porém com score significativo apenas na dose de 663 µg de AFB1/kg de p c e nesta dose foi detectado up-regulação significativa de níveis de IL-4 e IFN-? em fígado (p < ,5), todavia os parâmetros séricos bioquímicos permaneceram normais Nas doses de 442 e 663 µg/kg de p c houve uma supressão significativa na resposta linfoproliferativa a ConA, e aumento na contagem de leucócitos e neutrófilos, e na dose de 663 µg/kg de p c aumento de eritrócitos e megacariócitos na medula óssea O tratamento com 663 µg de AFB1/kg de p c aumentou a abundância relativa da família de bactérias Lachonospiraceae (p < ,5) Pelos resultados obtidos concluímos que as mães lactantes no Norte do Estado do Paraná apresentam menor consumo de alimentos comumente contaminados com AFB1 do que o consumo médio da América Latina e que a exposição de infantes à AFM1 na região é baixa Adicionalmente, uma única dose oral subclínica de AFB1 pode induzir lesões no fígado, imunomodulação e possível mudança na microbiota intestinal em camundongos C57BL/6 O estudo pode contribuir para melhor entendimento da necessidade do contínuo controle da qualidade de ração e alimento para minimizar o risco à saúde, especialmente a dos infantes Além disso, os efeitos sistêmicos de doses subclínicas de AFB1 devem ser explorados para maior compreensão da ação desta micotoxina, principalmente na avaliação da composição da microbiota intestinalItem Papel do estresse oxidativo na atrofia e proteólise do músculo esquelético no enfisema pulmonar induzido pela papaínaSczepanski, Cláudia Roberta Brunnquell; Cecchini, Rubens [Orientador]; Dichi, Isaías; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Comar, Jurandir Fernando; Pacagnelli, Francis LopesResumo: O objetivo deste estudo foi estabelecer um modelo experimental adequado de enfisema pulmonar associado às modificações musculoesqueléticas em estágios precoces da doença, assim como comparar as consequências musculares do enfisema pulmonar induzido por papaína e elastase Foram utilizados hamsters Syrian Golden machos (1-14g) distribuídos em diferentes grupos de acordo com o tempo experimental (tempo de sacrifício após a instilação de elastase aos 1, 2, 4 ou 7 dias, E1, E2, E4 ou E7/EE, respectivamente) e papaína (7 dias, EP); e enzima administrada (4mg/ml de papaína em salina ou 5,2 UI de elastase pancreática suína em salina) com seus respectivos controles (C1, C2, C4, C7/CS) sendo instilados ,3 ml da solução por animal Após o tempo experimental, os animais foram pesados para avaliação do índice de caquexia (IC) e sacrificados O lobo médio do pulmão direito foi coletado para análise histológica e quantificação do enfisema pulmonar O gastrocnêmio foi retirado para análise morfométrica da fibra muscular, massa muscular, relação da massa muscular com a massa corporal total (MM/MT), lipoperoxidação por quimiluminescência (QL), proteínas carboniladas (PC), glutationa total (GST) e oxidada (GSSG), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividade proteolítica quimiotripsina-like e calpaína-like Ao compararmos os grupos 7 dias (CS, EE e EP) foi verificado diminuição dos interceptos alveolares no EE e EP em relação ao CS (CS: 764 ± 58; EE: 4817 ± 116; EP: 5156 ± 49; p<,5) Quando comparado ao CS, houve uma redução da massa muscular no grupo EP (18,34%) e aumento no grupo de EE (8,37%), bem como da relação MM/MT Além disso, a reação de QL, PC e atividade quimotripsina-like foram elevadas no grupo EP, assim como a GST diminui no EE O grupo EE mostrou crescente número de fibras com aumento das áreas transversais e da atividade calpaína-like Na comparação com seus respectivos controles, os grupos com enfisema pulmonar (E1, E2, E4 E E7) apresentaram diminuição significativa do número de interceptos alveolares O IC foi de 9,7 ± 1,64% e 