01 - Doutorado - Patologia Experimental

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Antigenúria, níveis de anticorpos específicos e análise histopatológica de pulmões em ratos experimentalmente infectados com Paracoccidioides lutzii e Paracoccidioides brasiliensis
Chiyoda-Rodini, Franciele Ayumi Semencio; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Lenhard-Vidal, Adriane; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson José
Resumo: Paracoccidioides brasiliensis e a nova espécie Paracoccidioides lutzii são os agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), importante micose sistêmica amplamente distribuída na América Latina A glicoproteína Gp43, é o principal fator de virulência e é considerada padrão ouro no diagnóstico de P brasiliensis Porém tal glicoproteína é expressa em níveis não detectáveis em isolados de P lutzii, além disso, os dados relativos ao desenvolvimento da doença por PCM devido a esses fungos são escassos No presente estudo, comparou-se o efeito da infecção em ratos pelo fungo P lutzii (LDR2), não produtor de gp43 e por P brasiliensis (Pb18) Grupos de 5 ratos Wistar infectados (3x16 leveduras, iv) e grupo controle inoculado com PBS, foram eutanasiados 14, 28 e 56 dias após a infecção As amostras de urina foram analisadas por eletroforese, imunotransferência (IB) e a concentração de antígenos urinários totais e de gp7 determinados por ensaio imunoenzimático competitivo indireto (icELISA), utilizando anticorpos policlonais antiCFA de P lutzii e anti-CFA de P brasiliensis e anticorpo monoclonal anti-gp7, respectivamente Os níveis séricos de anticorpos IgG foram avaliados por ELISA e análise histológica de pulmão por coloração com Grocott Por eletroforese e IB, observou-se perfil distinto de bandas de antígenos entre as infecções por P lutzii e P brasiliensis Por icELISA, os níveis urinários de antígenos totais (CFA) foram significativamente maiores em ratos infectados por P brasiliensis em relação ao P lutzii, em todos os períodos analisados (P<5) Houve aumento em níveis de gp7 em todos os períodos analisados para ambos os grupos infetados, em relação ao grupo controle (p<5), porém em 28 dias de infecção o nível foi maior em infectado por P lutzii (p<5) Níveis séricos elevados de anticorpos IgG foram detectados em ambos, porém significativamente mais elevado em infectados por P brasiliensis (p<5) Pela análise histológica foi observada a presença de fungos em todos os 8 períodos em ambos os grupos, todavia em maior quantidade em animais infectados por P brasiliensis Pb18 Em conclusão, P lutzii (LDR2) possivelmente induz a PCM doença controlada, menos grave que a induzida por P brasiliensis em ratos, o que requer mais estudos Este estudo evidenciou pela primeira vez os principais antígenos P lutzii presentes em urinas de ratos infectados com P lutzii (LDR2)
Níveis séricos de citocinas IL-4, IL-10, IL-12, IL-17 e TNF? e de IgG/IgE aos antígenos dentinários em pacientes submetidos a tratamento ortodôntico
Lima, Carlos Eduardo de Oliveira; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hidalgo, Mirian Marubayashi; Nakanishi-Ito, Fernanda Akemi; Tanaka, Evelise Ono; Venâncio, Emerson José
Resumo: Objetivo: A reabsorção radicular decorrente da movimentação dentária induzida é um processo patológico de natureza inflamatória, que pode ser observada em tratamentos ortodônticos A melhor compreensão de mecanismos imunopatológicos envolvidos nesse processo poderá contribuir para o diagnóstico precoce da reabsorção radicular O presente estudo teve como objetivo determinar níveis séricos de citocinas e de IgG e IgE aos antígenos dentinários em pacientes submetidos a tratamento ortodôntico Metodologia: A partir de uma amostra de 34 pacientes, foram analisadas, radiografias periapicais dos incisivos centrais superiores obtidos antes da colocação do aparelho ortodôntico (T), aos 6-7 meses de tratamento (T1) e aos 12-13 meses de tratamento (T2), e avaliados os níveis séricos de citocinas IL-4, IL-1, IL-12, IL-17 e TNFa e imunoglobulinas IgG e IgE específicas ao antígeno dentinário humano por ensaio imunoenzimático O extrato dentinário humano (EDH) foi obtido a partir de terceiros molares íntegros, inclusos ou semi-impactados com indicação cirúrgica, obtendo-se inicialmente, dentina em pó que foi tratada com solução desmineralizadora Os dados foram comparados à quantidade de perda radicular observada em radiografias periapicais dos incisivos centrais superiores obtidos nas 3 fases do tratamento, analisadas pelo método de subtração radiográfica digital e reconstrução geométrica da imagem Resultado: Os níveis de citocinas IL-1, IL-12 e IL-17 demonstraram alterações significativas, especialmente quando avaliadas em relação à extensão das reabsorções radiculares Os níveis de anticorpos IgG e IgE ao extrato dentinário total não apresentaram diferenças significativas, todavia os níveis de IgG contra duas principais frações de EDH diminuíram significantemente no decorrer do tratamento ortodôntico sem apresentar correlação com o grau de reabsorção radicular Conclusão: Os níveis sistêmicos de IL-4, TNFa e IgE anti-extrato dentinário permanecem inalterados no decorrer do tratamento ortodôntico, mas ocorre modulação sistêmica de citocinas IL-1, IL-12 e IL-17 dependendo do período e extensão da reabsorção e de anticopos IgG às frações de extrato dentinário independentemente do grau de reabsorção
Participação da IL-33 em modelos de resposta inflamatória inata e dor neuropática em camundongos
Zarpelon, Ana Carla; Verri Junior, Waldiceu Aparecido [Orientador]; Cunha, Joice Maria da; Werner, Maria Fernanda de Paula; Moreira, Estefânia Gastaldello; Ceravolo, Graziela Scalianti
Resumo: A IL-33 é um membro da família de citocinas IL-1, que sinaliza via receptor ST2 Essa citocina está envolvida na dor induzida pela resposta imune adaptativa, entretanto, pouco se sabe a respeito do papel da IL-33 em modelos de resposta imune inata e dor neuropática Nesse trabalho demonstramos os mecanismos pelos quais a IL-33 contribui para inflamação inata induzida pela carragenina Além disso, foi investigado o papel da IL-33 em modelo de neuropatia induzido pela injúria por constrição crônica do nervo ciático em camundongos No primeiro momento, avaliamos se a carragenina e a IL-33 eram capazes de induzir a resposta inflamatória em animais BALB/c (selvagem) e deficientes para o receptor ST2 através da avaliação dos parâmetros: edema, atividade de mieloperoxidade, hiperalgesia mecânica, citocinas, expressão de RNA mensageiro e tratamentos farmacológicos inibindo o recrutamento leucocitário (fucoidina), TNFa (infliximab), CXCL1 (anticorpo contra CXCL1), IL-1 (antagonista do receptor da IL-1), endotelinas, receptor ETA (clazosentan) e ETB (BQ788) e ciclooxigenase (indometacina) A fim de avaliar o papel da IL-33 na dor neuropática, a hiperalgesia mecânica também foi avaliada, os níveis de citocinas foram determinados por ELISA, ativação de proteínas foi determinada pelo método de western blot e, além disso, foram utilizadas ferramentas farmacológicas para alvos específicos A injúria por constrição crônica foi induzida por ligação no nervo ciático Diferenças estatísticas foram consideradas significativas para p<5 Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de São Paulo e Universidade Estadual de Londrina Os resultados demonstraram que a administração de carragenina aumentou a expressão de RNAm para ST2 e IL-33 e a produção de IL- 33 em amostras de pele de pata Além disso, a administração de carragenina na pata induziu edema, hiperalgesia mecânica e atividade de mieloperoxidase, que foi reduzida nos animais ST2-/- em comparação com os selvagens, os mesmos efeitos foram observados pela administração de IL-33 na pata A hiperalgesia induzida pela IL-33 foi reduzida pelo tratamento com fucoidina, sugerindo o papel do recrutamento de leucócitos no efeito hiperalgésico Em animais naïve a hiperalgesia induzida pela IL-33 foi reduzida pelos tratamentos farmacológicos para os seguintes alvos, TNF-a, CXCL1, IL-1, receptores de endotelina e ciclooxigenase, enquanto que a produção de TNF-a, CXCL1, IL-1ß, IL-1 e PGE2, bem como, a expressão de RNAm para prepro-ET-1 induzidos pela carragenina foram dependentes do receptor ST2 A administração combinada de IL-33 e carragenina, em doses submáximas em tratamento único, induziu hiperalgesia, edema, atividade de mieloperoxidase e produção de citocinas de maneira dependente de ST2 Investigando o papel da IL- 33 na dor neuropática, foi demonstrado que a injúria por constrição crônica induz uma produção significativa de IL-33 na medula espinal (L4-L6) e aumento da hiperalgesia durante 2 dias, começando 3 dias após a cirurgia, a qual foi inibida em camundongos deficientes para ST2 A administração intratecal (it) de IL-33 induziu a hiperalgesia de maneira dose-dependente, que foi inibida nos camundongos ST2-/- e TNFR1-/- e pelo tratamento com o antagonista do receptor da IL-1, bem como induziu a produção espinal de TNFa and IL-1ß A hiperalgesia induzida pela administração it de IL-33 foi reduzida pelo tratamento com inibidores de PI3K, mTOR, MAP kinases (p38, ERK e JNK) e NF?B Corroborando, a injúria por constrição crônica induz a ativação espinal de PI3K, AKT, mTOR, MAP kinases e NF?B, verificado pelo método de western blot, o que foi reduzido nos camundongos ST2-/- O tratamento com minociclina e fluorocitrato inibiu a hiperalgesia induzida pela IL-33 e pela injúria por constrição crônica, e nos animais deficientes para o ST2-/-, houve redução na ativação de GFAP e Iba-1 na medula espinal Dessa forma, a sinalização IL-33/ST2 é importante na produção de mediadores inflamatórios contribuindo para a inflamação induzida pela carragenina Além disso, a via IL-33/ST2 medeia a dor induzida pela injúria por constrição crônica pela ativação de mecanismos espinais importantes, que incluem PI3K/AKT, mTORC1 e 2, MAPK (p38, ERK e JNK) e NF?B Esses dados reforçam a importância da sinalização IL-33/ST2 como alvo na dor inflamatória e neuropática
Efeito imunopatológico da infecção associada com Schistosoma mansoni e Paracoccidioides brasiliensis no hospedeiro
Menezes, Maria Claudia Noronha Dutra de; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Marquez, Audrey de Souza; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Santos, Marcos Andre Vannier dos; Ono, Mário Augusto
Resumo: A esquistossomose mansoni e a paracoccidioidomicose (PCM) são doenças infecciosas crônicas de grande importância para a saúde publica, com distribuição sobreposta em várias regiões do Brasil Seus agentes etiológicos, o helminto Schistosoma mansoni (Sm), e o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb), são causadores de doenças granulomatosas intimamente relacionadas à resposta imune aos antígenos dos parasitos, sendo mediadas principalmente pela ativação de células Th2 e Th1, respectivamente Dados da literatura tem demonstrado a importância da co-infecção por Sm na resposta imune e nas manifestações clínicas de outras doenças infecciosas Entretanto faltam dados sobre a associação entre o Sm e o Pb tanto em seres humanos como em modelo experimental em animais, assim como o impacto imunopatológico causado no hospedeiro Com esse intuito, foram inicialmente detectados casos de esquistossomose apresentando reatividade sorológica para Pb, avaliando-se a seguir a resposta imune nesse grupo O efeito imunopatológico também foi investigado utilizando modelo experimental em camundongos BALBc co-infectados com Sm e Pb Das 1 amostras de soros de pacientes, moradores em zona endêmica e portadores de esquistossomose mansoni, 15 apresentaram sorologia positiva para gp43, uma glicoproteina considerada especifica de Pb Contudo, nenhum paciente apresentou sintomas clínicos, portanto foram classificados como portadores de PCM-infecção Com a finalidade de avaliar se a resposta imune seria modulada nos indivíduos co-infectados, análise sorológica de IgE e IgG anti- antígeno solúvel do ovo (SEA) e IgE anti-antígeno de vermes adultos (SWAP) e os níveis séricos das citocinas Th1(IFN-?, IL-12), Th2 (IL-4, IL-13), TH17(IL-17) e T regulatória IL-1, foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA), nos grupos de pacientes co-infectados (Sm/Pb) e nos grupos controles, de indivíduos saudáveis (NHS) e somente com esquistossomose (Sm) Para avaliar o impacto imunopatológico da co-infecção no modelo experimental, foram utilizados grupos de camundongos: infectados concomitantemente com S mansoni e P brasiliensis durante 7 dias (Sm7Pb7), com infecção patente de Sm e após 42 dias infectados com Pb (Sm7Pb28), e como controles animais com Sm por 7 dias (Sm7) com Pb por 28 dias (Pb28) e Pb por 7 dias (Pb7) Em todos os animais, foram efetuadas análises histopatológicas do fígado, avaliação das citocinas hepáticas (IL-4, IL-13, IL-1 e IFN-?) e das citocinas (IL-4 e IFN-?) do soro Os resultados de co-infecção humana demonstraram níveis significativamente mais elevados de IgE e IgG antígenos (SEA e SWAP) anti S mansoni e níveis de IL-13 em ambos os grupos de pacientes em comparação ao controle normal, mas não dentro dos grupos infectados (Sm e Sm/Pb) Níveis significativamente mais elevados de IL-4 foram observados no grupo de Sm em comparação com os outros grupos, e não houve diferença nos níveis de IL-12 e IL-17 entre os grupos Os níveis de IFN-? e IL-1 foram significativamente mais elevados no grupo considerado co-infectado (SmPb) em relação aos controles Sm e SHN Os resultados de infecção experimental de camundongos demonstraram diminuição significativa no número de granulomas hepáticos de S mansoni em grupo co-infectado Com relação às citocinas hepáticas, o grupo Sm7Pb28 apresentou aumento significativo de IL- 4 e IL- 1, e ambos os grupos de animais co-infectados (Sm7Pb7 e Sm7 Pb28) apresentaram níveis elevados de IL-13 Os níveis de IFN-? encontrados no soro, foi maior nos animais co-infectados Em relação, ao efeito do S mansoni sobre o curso da infecção do P brasiliensis, o grupo com infecção concomitante (Sm7Pb7) apresentou aumento significativo no número de granulomas do fungo no fígado, e diminuição significativa dos níveis das citocinas hepáticas IL-4, IL-1 e IFN-? e, nível elevado de IL-4 sérica pode ser observado em relação aos animais do grupo Pb7 Nesse mesmo grupo foi detectada a presença de alguns granulomas com ausência parcial de contorno entre os dois agentes No grupo dos co-infectados também foi verificada a presença de S mansoni e P brasiliensis em outros órgãos Este estudo mostrou pela primeira vez casos de seres humanos com esquistossomose apresentando reação sorológica positiva com P brasiliensis, possivelmente co-infectados e, modulação de citocinasNo modelo murino, os dados mostraram que o impacto da infecção associada entre S mansoni e P brasiliensis provoca a modulação de citocinas e do número de granulomas do fígado, sugerindo também agravamento da doença As discordâncias encontradas entre os níveis de citocinas nos grupos co-infectados merecem maiores esclarecimentos, com estudos adicionais feitos em diferentes períodos de inoculação e dosagens de novas citocinas e quimiocinas
Perfil oxidativo sistêmico do câncer de mama e sua significância clínico-patológica : papel do TGF-beta 1 e caracterização dos subtipos moleculares
Herrera, Ana Cristina da Silva do Amaral; Cecchini, Rubens [Orientador]; Colado-Simão, Andrea Name; Zanoni, Jacqueline Nelisis; Graudenz, Marcia Silveira; Rodrigues, Marco Aurélio
Resumo: O câncer de mama consiste em uma doença heterogênea com múltiplos comportamentos biológicos e clínicos Para o estadiamento desta neoplasia utiliza-se uma classificação molecular baseada na expressão molecular de receptores de estrogênio (ER), progesterona (PR) e do fator de crescimento epidérmico humano (HER-2) Neste estudo, definimos o perfil inflamatório dos principais subtipos moleculares de pacientes com câncer de mama: luminal (ER e PR positivo, HER-2 negativo), HER-2 positivo e triplo negativo (ER, PR e HER-2 negativo) Para avliação do perfil de citocinas foi realizada a determinação da TNF-a, TGF-b, IL-1, IL-12 os níveis plasmáticos de IL-1 e O perfil oxidativo foi avaliado pela determinação da peroxidação lipídica, capacidade antioxidante total do plasma, os níveis de malondialdeído, carbonilação proteica e óxido nítrico (NO) Os dados clínicos foram correlacionados com os achados inflamatórios Nossos resultados demonstraram que pacientes portadores do subtipo luminal apresentavam níveis de estresse oxidativo elevado, TNF-a, TGF ß-com concentrações elevadas associado com a redução de IL-12 Grupo de HER-2 positivo apresentou maiores níveis de TNF-a, IL-12 e TGF ß associado com um aumento do estresse oxidativo O subtipo triplo-negativo exibiu o perfil mais agressivo de comportamento da doença, com redução tanto TNF-a e TGF ß, com altos níveis de lipoperoxidação e NO A importância clínica dos resultados reside no fato de que o estado inflamatório varia de formas distintas em relação aos subtipos moleculares, podendo futuramente determinar a utilização de terapias alvo
Análise da produção de anticorpos IgY das características histológicas do baço e da medula óssea de galinhas poedeiras inoculadas com venenos de serpentes
Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Loyola, Wagner; Ramos, Solange de Paula; Itano, Eiko Nakagawa; Pavanelli, Wander Rogério
Resumo: Acidentes ofídicos são causados principalmente por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e tratados pela administração de antissoro de mamíferos Como alternativa a este procedimento, a utilização de anticorpos IgY antiveneno produzidos em galinhas poedeiras tem sido avaliada nos últimos anos Neste trabalho foram realizados dois experimentos No primeiro experimento, foi investigada a participação do baço e da medula óssea na produção de anticorpos IgY em galinhas poedeiras white leghorn (Gallus gallus domesticus) imunizadas com veneno crotálico Amostras de soro e gema foram coletadas durante o experimento, para análise da produção de anticorpos IgY Ao final deste, o baço e a medula óssea dos animais foram coletados e submetidos à análise histológica Os resultados mostraram um aumento dos anticorpos IgY crotálico no soro e na gema, a partir do 32º dia após a primeira imunização Estes níveis permaneceram elevados à medida que foram administradas doses de reforço do veneno usado como antígeno A inoculação de veneno crotálico em galinhas poedeiras induziu a produção de anticorpos IgY, principalmente na polpa branca perielipsoidal do baço e também no espaço extravascular da medula óssea No segundo experimento, galinhas poedeiras foram imunizadas com venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e observadas durante 367 dias Os anticorpos IgY antiveneno foram coletados no soro e na gema dos ovos e avaliados segundo os seguintes parâmetros: níveis, avidez, padrão de reconhecimento antigênico e eficácia Os níveis de anticorpos IgY antibotrópico anticrotálico produzidos aumentaram significativamente após a segunda imunização e assim permaneceram até o final do experimento Índices significativamente elevados de avidez foram observados para anticorpos IgY antibotrópico no 142º dia e para anticorpos IgY anticrotálico no 232º dia após a primeira imunização Os anticorpos IgY antibotro pico reconheceram antí genos de massa molecular de 25 kDa e 5 kDa, enquanto os anticorpos IgY anticrota lico reconheceram principalmente antí genos de massa molecular de 14 kDa e 3 kDa Os antí genos foram mais bem reconhecidos ao final do perí odo experimental Utilizando amostras de soluções aquosas de anticorpos com concentração proteica de 15 mg/ml verificou-se que a solução contendo IgY antibotrópico apresentou eficiência 29µl/3DL5 e potência ,37mg/ml As amostras de solução aquosa contendo anticorpos IgY anticrotálico apresentaram eficiência 246µl/4DL5 e potência de ,829 mg/ml A produção de anticorpos IgY antibotrópico e anticrotálico pôde ser melhorada mediante administração de sucessivas doses dos venenos durante período de imunização superior a 6 meses, afim de se atingirem níveis de anticorpos e índices de avidez mais elevados A avidez elevada e a maior concentração dos anticorpos IgY antiveneno permitiram a neutralização de componentes tóxicos dos venenos inoculados, impedindo seus efeitos letais, sugerindo que estes anticorpos tenham aplicabilidade no tratamento de acidentes ofídicos
Avaliação do frutoligossacarídeo inulina : toxicidade e efeitos na expressão gênica do fator de transcrição FOXP3 e TGFB
Gualtieri, Karina de Almeida; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Sforcin, José Maurício; Ariza, Carolina Batista; Oliveira, Gabriela Gonçalves de; Amarante, Marla Karine; Suzuki, Karen Brajão de Oliveira [Coorientadora]
Resumo: A identificação de componentes da dieta, a compreensão de seus mecanismos de ação, bem como seu desenvolvimento e utilização na alimentação humana são alguns dos objetivos junto a ciência dos alimentos funcionais a-D-glucopiranosil-[a-D-fructofuranosil](n-1)-D-fructofuranoside, comumente conhecida como inulina, é um polissacarídeo de origem vegetal natural, com uma gama diversificada de aplicações alimentares e farmacêuticas Oligossacarídeos do tipo inulina são considerados como prebióticos, por suas propriedades não digeríveis dos hidratos de carbono, encontradas em muitos vegetais, frutos e cereais Embora a literatura indique que a inulina é um alimento funcional, eficaz e promissor, estudos ainda são necessários para elucidar o seu potencial na modulação da imunidade sistêmica e seu papel na prevenção de doenças crônicas Nos últimos anos tornou-se evidente que uma subpopulação de células T, denominadas células T reguladoras (Tregs), desempenham papel importante na manutenção da tolerância a auto-antígenos, sendo o fator de transcrição FOXP3 um marcador desse tipo celular e ainda podem ser induzidas por uma citocina denominada fator de transformação do crescimento-ß (TGF-ß) Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar se a inulina possui efeito tóxico in vivo, e também avaliar seu efeito sobre a expressão, in vitro, do TGFB e FOXP3 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) Os resultados mostraram que a inulina não induziu qualquer lesão hepática ou renal e alterações nos parâmetros séricos, exceto para o nível de ALT Não houve influência significativa da inulina junto às alterações histológicas, sugerindo outra causa para a alteração de ALT, concluindo assim, que frutanos do tipo inulina não têm efeito significativo sobre transaminases séricas, valores de MDA ou análises histopatológicas in vivo As análises in vitro mostraram que não houve diferença nos níveis de TGF-ß no sobrenadante de cultura de células, porém foi possível detectar, por PCR em tempo real, o aumento de expressão de FOXP3 e uma tendência ao aumento de TGFB nas células tratadas com inulina Embora a inulina represente uma potencial fonte como composto seletivo e de efeitos farmacológicos e imunologógicos, sua utilidade na terapêutica revela um aspecto da investigação científica e abre perspectivas para pesquisas futuras
Anticorpos e imunocomplexos aos antígenos dentinários em ratos e anticorpos salivares e resposta linfoproliferativa para frações de dentina humana associados à reabsorção dentária no tratamento ortodôntico
Costa, Tânia Maris Pedrini Soares da; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Hidalgo, Mirian Marubayashi; Lima, Carlos Eduardo Oliveira; Marquez, Audrey de Souza
Resumo: O potencial imunogênico da dentina tem sido atribuído a antígenos que estariam presentes na dentina, os quais poderiam ser expostos ao sistema imune durante os processos de reabsorção radicular como consequência do tratamento ortodôntico Este estudo teve como objetivo investigar em modelo animal, a resposta imune humoral sistêmica e local aos antígenos dentinários, a formação de imunocomplexos e os níveis séricos de antígenos dentinários solúveis; e em humano, os níveis de IgG salivar, a resposta linfoproliferativa à frações de dentina humana e a correlação entre os dados encontrados Em modelo experimental, quarenta ratos Wistar machos escolhidos aleatóriamente foram submetidos ao movimento de inclinação mesial do primeiro molar superior direito, por aplicação de uma força ortodôntica de 55 cN por 3, 7, 14 e 21 dias ou deixado sem tratamento (controle) Após cada periodo experimental, amostras de saliva, sangue e a maxila direita de cada animal foram coletadas para análise O estudo humano constituiu-se de 3 grupos Grupo I, formado por pacientes adolescentes (n=1) onde amostras de saliva foram coletadas em 4 periodos: antes (T), 3 (T3), 6 (T6) e 12 (T12) meses de tratamento ortodôntico, para análise dos níveis de reatividade da IgG salivar para as frações FI, FII ou FIII de extrato dentinário humano No grupo II (n=3), amostras de soro e células mononucleares do sangue periférico de pacientes adolescentes com 6 meses de tratamento ortodôntico foram coletadas para análise dos níveis de IgG sérica e resposta linfoproliferativa às frações de extrato dentinário humano FI ou FIII No terceiro grupo (n=16), voluntários adolescentes que nunca haviam se submetido à tratamento ortodôntico e sem sinais radiográficos de reabsorção radicular, serviram de controle para o segundo grupo de estudo O extrato dentinário total foi obtido à partir de incisivos de rato Wistar ou de dentes terceiros molares humano, respectivamente, sendo que em humano o extrato dentinário foi submetido à cromatografia de gel filtração, Sephadex G-12-15 A reabsorção radicular foi avaliada por análise histopatológica em microscópio óptico em modelo animal e através do método de subtração radiográfica digital dos incisivos superiores, em humano Os níveis de anticorpos, imunocomplexos e antígenos dentinários solúveis no soro foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA) Para o estudo da resposta linfoproliferativa, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humano estimuladas com frações dentinárias foram analisadas por ensaio MTT Níveis mais elevados de IgG sérica em ratos foram detectados em 14 e 21 dias em relação ao controle (p < 5) No entanto, em saliva foram detectados um aumento dos níveis de IgG salivar em 3 e 7 dias em comparação com o controle (p < 1) e uma diminuição de seus níveis em 21 dias em relação a 3 e 7 dias (p < 5) Níveis mais elevados de imunocomplexos no soro foram detectados em 14 e 21 dias (p < 1) e na saliva em 14 dias (p < 5) em relação ao controle, com uma diminuição em 21 dias em relação à 14 dias (p < 5) No grupo I humano foi observado uma maior reactividade da IgG salivar para a fração FII em relação à FIII em T6 e T12 (P < 5) e no grupo II houve uma correlação positiva significante entre proliferação de linfócitos e níveis de IgG sérica para a fração III (r = 58) Em conclusão, houve imunomodulação na resposta de anticorpos IgG salivar a antígenos dentinários durante o tratamento ortodôntico em ratos que diferem secreção sistêmica, da externa (saliva) Os níveis de imunocomplexos em soro ou saliva tem potencial para servir de marcadores biológicos, por indicar a fase ativa da reabsorção radicular Em humanos, mudança na reatividade IgG salivar para FII no decorrer do tratamento ortodôntico também sugerem o potencial desses anticorpos como marcadores biológicos para a detecção precoce da reabsorção radicular
Alteração neurológica na infecção experimental murina por Candida parapsilosis e caracterização de antígenos solúveis
Silva, Paula Leonello Álvares e; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Tatibana, Berenice Tomoko; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Ono, Mário Augusto
Resumo: Candida parapsilosis é um importante patógeno associado a infecções sanguíneas mas estudos sobre virulência e patogenicidade são escassos Considerando que estudo evidenciou alteração comportamental em camundongo infectado, avaliou-se efeito imunopatológico no decorrer de infecção sistêmica em camundongos, aliada a caracteriazação parcial de fator hemolítico de C parapsilosis Grupos de camundongo SWISS e BALB/c foram infectados por via endovenosa (1x18 leveduras/animal), sendo o primeiro por 56 dias e o segundo durante 7, 14, 28 e 56 dias, tendo como controle o PBS Foram analisadas: alterações comportamentais determinando-se número de giros/5min, detecção de células de Purkinje por imunofluorescência (anti-calbindin), contagem de células Purkinje por histopatologia, análise de apoptose utilizando anti-ligante de Fas por imunohistoquímica, no cerebelo de camundongos infectados durante 56 dias Determinou-se também antigenemia por CFU e ELISA CAPTURA, níveis de citocinas (INF-?, IL- 4, IL-17 e IL-1), expressão e atividade de indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO) no cerebelo de camundongos infectados durante 7, 14, 28 e 56 dias No decorrer de infecção foi avaliada também respostas imune humoral (ELISA), celular (DTH) anti “cell free antigen” (CFA) de C parapsilosis e citocinas circulantes (INF-?, IL- 4, IL-17 e IL-1) Para a caracterização de fator hemolítico, foi avaliada a atividade lítica de eritrócitos de camundongos utilizando CFA na forma nativa e aquecida (56°C, 1 h) e as frações de CFA obtidas por gel filtração (Sephadex G-1/12) e por filtração em Amicon (1k e 5k) Os níveis de carboidratos totais, capacidade de ligação à ConA e de reatividade aos anticorpos específicos (anti-eritrocito autólogo sensibilizado com CFA) foram determinados em frações de gel filtração Além disso, as frações foram analisadas por western blotting, investigada a capacidade de anticorpos neutralizarem a atividade hemolítica e foram determinados os níveis de IgG anti-fração hemolítica em camundongos infectados com C parapsilosis Os resultados demonstraram diminuição de células de Purkinje (p<,5) e correlação significativa entre a diminuição dessas células e o aumento no número de giros (r= 9876) e reação com anti- 12 ligante de Fas foi negativa, no cerebelo Detectou-se aumento significativo em CFU (7 e 14 dias) (p<,5), de todas as citocinas (7 dias) (p<,5) e expressão de IDO (7>14>28 dias) (p<,5) ou de atividade de IDO (7,14 dias) (p<,5) no cerebelo, em relação ao controle Além disso, níveis elevados de anticorpos IgG (p <,5) ou DTH (p <,5) a CFA (p <,5) (28 e 56 dias) e de níveis séricos de citocinas INF-? (7 e 14 dias) (p<,5), IL-1 (56 dias) (p<,5) e IL-17 (56 dias) (p<,5) foram detectados no decorrer de infecção de camundongos Concluímos pelos resultados que as respostas imunes especificas e modulação de citocinas devem participar na diminuição de carga fúngica no cérebro, mas por outro lado devem apresentar efeito imunopatológico, possivelmente com participação de IDO levando a diminuição quantitativa de células Purkinje no cerebelo e como consequência induzindo alteração comportamental dos camundongos infectados, o que requer estudos adicionais Em relação ao fator hemolítico, concluímos que o fungo C parapsilosis apresenta fator hemolítico de alta MM (~ 28kDa e ~ 3kDa), é termoestável e apresenta a capacidade de induzir resposta imune no decorrer de infecção e, se essa resposta específica participa na defesa, requer estudos adicionais
Naringenina reduz inflamação e dor : efeito sobre o fator nuclear Kappa B e via analgésica do óxido nítrico
Ribeiro, Felipe Almeida de Pinho; Verri Junior, Waldiceu Aparecido [Orientador]; Guidoni, Ana Carolina Rossaneis; Arakawa, Nilton Syogo; Pinge Filho, Phileno; Pavanelli, Wander Rogério
Resumo: A dor inflamatória gera desconforto e reduz drasticamente a qualidade de vida de pacientes de doenças onde há persistência do processo inflamatório A baixa eficácia e os efeitos adversos dos tratamentos atuais justificam a necessidade de caracterização de novos compostos com potencial terapêutico e baixa toxicidade O presente estudo investigou os efeitos da naringenina, um flavonóide presente em grandes quantidades nas frutas cítricas, na redução da dor e da inflamação Para isso, camundongos Swiss foram tratados com naringenina (16,7 – 15 mg/kg, via oral), antes ou após a aplicação dos estímulos inflamatórios Foram utilizados estímulos clássicos no estudo da dor inflamatória: ácido acético, parabenzoquinona, formalina, capsaicina, adjuvante completo de Freund, carragenina, prostaglandina E2, e LPS Para avaliação da intensidade da dor, foram avaliados os comportamentos de contrações abdominais, sacudidas e lambidas de pata, ou retiradas de pata após estímulo mecânico (analgesímetro digital) ou térmico (placa quente), dependendo do estímulo utilizado e da região estimulada O efeito da naringenina na produção de citocinas inflamatórias, no estresse oxidativo, e na ativação e recrutamento de leucócitos também foi avaliado após estímulo com carragenina ou LPS A ativação da via analgésica do óxido nítrico e a inibição da via inflamatória do fator nuclear kappa B (NF-?B) foram avaliadas após estímulo com carragenina e LPS, respectivamente O tratamento com naringenina foi amplamente eficaz em reduzir a dor inflamatória induzida por todos os estímulos utilizados neste trabalho Seu efeito foi acompanhado de reduções na produção de citocinas (IL-1ß, IL-6, IL-33, IL-12 e TNFa) e na atividade do NF-?B Houve também redução na ativação e recrutamento de neutrófilos e macrófagos e no estresse oxidativo Por fim, a inibição da via analgésica do óxido nítrico reverteu os efeitos da naringenina na redução da hiperalgesia A naringenina não alterou a atividade motora nem a resposta a estímulos dolorosos na ausência de inflamação O tratamento diário prolongado (7 dias) com naringenina não causou danos gástricos ou hepáticos Esses resultados sugerem que a naringenina é amplamente eficaz na redução da dor inflamatória através da ativação da via analgésica do óxido nítrico e da inibição da via inflamatória do NF-?B
Efeito do bloqueio de COX-1 e de COX-2 sobre a invasão de células do hospedeiro por Trypanosoma cruzi
Malvezi, Aparecida Donizette; Pinge Filho, Phileno [Orientador]; Toledo, Karina Alves de; Peron, Jean Pierre Schatzmann; Kwasniewski, Fábio Henrique; Verri Junior, Waldiceu Aparecido
Resumo: Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas (DC), afeta milhões de pessoas na América Latina A invasão por T cruzi e sua replicação intracelular são essenciais para o ciclo de vida do parasito e para o desenvolvimento da DC Nós apresentamos evidências sugerindo o envolvimento da ciclooxigenase-1 e 2 (COX-1/COX-2) do hospedeiro durante a invasão por T cruzi A inibição farmacológica de COX-1 com aspirina (ASA) provocou marcante inibição da infecção quando macrófagos pré- tratados com ASA por 3 minutos a 37°C antes da inoculação com T cruzi Esta inibição foi associada com aumento da produção de TNF-a, óxido nítrico (NO) e IL1-ß por macrófagos O tratamento de macrófagos com inibidores das óxido nítrico sintases (iNOs e cNOs) ou a adição de PGE2 restauraram a capacidade invasora deTcruzi em macrófagos previamente tratados com ASA Interessante, o efeito provocado pela ASA foi mediado por “Lipoxina iniciada por aspirina” Em adição, o tratamento de células cardíacas de coração de ratos (mioblastos-H9C2) pré-tratadas com inibidores de COX-1 (aspirina) e COX-2 (celecoxibe) por 6 minutos a 37°C, também inibiu a infecção por T cruzi Esta inibição está associada com aumento da produção de NO e IL1- ß e com redução da produção de TGF-ß pelos mioblasto Nossos resultados indicam que PGE2, NO, lipoxinas e TGF-ß estão envolvidos na regulação da atividade anti-T cruzi por macrófagos e mioblastos, fornecendo um melhor entendimento do papel das prostaglandinas na resposta inflamatória inata durante a infecção por T cruzi E abrem novas possibilidades para investigação de novas abordagens terapêuticas contra a doença de Chagas
Detecção molecular de espécies de Candida por semi-nested PCR
Pitz, Amanda de Fáveri; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Silva, Carla Cristiane da; Carrara, Floristher Elaine; Panagio, Luciano Aparecido
Resumo: O diagnóstico da candidemia é complexo, e a confirmação da infecção por meio de diagnósticos laboratoriais é fundamental A técnica padrão para o diagnóstico é a hemocultura com o isolamento de fungos, entretanto, devido ao longo tempo requerido para a obtenção do resultado, confere-se a candidemia como uma infecção fúngica sistêmica com alta taxa de mortalidade Visando agilizar o diagnóstico laboratorial, nos quesitos de tempo de obtenção do resultado, aumento da especificidade e da sensibilidade, bem como a monitorização epidemiológica das candidemias, o uso de testes baseados em PCR para detectar o DNA de Candida spp é atualmente considerado promissor na investigação em amostras clínicas, considerando baixas concentrações em pequenos volumes de sangue Neste trabalho investigamos a utilização da técnica de semi-nested PCR para o diagnóstico da candidemia por meio de uma revisão sistemática com metanálise Foram acessadas as bases: Medline, Web of Science, Scopus, LILACS, Scielo, Embase e Cochrane que identificou um total de 196 estudos Destes, 5 foram incluídos na revisão sistemática e analisados quanto ao risco de viés utilizando-se a ferramenta QUADAS-2 Ainda destes estudos incluídos, 3 preencheram os critérios para a metanálise, fazendo-se a comparação direta da semi-nested PCR com a cultura por meio de tabelas 2x2 e extração de resultados verdadeiro positivo (VP), falso positivo (FN), verdadeiro negativo (VN) e falso negativo (FN) em 5 pacientes com candidemia confirmada (controle positivo) e em 38 indivíduos saudáveis (controle negativo) A sensibilidade e especificidade nos estudos foram calculadas com um intervalo de confiança de 95% e foi encontrada especificidade de 1% e sensibilidade variável de 88 a 1% Além disso, os estudos também testaram um total de 77 amostras de pacientes em suspeita de candidemia com hemoculturas negativas, e estes obtiveram uma positividade de 52% Baseando-se nestes resultados podemos sugerir que a semi-nested PCR em amostras clínicas pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico de candidemias na rotina laboratorial Foi também padronizada uma semi-nested PCR em única etapa (OTsn-PCR) utilizando como alvo as sequências das regiões espassadoras internas – Internal Transcriber Spacer (ITS1 e ITS2), caracterizadas por ter regiões altamente conservadas e regiões altamente específicas para cinco espécies de importância clínica para o gênero Candida: Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida krusei e Candida tropicalis A reação apresentou especificidade ao ser testada com outras espécies fúngicas e ótimo limite de detecção, alcançando ,25pg de DNA por amostra Quando comparada com ensaios convencionais de nested ou semi-nested PCR, a OTsn-PCR mostra vantagens pois é mais rápida e apresenta menor risco de contaminação pela menor manipulação dos tubos, tendo um grande potencial para ser utilizada no âmbito do diagnóstico molecular de candidíases e candidemias
Efeitos anti-inflamatório, antioxidante, analgésico e mecanismos de ação dos flavonóides Trans-Chalcona, Hesperidina Metil-Chalcona e Quercetina em modelo de artrite gotosa em camundongos
Miyazawa, Kenji William Ruiz; Verri Junior, Waldiceu Aparecido [Orientador]; Pavanelli, Wander Rogério; Dionisio, Andressa de Freitas Mendes; Kwasniewski, Fábio Henrique; Borghi, Sérgio Marques
Resumo: Artrite gotosa é uma doença inflamatória que acomete articulações e caracteriza-se pela deposição de cristais de ácido úrico (MSU) intra e periarticular Os sinais mais comuns são o edema articular e o aumento da sensibilidade à dor nas articulações (hiperalgesia) Uma nova abordagem terapêutica para o tratamento da doença é a inclusão de compostos químicos naturais presentes em plantas como os flavonoides Trans-chalcona (TC), Hesperidina metil-chalcona (HMC) e Quercetina (QC) são flavonoides, presentes principalmente em vegetais e frutas, que apresentam diversas propriedades biológicas capazes de modular processos inflamatórios por meio de suas atividades antioxidantes e anti-inflamatórias e, além disso, atuam sobre fatores de transcrição, como Nrf2 e NF?B Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos e mecanismos de ação dos flavonoides TC e HMC, além de avaliar se os efeitos apresentados pela QC eram dependentes de receptores opioides no modelo de artrite gotosa induzida por MSU em camundongos O estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal da Universidade Estadual de Londrina (CEUA-UEL- processo nº 1327921176 e nº 14621373) A artrite gotosa foi induzida pela injeção intra-articular (1 µg/1 µL) de MSU e foram avaliados a hiperalgesia mecânica, edema articular, migração leucocitária, histologia articular (H/E), estresse oxidativo, produção de citocinas, ativação do NF?B e expressão de RNAm do inflamassoma NLRP3 (qPCR) e, in vitro, a produção de IL-1ß madura no sobrenadantes de macrófagos derivados da medula (BMDMs) Inicialmente foi realizada uma dose reposta dos flavonoides TC (3, 1 e 3 mg/kg), HMC (3, 1 e 3 mg/kg) por via oral e QC (1, 3 e 1 mg/kg) por via subcutânea para determinar a dose mais eficaz Além disso, foi realizado uma dose resposta da naloxona, um inibidor não seletivo de receptores opioide nas doses de (3, 1 e 3 mg/kg) por via intraperitoneal, juntamente ao modelo de gota e quercetina, para avaliar se os efeitos da quercetina eram dependentes de receptores opioides Desta forma as doses selecionadas foram TC (3 mg/kg), HMC (3 mg/kg), QC (1 mg/kg) e naloxona (3 mg/kg) O tratamento com esses três flavonoides foram capazes de reduzir a hiperalgesia mecânica e o edema induzidos por MSU Além disso, quando avaliada a migração leucocitária, foi possível observar que os flavonoides diminuíram o recrutamento de leucócitos para a cavidade e tecido articular, reduzindo assim a sinovite O tratamento com os flavonoides foram capazes de proteger contra o estresse oxidativo induzido pela injecção ia de MSU A quercetina foi capaz de promover a restauração dos niveis de GSH, aumento do Frap, ABTS e redução de anions superóxidos (NBT), além disso, os tratamentos com TC e HMC também reduziram a produção de óxido nítrico (NO) na articulação Os tratamentos com os flavonoides foram capazes de reduzir a expressão do RNAm de gp91phox ao mesmo tempo que induziram a ativação da via Nrf2/HO-1 conferindo à essas moléculas propriedades antioxidantes A produção de citocinas pro-inflamatórias como IL-1ß e TNFa foram reduzidas pelo tratamento com QC, ademais IL-6 foi reduzida pelo tratamento com TC e HMC Em relação ás citocinas anti-inflamatórias os dados demonstram que os níveis de IL-1 foram reduzidos pelo tratamento HMC e não alterados no tratamento com TC, além disso, os tratamentos com TC e HMC foram capazes de aumentar os níveis de TGF-ß na articulação O estímulo com MSU foi capaz de ativar vias de sinalizações inflamatórias ativados pelo NF?B; os flavonoides, por sua vez, inibiram a ativação, contribuindo com a redução de citocinas pro-inflamatórias Quando avaliada a expressão dos RNAm das moléculas do inflamassoma NLRP3, ASC, Pro-caspase e Pro-IL1ß todos os flavonoides avaliados inibiram sua expressão de maneira significativa Entretanto, no modelo in vivo, os efeitos promovidos pelo tratamento com a quercetina na dose de 1 mg/kg, sc, foram revertidos de maneira siginificativa pelo pre-tratamento com a naloxona na dose de 3 mg/kg, ip em todos os ensaios realizados In vitro, foi avaliado os níveis de IL-1ß madura no sobrenadante de BMDMs co-estimuladas com LPS (sinal 1) e MSU (sinal 2) Esta estimulação levou ao aumento nos níveis de IL-1ß, sendo que o tratamento com quercetina (3 µM) inibiu a produção de IL-1ß madura no sobrenadante de BMDMs, contudo, o seu efeito foi revertido pela naloxona na concentração de (2 µM) Entretanto o tratamento com HMC em nenhuma das concentrações testadas foram capazes de inibir a sua produção de maneira significativa, logo o efeito da HMC não é depentende da inibição da ativação do inflamassoma, mas sim pela inibição da ativação do NF?B Assim, os dados do presente trabalho sugerem que os tratamentos com os flavonoides TC e HMC exibem efeito analgésico, anti-inflamatório e antioxidante que podem estar associados com a inibição do NF?B no modelo in vivo, assim como a quercetina atuou sobre a inibição tanto de NF?B quanto de Inflamassoma NLRP3 no modelo in vivo e in vitro, sendo os seus efeitos dependentes da participação dos receptores opioide no modelo de artrite gotosa induzida por MSU
Efeitos da B-glucana sobre atividade antitumoral in vitro e sobre o estado nutricional, parâmetros laboratoriais e indicadores de estresse oxidativo em mulheres com câncer de mama
Carreira, Clisia Mara; Mantovani, Mário Sérgio [Orientador]; Vicentini, Verônica Elisa Pimenta; Ribeiro, Lúcia Regina; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Dichi, Isaías
Resumo: ß-glucana (ßG) são polissacarídeos constituintes estruturais da parede celular de leveduras, fungos e alguns cereais, que se diferenciam pelo tipo de ligação presente entre as unidades de glicose A ß-glucana é considerada um modificador da resposta biológica em razão de suas propriedades imunomoduladora, anticarcinogênica e antimutagênica capaz de prevenir danos ao DNA Outros estudos mostram os efeitos benéficos da ßG na hipercolesterolemia, hiperglicemia e na hipertensão arterial, ressaltando que não houve efeitos adversos relatados após o consumo de uma dieta rica em ßG No entanto o papel das ß-glucanas no câncer de mama ainda não é bem compreendido Nesse sentido o objetivo da pesquisa foi avaliar os efeitos da ßG sobre a expressão dos genes CCNA1, CASP9 e SOD1 em células MCF-7, por meio do ensaio da RT-PCR em tempo real e também investigar os efeitos da suplementação da ßG de Saccharomyces cerevisiae sobre o perfil nutricional e dietético, parâmetros hematológicos, bioquímicos e os indicadores de estresse oxidativo em mulheres com câncer de mama em tratamento quimioterápico A ßG utilizada na pesquisa não apresentou citotoxicidade Para os testes in vitro foram utilizadas as concentrações de 5µg/mL de ßG e ,1mg/mL para doxorrubicina (DOX) Os resultados demonstraram que células MCF-7 expostas a bG extraída de Scerevisae aumentou a expressão do gene CASP9, induzindo apoptose e a exposição simultânea destas células a bG e a DOX aumentou a expressão de ciclina A1 e de SOD1, indicando que essa associação pode ser responsável pelo aumento das defesas intracelulares antioxidantes e assim contribuir com a inibição da proliferação das células MCF-7 bem como contribuir para o reparo na lesão do DNA provocado pelo quimioterápico Para a investigação do efeito da bG sobre os parâmetros nutricionais, laboratoriais e sobre o estresse oxidativo, foram acompanhadas 52 pacientes com câncer de mama, antes e após a suplementação de um grama de bG ou gelatina, durante 84 dias de tratamento antineoplásico A média de idade foi de 52,4 ± 8,97 anos, a maioria não ingeriam álcool, não eram tabagistas e não praticavam atividade física regular A avaliação nutricional realizada identificou prevalência de sobrepeso e obesidade, com risco elevado de complicações metabólicas e doença cardiovascular, entretanto não houve diferença significante antes e após a suplementação e entre os grupos Houve aumento significante nos níveis hematológicos após a suplementação com bG: hemoglobina (p=,31), hematócrito (p=,21), basófilos (p<,1) e eosinófilos (p=,5) e redução significativa nos níveis plasmáticos de LDL - colesterol (p=,21) e dos triacilgliceróis (p=,5), entretanto, no grupo controle (gelatina) houve redução significativa nos níveis de hemoglobina (p=,13), leucócitos (p=,1), linfócitos (p<,1) e eosinófilos (p=,46) A análise dos marcadores de estresse oxidativo indicou redução significante nas concentrações plasmáticas de NO (p<,1) após a suplementação com bG Em relação ao consumo alimentar, observou-se redução significativa na ingestão de gordura saturada e um aumento significativo na ingestão de gordura monoinsaturada, nos dois grupos Os demais nutrientes avaliados não tiveram alterações com nível de significância estatística Entretanto na avaliação da prevalência de inadequação do consumo de vitaminas e minerais, chama atenção o fato de que todas as vitaminas antioxidantes e o cálcio apresentaram alta prevalência de inadequação Foi possível observar que a ingestão alimentar das pacientes não estava de acordo com as recomendações dietéticas internacionais para a maioria dos nutrientes, indicando alta prevalência de inadequações, e a suplementação com ß-glucana não alterou o estado nutricional das pacientes, mas melhorou significativamente os níveis hematológicos, reduziu LDL-col, triacilgliceróis e concentrações plasmáticas de NO Diante do exposto, sugere-se que a ß-glucana de Saccharomyces cerevisiae possa ser um importante nutriente adjuvante para pacientes com câncer em terapia antineoplásica e também se faz necessário maior atenção ao estado de saúde e a ingestão alimentar desta população
Análise da reatividade de IgG/IgG2 a epítopos de carboidratos de espécies de Paracoccidioides e detecção de casos de Paracoccidioidomicose infecção na população de Guarapuava, PR
Vidal, Adriane Lenhard; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson José; Marquez, Audrey de Souza; Tatibana, Berenice Tomoko
Resumo: Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelos fungos termodimórficos Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidiodies lutzii, sendo restrita a América Latina e endêmica no Brasil Acredita-se que a infecção ocorra pela inalação de propágulos fúngicos quando o solo é revolvido A PCM pode ser dividida em: (1) PCM infecção, sem sintomas, mas com reação positiva aos antígenos de Paracoccidioides spp, com prevalência muito variável entre regiões; e (2) PCM doença, classificada em (2a) PCM aguda, condição mais grave que ocorre em crianças e jovens ou (2b) PCM crônica, que ocorre em adultos e soma aproximadamente 9% dos casos A presente pesquisa objetivou: (a) avaliar a reatividade de IgG/IgG2 de pacientes crônicos aos epítopos de carboidrato de Paracoccidioides spp; (b) avaliar epidemiologicamente os casos de PCM infecção em Guarapuava, PR, Brasil A investigação dos epítopos de carboidrato foi feita por immunoblot (IB) de cell free antigens (CFA) de P brasiliensis B339 (anteriormente espécie S1), Paracoccidioides americana LDR3 (anteriormente P brasiliensis PS2) e P lutzii LDR2, tratados ou não com metaperiodato de sódio (SMP) IgG de coelho anti-P brasiliensis Pb18 e IgG/IgG2 de um pool de soros de pacientes com PCM doença reconheceram principalmente antígenos de alta massa molecular (hMM, >15 kDa), gp7 e gp43, sendo esta última não detectada em P lutzii LDR2 A reatividade aos antígenos diminuiu com o tratamento com SMP Conclui-se que não foi possível detectar gp43 em P lutzii LDR2 e, como P brasiliensis, seus principais antígenos apresentam epítopos de carboidrato reconhecidos pelos soros de pacientes com PCM No levantamento epidemiológico sobre PCM infecção, 359 soros foram analisados por ELISA para detecção de IgG contra CFA de P brasiliensis B339, P americana LDR3 e P lutzii LDR2 Gp43 de B339 serviu de teste confirmatório Estes antígenos foram também testados após tratamento com SMP para redução de reações cruzadas Reatividade em ELISA: CFA/SMP-CFA em geral 37,3/17,8%, B339 25,3/14,5%, LDR3 24,5/1,4%, LDR2 8,3/5,8%; gp43/SMP-gp43 7,2/4,7% Houve soros reagentes para mais de uma espécie IB de 37 soros selecionados demonstrou diferentes padrões de reconhecimento de gp43, gp7 e hMM Residência em zona rural e profissões relacionadas ao manejo do solo foram identificados como fatores de risco P brasiliensis parece ser a espécie prevalente na área, mas 21 soros de pessoas que declararam ter vivido apenas na região foram reagentes com antígenos de P lutzii LDR2 IgG anti-gp7 e -hMM foram avaliados em amostras reagentes, mas com baixa reatividade: gp7/hMM em geral 6,4/6,7% O uso de SMP ou antígenos purificados podem não ser adequados para levantamentos sobre PCM infecção na região avaliada, portanto, recomenda-se o uso de CFA-ELISA Apesar de Guarapuava ser uma cidade de economia agrícola e estar localizada em região endêmica de PCM, a baixa prevalência para PCM infecção era esperada, considerando-se que a região teve relatos anteriores de menor endemicidade de PCM doença do que outras áreas do Paraná, mas as características gerais encontradas assemelham-se à outros trabalhos publicados
Polimorfismo genético, expressão gênica e proteica do receptor CXCR4 : implicações na patogênese do câncer de mama e possível correlação com o gene TP53
Kishima, Marina Okuyama; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Reiche, Edna Maria Vissoci; Herrera, Ana Cristina do Amaral; Ariza, Carolina Batista; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi [Coorientadora]
Resumo: Os tumores de mama são caracterizados por um padrão metastático distinto, envolvendo linfonodos, medula óssea, fígado e pulmão A migração das células tumorais metastáticas apresenta muita semelhança com o tráfego de leucócitos Tem sido relatado que estas podem ser guiadas através da circulação até órgãos distantes que expressam quimiocinas, pois tais células possuem receptores específicos, como o CXCR4 (C-X-C motif chemokine receptor 4) Este receptor vem sendo implicado na disseminação de tumores malignos, sendo visto como um marcador promissor em vários tipos de neoplasias, incluindo as da mama O objetivo do presente estudo foi investigar a influência do polimorfismo genético de CXCR4 (C/T rs222814) sobre sua própria expressão gênica e protéica, bem como em relação a parâmetros prognósticos da doença, em 74 amostras de pacientes com câncer de mama geral Tivemos ainda como objetivo avaliar um polimorfismo (rs142522) no gene TP53, procurando estabelecer uma correlação com a expressão gênica de CXCR4, bem como com parâmetros prognósticos em uma amostra de 33 pacientes com câncer de mama, luminal/HER2 (-) DNA e RNA foram extraídos a partir de tecido tumoral e normal obtidos por ressecção cirúrgica utilizando-se kits específicos A genotipagem de CXCR4 foi realizada por reação em cadeia da polimerase seguida de análise de fragmentos de restrição(RFLP-PCR) A expressão gênica foi avaliada por PCR quantitativa em Tempo Real (q-PCR) e a expressão proteica por imunohistoquímica As frequências genotípicas das pacientes demonstraram que 88,24% apresentaram genótipo homozigoto CC e 11,76% apresentaram genótipo heterozigoto CT Nenhuma diferença significativa na distribuição dos genótipos foi observada de acordo com as características clinicopatológicas (grau histológico, grau nuclear, comprometimento de linfonodo, receptor de estrógeno e/ou progesterona, p53, Ki67 e superexpressão do oncogene HER2) Em geral, as amostras de câncer de mama apresentaram maior expressão de CXCR4 (5,7 vezes) em relação ao RNAm de mama normal, mas não foram observadas diferenças significativas em relação à variante alélica polimórfica, quanto à expressão proteica e também em relação aos parâmetros acima citados No ensaio imunohistoquímico, foi observada uma marcação citoplasmática mais intensa de CXCR4 nas amostras tumorais em relação ao tecido normal de mama (p<,1), mas esta não foi associada ao comprometimento linfonodal, expressão gênica ou ao polimorfismo rs222814 O estudo caso controle indicou uma associação positiva para o genótipo heterozigoto e para o portador do alelo C (modelo dominante) do gene TP53 em relação à suscetibilidade em amostras luminal/HER2(-) Foi verificada uma correlação significativa para a variante genética (alelo C) de TP53 em relação ao tamanho tumoral e ao índice de proliferação celular, e a expressão de CXCR4 apresentou correlação significativa com presença de metástase, nesta mesma amostra Adicionalmente, nenhum dos genótipos de TP53 influenciou a expressão gênica de CXCR4 De um modo geral, o presente estudo mostrou um aumento da expressão de CXCR4 nos tecidos tumorais de mama, tanto em nível gênico quanto proteico, o qual não foi influenciado pelo polimorfismo avaliado no mesmo gene Tais resultados sugerem que este receptor pode ser um marcador promissor no contexto geral da carcinogênese mamária, em especial no que se refere ao processo de metástase, mas deve ser investigado se esse padrão se repete nos outros subtipos tumorais da mama
Papel do estresse oxidativo na atrofia e proteólise do músculo esquelético no enfisema pulmonar induzido pela papaína
Sczepanski, Cláudia Roberta Brunnquell; Cecchini, Rubens [Orientador]; Dichi, Isaías; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Comar, Jurandir Fernando; Pacagnelli, Francis Lopes
Resumo: O objetivo deste estudo foi estabelecer um modelo experimental adequado de enfisema pulmonar associado às modificações musculoesqueléticas em estágios precoces da doença, assim como comparar as consequências musculares do enfisema pulmonar induzido por papaína e elastase Foram utilizados hamsters Syrian Golden machos (1-14g) distribuídos em diferentes grupos de acordo com o tempo experimental (tempo de sacrifício após a instilação de elastase aos 1, 2, 4 ou 7 dias, E1, E2, E4 ou E7/EE, respectivamente) e papaína (7 dias, EP); e enzima administrada (4mg/ml de papaína em salina ou 5,2 UI de elastase pancreática suína em salina) com seus respectivos controles (C1, C2, C4, C7/CS) sendo instilados ,3 ml da solução por animal Após o tempo experimental, os animais foram pesados para avaliação do índice de caquexia (IC) e sacrificados O lobo médio do pulmão direito foi coletado para análise histológica e quantificação do enfisema pulmonar O gastrocnêmio foi retirado para análise morfométrica da fibra muscular, massa muscular, relação da massa muscular com a massa corporal total (MM/MT), lipoperoxidação por quimiluminescência (QL), proteínas carboniladas (PC), glutationa total (GST) e oxidada (GSSG), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividade proteolítica quimiotripsina-like e calpaína-like Ao compararmos os grupos 7 dias (CS, EE e EP) foi verificado diminuição dos interceptos alveolares no EE e EP em relação ao CS (CS: 764 ± 58; EE: 4817 ± 116; EP: 5156 ± 49; p<,5) Quando comparado ao CS, houve uma redução da massa muscular no grupo EP (18,34%) e aumento no grupo de EE (8,37%), bem como da relação MM/MT Além disso, a reação de QL, PC e atividade quimotripsina-like foram elevadas no grupo EP, assim como a GST diminui no EE O grupo EE mostrou crescente número de fibras com aumento das áreas transversais e da atividade calpaína-like Na comparação com seus respectivos controles, os grupos com enfisema pulmonar (E1, E2, E4 E E7) apresentaram diminuição significativa do número de interceptos alveolares O IC foi de 9,7 ± 1,64% e 1,81 ± 1,55% nos grupos E1 e E2 A frequência de distribuição das áreas transversais das fibras se mostrou diferente entre os grupos 2, 4 e 7 dias Além disso, TBARS, relação entre a GST e GSSG, reação de QL e PC não mostraram diferenças significativas A atividade calpaína-like foi significativamente reduzida no grupo E4 Estes dados nos permitem concluir que a elastase e a papaína, quando utilizadas para induzir modelos experimentais de enfisema, levam há diferentes tempos e velocidades de adaptação muscular, fornecendo informações sobre a escolha de um modelo experimental adequado Em adição, o modelo por elastase leva a adaptação muscular precoce, com ausência de atrofia e sem envolvimento direto do estresse oxidativo neste processo
Tratamento com baixas doses de aspirina nas fases aguda e crônica da infecção murina por trypanosoma cruzi promove neuroproteção entérica
Oda, Juliano Yasuo; Araújo, Eduardo José de Almeida [Orientador]; Sant´Ana, Débora de Mello Gonçales; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Ceravolo, Graziela Scalianti; Pavanelli, Wander Rogério; Pinge Filho, Phileno [Coorientador]
Resumo: A doença de Chagas (DC) representa um importante problema de saúde pública no Brasil, devido ao surgimento de novos casos e também por ainda não possuir cura A DC acomete o controle nervoso do trato gastrointestinal, resultando em severos distúrbios de motilidade Essas alterações de motilidade devem-se, principalmente, à perda de neurônios do plexo mientérico, o qual é um dos plexos ganglionados do sistema nervoso entérico Neste estudo, objetivou-se avaliar se o uso de baixas doses de aspirina (ASA) durante a fase aguda (2 mg/kg) ou crônica (5 mg/kg) da infecção experimental por T cruzi seria capaz de proteger neurônios mientéricos do cólon de camundongos Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Londrina (UEL) Camundongos Swiss foram distribuídos em grupos que receberam PBS ou foram tratados com baixas doses de aspirina durante a fase aguda (2 mg/Kg, ASAEarly) ou crônica (5 mg/Kg, ASADelayed) da infecção causada pela cepa Y de T cruzi Após 75 dias de infecção, coletou-se o cólon para quantificar focos inflamatórios em cortes histológicos e neurônios mientéricos gerais, nitrérgicos, VIPérgicos e colinérgicos evidenciados por imunofluorescência Além disso, avaliou-se o trânsito gastrointestinal Contou-se o número total de corpos celulares de neurônios gerais, nitrérgicos e VIPérgicos presentes em 24,6 mm2 de cada animal, valor que projetado para 1 cm2 O número de neurônios colinérgicos foi estimado pela diferença entre o número de neurônios gerais e o número de neurônios nitrérgicos Foi também realizada a mensuração da área do corpo celular de 3 neurônios evidenciados em cada marcação de cada animal Foram mensuradas 7 varicosidades nervosas mientéricas VIPérgicas e contendo Substância P O tempo de trânsito intestinal foi avaliado com a administração de um marcador não absorvível, via gavagem (tempo zero), até a eliminação do primeiro pelete de fezes na cor vermelha Os dados foram expressos por média ± desvio padrão, e os grupos foram comparados utilizando ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey, considerando significante p<,5 O tratamento com ASA na fase aguda provocou uma significativa redução no pico de parasitemia (p<,5) Com relação a quantidade de foco inflamatório, ambos tratamentos foram eficientes para reduzi-los Os camundongos infectados do grupo PBS apresentaram intensa perda neuronal mientérica, tanto na população geral (6,67%), como também nas subpopulações nitrérgica (49,%), colinérgica (67%) e VIPérgica (38,%) (p<,5) Essa morte de neurônios foi significativamente reduzida pelo tratamento com ASA tanto na fase aguda (ASAEarly) como na fase crônica (ASADelayed) da infecção (p<,5) A intensa morte de neurônios colinérgicos nos animais do PBS provocou significativo retardo do trânsito do tubo digestório (p<,5) O tratamento com ASA contribuiu para que o tempo de trânsito gastrointestinal dos animais infectados permanecesse semelhantes aos animais saudáveis A infecção por T cruzi, provocou uma hipertrofia no corpo celular dos neurônios remanescentes O tratamento com ASA na fase aguda da infecção contribuiu de forma mais expressiva para manutenção da área do corpo celular dos neurônios mientéricos remanescentes Camundongos infectados com T cruzi não tratados com ASA apresentaram varicosidades nervosas mientéricas VIPérgicas atrofiadas e as contendo substância P estavam hipertrofiadas Além disso, as fibras nervosas apresentaram maior intensidade de brilho para SP Conclui-se que a administração de ASA apresentou efeito neuroprotetor para os neurônios do plexo mientérico do cólon de camundongos infectados por T cruzi
Polimorfismos genéticos e expressão gênica de FOXP3 e TGFB1 : possíveis marcadores moleculares no câncer de mama
Oda, Julie Massayo Maeda; Watanabe, Maria Angelica Ehara [Orientador]; Poli-Frederico, Regina Célia; Reiche, Edna Maria Vissoci; Amarante, Marla Karine; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi [Coorientadora]
Resumo: O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer entre mulheres de todo o mundo e sabe-se que o microambiente tumoral contém células do sistema imunológico, células malignas e do estroma circundante O fator de crescimento de transformação beta (TGFB) é uma citocina que estimula o desenvolvimento de células T regulatórias (Tregs), que são linfócitos T CD4+, e é produzido tanto por estas células quanto por células tumorais O FOXP3 codifica uma importante molécula para a função das Tregs, tanto para manutenção da tolerância quanto na regulação da resposta imunológica Polimorfismos nesses genes (FOXP3 e TGFB) podem levar ao desequilíbrio do sistema imune e mediar o desenvolvimento de doenças graves em humanos Portanto, o presente estudo teve por objetivo analisar as variantes alélicas A/G rs2232365 e C/A rs3761548 do FOXP3 e T/C rs1847 do TGFB1 entre pacientes e controles, bem como suas expressões gênicas no tecido tumoral em comparação com tecido mamário normal O estudo de associação caso-controle indicou uma associação positiva para o gene TGFB1 em relação ao homozigoto CC [OR= 1,88 IC 95% (1,19-2,96)] (p=,64) e para os portadores do alelo C [OR= 4,41 IC 95% (1,81-1,76)] (p=,5) Nenhuma associação significativa foi encontrada para os genótipos homozigotos dos polimorfismos de FOXP3, sendo: GG [OR= 1,7 IC 95% (,64-1,79)] (p=,81) e AA [OR= ,56 IC 95% (,18-1,78)] (p=,3195) Entretanto, quando as variantes alélicas (G + A) deste mesmo gene foram analisadas de forma combinada, foi observada uma associação positiva [OR= 618 95% CI (167-2293)] (p=,21) em relação à suscetibilidade ao câncer de mama Em relação às características clínicopatológicas (receptor hormonal, tamanho do tumor, metástase em linfonodos, HER-2 e estadiamento clínico) das pacientes, não foram observadas diferenças significativas em relação a nenhum dos polimorfismos propostos Entretanto, foi observada uma expressão relativa de 15,6 vezes maior do RNAm de FOXP3 no tecido tumoral em comparação com um pool comercial de RNA de glândula mamária normal Quando foram comparadas as expressões relativas de FOXP3 com as variantes alélicas polimórficas, assim como com os parâmetros clínicopatológicos, também não foram observadas diferenças significativas Uma vez que a superexpressão de TGFB no microambiente tumoral pode induzir metástases e que FOXP3 está envolvido no prognóstico e sobrevida de pacientes com câncer de mama, o nosso estudo sugere que os polimorfismos desses dois genes analisados bem como a expressão de FOXP3 podem ser considerados marcadores de suscetibilidade na patogênese do câncer de mama
Influência do estresse crônico na imunidade humoral de ratos Wistar exercitados
Fernandes, Eduardo Vignoto; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Itano, Eiko Nakagawa; Netto, Eduardo Ferreira de Carvalho; Kwasniewski, Fábio Henrique; Ramos, Solange de Paula; Estanislau, Célio Roberto [Coorientador]
Resumo: O exercício físico (EF) prescrito de forma adequada promove benefícios à saúde como controle do peso corporal, proteção contra o surgimento de doenças cardíacas e melhoria do sistema cardiorrespiratório, prevenção contra o diabetes, hipertensão e hipercolesterolemia e contribui na regulação imunológica Por outro lado, o estresse crônico, além de induzir doenças comportamentais, é um fator de risco para doenças inflamatórias, hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes, aterosclerose e câncer Além disso, as respostas do organismo a um mesmo estressor são dependentes do sexo Dessa forma, objetivo do presente estudo foi investigar a influência do chronic variable stress (CVS) na imunidade humoral de ratos Wistar exercitados Ratos Wistar fêmeas e machos foram divididos em quatro grupos: Controle (C); Exercício (E); Estresse (S); Exercício e Estresse (ES) Os grupos E e ES foram exercitados por seis semanas, na primeira semana foi realizada a adaptação ao procedimento de nado (iniciado com 2 minutos e acrescentado 5 minutos/dia até o tempo de 4 minutos) A intensidade do nado foi controlada por meio de cargas atadas na região torácica dos ratos O ajuste de carga foi realizado semanalmente, respeitando a variação do peso corporal de cada animal Na segunda semana foi iniciada a utilização de sobrecarga (2 % do peso corporal na segunda semana, 3 % na terceira e 4 % na quarta, quinta e sexta semana de estudo) Na quarta semana de estudo, concomitante ao EF, os grupos S e ES iniciaram o CVS, procedimento que ocorreu diariamente por 19 dias Os estressores utilizados no CVS foram: 1 h em geladeira a 4 ºC; cepilho molhado, 12 h; isolamento social, 12 h; caixa inclinada em 45º, 12 h; caixa superlotada (caixa individual com 3 ratos), 12 h; luz acesa do biotério, 24 h Para a avaliação da produção de anticorpos (IgM, IgG2a e IgG1), todos os grupos foram imunizados com IgY de galinha no 24º e 38º dias de estudo Além disso, foram realizadas análises de hemograma completo; testes para avaliar os níveis séricos de creatina quinase, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, colesterol, triglicerídeos, creatinina, uréia, proteína total, glicose e lactato; avaliação comportamental (teste de preferência por sacarose e campo aberto); avaliação do peso corporal e de órgãos Nos resultados, observamos que o EF e o CVS potencializaram a produção de anticorpos IgG1 apenas nos ratos machos, quando realizados de forma isolada Por outro lado, esse efeito não foi observado em ratos submetidos concomitantemente ao EF e ao CVS O CVS provocou aumento das adrenais e redução na preferência por sacarose em machos Nas variáveis relacionadas ao treinamento, o EF impediu o rápido aumento do lactato, controlou o peso corporal, reduziu a gordura peritoneal e hipertrofiou o coração em ambos os sexos Concluímos que ratos machos Wistar são mais suscetíveis ao CVS que as fêmeas e que o EF promove melhorias morfofisiológicas independente do sexo Em relação à imunidade, ambos, EF e CVS favoreceram a resposta imune humoral nos ratos machos

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