1,81 ± 1,55% nos grupos E1 e E2 A frequência de distribuição das áreas transversais das fibras se mostrou diferente entre os grupos 2, 4 e 7 dias Além disso, TBARS, relação entre a GST e GSSG, reação de QL e PC não mostraram diferenças significativas A atividade calpaína-like foi significativamente reduzida no grupo E4 Estes dados nos permitem concluir que a elastase e a papaína, quando utilizadas para induzir modelos experimentais de enfisema, levam há diferentes tempos e velocidades de adaptação muscular, fornecendo informações sobre a escolha de um modelo experimental adequado Em adição, o modelo por elastase leva a adaptação muscular precoce, com ausência de atrofia e sem envolvimento direto do estresse oxidativo neste processoItem Análise quantitativa de ocratina A (OTA) em plasma humano por ensaio imunoenzimático, e efeito citotóxico in vitro de OTA e FB1 em linhagem celular Jurkat e P3U1Rigobello, Fabiana Felipin; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Marquez, Audrey de Souza; Ono, Elisabete Yurie Sataque; Venâncio, Emerson José; Kwasniewski, Fábio Henrique; Hirooka, Elisa Yoko [Coorientadora]Resumo: Micotoxinas são metabólitos secundários de fungos pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium e são contaminantes naturais de alimentos no Brasil Ocratoxina A (OTA) e Fumonisina B1 (FB1) são classificados como possível carcinógenos para humanos e animais (grupo 2B) Esta pesquisa objetivou introduzir metodologia de ELISA para analisar e quantificar a presença de OTA em plasma humano e avaliar o efeito de OTA e FB1 in vitro em linhagem celular P3U1 e Jurkat Na primeira etapa do trabalho: (1) investigou-se a presença de OTA no plasma de pacientes por ELISA competitivo indireto usando anticorpos monoclonais (AcM) anti-OTA; (2) determinou-se a estimativa de ingesta diária de OTA por estes pacientes e; (3) avaliou-se a correlação da presença de OTA com marcadores plasmáticos de lesão hepática e renal Os resultados obtidos demonstraram que OTA foi detectada em 55% das amostras (733,6 ± 296,4 pg/mL, máximo 1584,6 pg/mL), com uma estimativa de ingesta diária de 983,1-1445,3 pg/kg de peso corporal Não houve correlação entre os níveis de OTA e parâmetros bioquímicos (AST, ALT, ureia e creatinina) Na segunda etapa, avaliou-se: (1) o efeito citotóxico de OTA e FB1, individualmente ou em associações, sobre linhagens celulares P3U1 e Jurkat, através do método de brometo de [3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (MTT) e dosagem de lactato desidrogenase (LDH) e; (2) a interação de AcM anti-OTA em células tratadas com OTA por imunocitoquímica A viabilidade das células foi reduzida com exposição à 9 µg/mL de micotoxinas após 24 h, sendo que OTA reduziu a viabilidade de P3U1 e Jurkat de forma semelhante, e FB1 somente de célula Jurkat O uso associado de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxico sobre as células Os métodos de MTT e LDH apresentaram forte correlação nas células Jurkat (r = ,749) e P3U1 (r = ,931) Imunocitoquímica confirmou a diminuição da viabilidade celular de Jurkat e P3U1 tratadas com OTA, bem como aumento de grânulos intracelulares marcados com substrato peroxidase e destruição da membrana plasmática com liberação do citosol, indicando a presença de OTA nestas células Conclui-se que pessoas no Brasil estão contaminadas por OTA, porém o nível de contaminação está abaixo do limite tolerável divulgado por órgãos internacionais, e possivelmente esse é o motivo pelo qual não se observou correlação entre os níveis plasmáticos de OTA e parâmetros bioquímicos de lesão hepática e renal Conclui-se com os resultados in vitro que a presença de OTA induz citotoxicidade, mas nas condições estudadas, a associação de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxico