01 - Doutorado - Microbiologia
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Item Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas(2021-03-31) Souza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Pavanelli, Wander Rogério; Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson JoséO ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.Item Efeito das nanopartículas de prata biogënicas sobre os fatores de virulência e sistema quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa(2021-06-07) Saeki, Erika Kushikawa; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Garcia, Doroti de Oliveira; Eller, Lizziane Kretli WinkelströterO estudo dos compostos com atividade antivirulência para o controle da patogenicidade bacteriana estão em destaque na literatura atual. Dentre estes compostos, as nanopartículas de prata são cada vez mais pesquisadas para o controle da disseminação das infecções por P. aeruginosa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das nanopartículas de prata biogênicas (bio-AgNP) nos fatores de virulência e Sistema Quorum Sensing (QS) em Pseudomonas aeruginosa. As bio AgNPs foram sintetizadas pelo método de redução da prata iônica pelo fungo Fusarium oxysporum e os ensaios foram realizados com isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa e com as cepas de referência PAO1 e PA14. A identificação dos isolados foi realizada por métodos bioquímicos e moleculares e foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM). Os ensaios para avaliar a produção de fatores de virulência (motilidade, ramnolipídeos, protease alcalina, elastase e piocianina) e capacidade de formação de biofilmes foram realizados. O ensaio de RT-qPCR foi realizado para determinar o efeito da bio-AgNP nos genes reguladores de QS (lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsA e mvfR). As CIM variaram de 15,62-62,50 µM, e a CBM foi de 125 µM para PAO1 e PA14. Os resultados mostraram que as concentrações subinibitórias (1/2 CIM) de bio-AgNP (7,81 a 31,25 µM) aumentaram significativamente (p < 0,050) as motilidades swarming, swimming e twitching, em 40,0%, 40,0% e 46,7% nos isolados clínicos e ambientais, respectivamente. Observou-se que a bio-AgNP aumentou significativamente (p < 0,050) a capacidade de formação de biofilmes em um isolado de paciente com fibrose cística. O tratamento com as concentrações subinibitórias de bio-AgNPs em PAO1 não afetou a produção de protease e biofilme. Entretanto, houve redução significativa (p < 0,05) na motilidade e na produção de ramnolipídeos e elastase. Na cepa PA14 houve estímulo na motilidade swarming e twitching, além da produção de elastase, piocianina e formação de biofilme. Os tratamentos com bio-AgNPs também aumentaram a expressão (p < 0,05) dos genes controladores do sistema QS em P. aeruginosa PAO1 e PA14. Conclui-se que o tratamento com concentrações subinibitórias de bio-AgNPs favoreceu o aumento fenotípico na maioria dos fatores de virulência testados. As cepas PAO1 e PA14 apresentaram diferentes respostas ao tratamento com as bio-AgNPs. A exposição bacteriana as baixas concentrações de bio-AgNPs pode promover o aumento na expressão dos genes reguladores do Sistema QS em P. aeruginosa. Por isso, a aplicação das bio-AgNP na terapia antibiofilme e antivirulência precisa ser avaliada com cautela, para que os compostos sejam utilizados na concentração adequada, o sistema QS seja definitivamente interrompido e os fatores de virulência sejam controlados.Item Resistência a nanopartícula de prata : análise fenotípica e genotípica em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae(2020-09-28) Figueiredo, Érica Pelegrin; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nishio, Erick Kenji; Cyoia, Paula Signolfi; Gazal, Luís Eduardo de SouzaAs infecções causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos, uma preocupação mundial, são responsáveis por aumentar o tempo de internação dos pacientes afetados, elevando o custo dos tratamentos e aumentando a taxa de morbimortalidade. Os metais têm sido usados desde a antiguidade como agentes antibacterianos e apresentam diferentes propriedades e espectros de ação. Dentre os metais, a prata é um dos mais utilizados devido à sua eficiência como antimicrobiano e sua baixa toxicidade. Com o advento da nanotecnologia na área médica, as nanopartículas de prata (AgNP) passaram a ser amplamente estudadas por sua ação antimicrobiana, inclusive contra bactérias multirresistentes. Em nosso estudo, avaliamos a alteração fenotípica e genotípica em cepas de bactérias Gram-negativas contra a exposição prolongada a subdoses de nanopartículas de prata sintetizadas biologicamente (AgNPbio). AgNPbio foi sintetizada biologicamente por utilizando extrato de Fusarium oxysporum. Após exposição prolongada, foi possível observar alteração na Concentração Inibitória Mínima (CIM) em 7 cepas bacterianas. Após o ensaio de indução, 3 cepas bacterianas apresentaram alteração na sensibilidade colateral e resistência cruzada frente a antimicrobianos convencionais. Nossos resultados mostraram uma atenção necessária na exposição prolongada de AgNPbio contra cepas bacterianas.Item Switching fenotípico em Candida tropicalis : alterações na resposta celular e fagocitose frente a estresses oxidativo e osmótico(2021-12-20) Perini, Hugo Felix; Furlaneto, Márcia Cristina; Furlaneto-Maia, Luciana; França, Emanuele Júlio Galvão de; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Grasi, Melyssa Fernanda NegriSwitching fenotípico em Candida tropicalis promove alterações na manifestação de virulência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Uma vez que o evento pode estar relacionado com alterações na resposta adaptativa, o objetivo do presente trabalho foi availiar o papel do Switching fenotípico na resposta ao estresse osmótico e oxidativo. Para tal, dois sistemas de Switching fenotípico de C. tropicalis (49.07 e 100.10) compostos de cinco morfotipos cada (Parental, Crepe, Rugoso, Revertente de Rugoso e Revertente de Crepe) foram expostos à 1 M de NaCl e 5 mM de H2O2 por 10 e 60 min. Análises de resitência ao estresse foram realizadas por contagem de UFC após exposição e o dano em membrana com ensaio de iodeto de propídio. Análises de expressão dos genes HOG1, EFG1 e WOR1 foram realizadas por qPCR e a quantidade de componentes de parede por ensaio fluorimétrico. Análizou-se também, o efeito do Switching sobre a fagocitose e perfil de filamentação no contato com hemócitos e macrófagos e o efeito da pré-exposição ao H2O2 nessas variáveis. Respostas de alterações na parede celular, expressão dos genes testados e resistência ao estresse foram sistemas-dependente, não apresentando relação direta com o padrão morfológico do morfotipo. Variantes morfológicos (Crepe e Rugoso - 100.10) apresentaram menor e complexidade celular que o Parental, assim como alterações na quantidade de manana e na porosidade da parede. Revertentes morfológicos também apresentam maior quantidade de quitina, β-glucana e porosidade que o Parental. Em resposta ao estresse, 62,5% dos morfotipos derivados de Switching foram mais resistentes ao choque osmótico (10 min) e 25% à osmoadaptação (60 min). Sob estresse oxidativo 37,5% apresentaram maior viabilidade que o parental após 10 min, e 25% sob estresse prolongado (60 min). O morfotipo Crepe destacou-se como morfotipo com maior capacidade de resposta aos estresses testados. Esse morfotipo apresentou menor decréscimo no volume celular sob estresse osmótico e aumento de quitina e manana na parede celular. Sob estresse prolongado HOG1 manteve alta expressão nesse morfotipo (49.07). Sob estresse oxidativo Crepe teve alta expressão de todos os genes testados. Hemócitos e macrófagos apresentaram mesmo perfil de fagocitose. Crepe foi mais fagocitado que Parental, no entanto, houve redução no número de células do morfotipo fagocitadas após pré-exposição ao H2O2. Crepe apresentou alta capacidade de formação de hifas verdadeiras em co-cultivo com os fagócitos. A pré-exposição ao H2O2 promoveu regulação positiva de WOR1 e HOG1 em Crepe (49.07). Células de Crepe pré expostas apresentaram maior quantidade de quitina (100.10) e maior porosidade (ambos os sistemas) que o parental. O presente trabalho pode concluir que switching fenotípico promove alteração do fitness celular e consequentemente resposta alterada aos estresses osmótico e oxidativo em C. tropicalis, refletidas na regulação gênica, alterações da parede celular e na capacidade de morfogênese.Item Caracterização fenotípica e molecular de mecanismos de resistência aos antimicrobianos e de fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosaPaula, Suelen Balero de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Picão, Renata Cristina; Gionco, Bárbara; Venâncio, Emerson José; Pelayo, Jacinta Sanchez; Marroni, Floristher Elaine Carrara [Coorientadora]Resumo: Objetivo: O presente estudo teve como objetivo caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, quinolonas, aminoglicosídeos e colistina mediados por plasmídeos e diversos fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa Artigo científico 1: Uma coleção de duzentos e dez isolados de P aeruginosa não sensíveis à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram incluídos no estudo Os isolados foram recuperados no Laboratório de Microbiologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina (HU) no período de junho de 212 a maio de 214 A identificação bacteriana foi realizada pelo Vitek-2® (bioMéurieux) e por testes bioquímicos convencionais, seguida pela confirmação por PCR O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de disco-difusão para treze antimicrobianos A concentração inibitória mínima (CIM) à ceftazidima, aos carbapenêmicos e às polimixinas foi determinada pelo método de microdiluição em caldo Os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos foram interpretados segundo o documento M1-S27 (CLSI,217) e a classificação da resistência foi determinada segundo os critérios de Magiorakos (212) A produção de carbapenemases foi avaliada pelo Blue Carba Test (BCT) e a produção de metalo-beta-lactamases (MBL) foi determinada pelo Teste de Sinergismo de Disco Triplo (TSDT) A presença de genes codificadores de beta-lactamases, carbapenemases, Qnr, 16S rRNA metiltransferases e integrases foi investigada por PCR convencional ou multiplex seguida por sequenciamento A produção de fatores de virulência produzidos por P aeruginosa foi detectada entre os isolados produtores de carbapenemases utilizando testes fenotípicos Além disso, a capacidade de formação de biofilme foi avaliada em microplacas de poliestireno e os genes codificadores de fatores de virulência foram pesquisados por PCR A clonalidade dos isolados produtores de carbapenemases foi avaliada por ERIC-PCR e o Sequence Type (ST), de cinco isolados escolhidos aleatoriamente produtores de diferentes genes de carbapenemases e de clones distintos, foi determinado por Multilocus Sequence Typing (MLST) Altas taxas de resistência aos carbapenêmicos foram verificadas (8,9% para o imipenem e 78,% para o meropenem) e somente as polimixinas apresentaram 1,% de atividade contra todos os isolados do estudo Cerca de 54,7% dos isolados foram classificados como multirresistentes (MR) e 31,9% como extensivamente resistentes (ER) A produção de carbapenemases e de MBL foi detectada em 33,3% e 31,9% dos isolados pelo BCT e pelo TSDT, respectivamente Uma diversidade de genes codificadores de carbapenemases foi verificada entre 7 isolados: blaSPM-1 (63/3,%), blaKPC-2 (3/1,4%), blaIMP-16 (2/,9%), blaVIM-1 (1/,4%) e blaVIM-7 (1/,4%) Foram detectados genes codificadores de beta-lactamases (blaGES-26, blaOXA-46 e blaCTX-M-15) e de resistência aos aminoglicosídeos (rmtD) O gene blaIMP-16 foi detectado como o único gene cassete de um integron da classe I nos dois isolados produtores de IMP-16 O contexto genético dos genes blaVIM-1 e blaVIM-7 foram semelhantes: o gene codificador da MBL como o primeiro cassete gênico, seguido por uma enzima modificadora de aminoglicosídeos (aadA1) e o gene blaOXA-46 anteriormente ao qac?E/sulI Todos os isolados produtores de carbapenemases formaram biofilme e apresentaram o gene lasI codificador de um dos componentes do quorum sensing Um total de 98,6% e 94,3% foram produtores de hemolisinas e proteases, respectivamente Os genes que codificam a fosfolipase hemolítica (plcH), elastase (lasB), exotoxina A (toxA) e exotoxina S foram detectados em 94,3% dos isolados produtores de carbapenemases Apenas um e quatro isolados apresentaram os genes que codificam neuraminidase (nanI) e a exotoxina U, respectivamente A tipagem molecular dos isolados produtores de carbapenemases evidenciou grande diversidade clonal com a presença de 18 genótipos distintos, dos quais os isolados portadores de blaSPM-1 foram agrupados em 14 genótipos e os isolados portadores de blaKPC-2, blaIMP-16, blaVIM-1 e blaVIM-7 foram agrupados em clones únicos Diferentes STs foram obtidos para os cinco isolados submetidos ao MLST e dentre estes dois foram relacionados à disseminação de determinantes de resistência: o portador de blaSPM-1 pertenceu ao ST277, relacionado à disseminação de SPM-1 no Brasil e o portador de blaKPC-2 ao ST235, um importante clone epidêmico mundial Artigo científico 2: Este estudo relatou a primeira descrição de um isolado de P aeruginosa produtor de VIM-7 no Brasil O isolado foi recuperado em maio de 213 da secreção traqueal (17 UFC/mL) de um paciente internado no HU que apresentou resistência a todos os antimicrobianos, com exceção das polimixinas A produção de carbapenemases foi avaliada pelo BCT e a de MBL pelo TDST O gene blaVIM-7 foi localizado num plasmídeo de 52 Kb como o primeiro gene cassete de um integron da classe I seguido por um gene aadA1 e o blaOXA-46 situado anteriormente ao qac?E/sulI O isolado pertenceu ao ST1284, foi um forte produtor de biofilme e apresentou os genes codificadores de fatores de virulência lasI, lasB, plcH, toxA e exoS Artigo científico 3: O artigo relata a presença de um isolado de P aeruginosa produtor de KPC-2 pertencente ao ST235 em 28, anteriormente à primeira detecção do gene blaKPC no Brasil e de um surto de Enterobactérias produtoras de blaKPC no HU Este isolado foi recuperado da urina de uma paciente internada no setor de queimados do HU, foi classificado como ER e apresentou sensibilidade apenas às polimixinas A produção de carbapenemases foi detectada pelo BCT e o resultado negativo no TSDT caracterizou uma carbapenemase não MBL O gene blaKPC-2 apresentou localização cromossomal, em um contexto genético idêntico a isolados recuperados no HU em 21 O gene blaKPC-2 foi flanqueado à montante pela sequência de inserção ISKpn6, entretanto à jusante não foram detectadas ISKpn7 e ISKpn8 O isolado foi considerado hipervirulento, um forte formador de biofilme, produziu hemolisina e protease e apresentou os genes lasI, lasB, plcH, toxA, exoY e exoU Conclusões: As altas taxas de resistência aos antimicrobianos, a diversidade de genes codificadores de carbapenemases, a produção de importantes fatores de virulência e a detecção de STs relacionados a clones epidêmicos nacional e mundial refletem o problema da resistência aos antimicrobianos em P aeruginosa no HU Desta forma o estudo enfatiza a necessidade de medidas estritas de controle de infecção e de programas efetivos para o uso racional dos antimicrobianos neste hospitalItem Atividade antibacteriana de nanopartículas poliméricas doadoras de óxido nítrico contra Staphylococcus aureus e Escherichia coliCardozo, Viviane Ferreira; Nakazato, Gerson [Orientador]; Nakamura, Celso Vataru; Vespero, Eliana Carolina; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Seabra, Amedea Barozzi [Coorientadora]Resumo: A mastite bovina é uma grave enfermidade veterinária que causa grande perda para a indústria de laticínios em todo o mundo Ela é uma das principais doenças infecciosas, e é de difícil tratamento e controle Além disso, o surgimento de bactérias multirresistentes que causam a mastite tem complicado o seu controle O radical livre óxido nítrico (NO) é um potente agente antimicrobiano Assim, o objetivo deste estudo foi sintetizar partículas poliméricas doadoras de NO, e avaliar a atividade antibacteriana contra cepas de Staphylococcus aureus (MBSA) e Escherichia coli (MBEC) isoladas de mastite bovina Quinze isolados de MBSA e quinze de MBEC foram obtidos de vacas com mastite bovina subclínica e clínica Partículas poliméricas biocompatíveis compostas de alginato/quitosana, ou quitosana/tripolifosfato de sódio (TPP), foram sintetizadas e utilizadas para encapsular o ácido mercaptosuccínico (MSA), que é uma molécula contendo tiol A nitrosação de grupo tiol em partículas contendo MSA formaram as partículas S- nitroso-MSA, que são doadores de NO A cinética de liberação das partículas de S- nitroso-MSA mostrou liberação de NO constante e controlada durante várias horas A atividade antibacteriana das partículas liberadoras de NO foi avaliada pela incubação das nanopartículas com uma cepa de MBSA multirresistente, o qual é responsável por causar mastite bovina Ensaios de atividade anti-biofilme na formação e em biofilmes maduros foram realizados utilizando as cepas de S aureus e as partículas poliméricas de S-nitroso-MSA liberadoras de NO A concentração mínima inibitória das partículas de S-nitroso-MSA-alginato/quitosana contra cepas de MBSA variou de 125 a 25 µg/mL As mesmas nanopartículas apresentaram atividade anti-biofilme nas concentrações de 25 e 5 µg/mL para as cepas de MBSA Os resultados indicam que o uso de partículas poliméricas doadoras de NO é uma interessante alternativa para combater a resistência bacteriana no tratamento e prevenção da mastite bovinaItem Atividade imunomoduladora do óleo de copaíba e ácido caurenóico em macrófagos infectados por Trypanosoma cruzi e o efeito antimicrobiano da combinação entre os produtos naturais com benzonidazolKian, Danielle; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]; Oliveira Junior, Admilton Gonçalves de; Nakazato, Gerson; Costa, Ivete Conchon; Tatakihara, Vera Lúcia HidekoResumo: A doença de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que ainda apresenta limitações quanto ao tratamento, como o aparecimento de efeitos colaterais graves e eficácia variável Na busca por terapias alternativas, a utilização de produtos naturais e estratégias como a combinação de fármacos representam alternativas para introdução de novos medicamentos para essa doença O trabalho teve como objetivo avaliar o óleo de copaíba e o ácido caurenóico quanto a sua atividade tripanocida e imunomoduladora em macrófagos infectados por T cruzi, além de analisar o efeito combinatório destes produtos naturais com o benzonidazol Ambos os compostos foram capazes de eliminar o parasito, promovendo diminuição significativa da taxa de infecção e proliferação das formas amastigotas de maneira dose dependente A eliminação destas formas intracelulares ocorreu por mecanismos independentes da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e das vias relacionadas ao metabolismo do ferro e defesa antioxidante Apesar dos testes mostrarem que o óleo de copaíba e o ácido caurenóico modulam a resposta imune em macrófagos, o efeito tripanocida pode estar ocorrendo devido à ação direta destes compostos sobre o parasito, uma vez que os tratamentos exibiram um perfil anti-inflamatório Quando os compostos foram associados ao benzonidazol observou-se efeito sinérgico contra todas as formas de T cruzi para o óleo de copaíba e para o ácido caurenóico apenas para as formas epimastigotas e amastigotas Em tripomastigotas o efeito da associação foi aditivo As concentrações utilizadas nos testes mostraram efeito antagônico para células LLCMK2, não indicando, portanto, toxicidade Além disso, os tratamentos com os compostos sozinhos ou em combinação com benzonidazol levaram a diversas alterações funcionais e estruturais nas formas epimastigotas, como aumento na produção de espécies reativas, formação de estruturas membranosas e vacuolização no interior das células, peroxidação lipídica entre outras características indicativas de processo autofágico Portanto, nossos resultados mostram que óleo de copaíba e o ácido caurenóico são capazes de eliminar T cruzi, modular a resposta imune e diminuir a concentração de benzonidazol necessária para causar a morte do parasito, o que poderia diminuir a toxicidade deste medicamento, sendo então, uma alternativa promissora no tratamento da doença de ChagasItem Estratégias para o controle de infecções causadas por Streptococcus agalactiaeOtaguiri, Eliane Saori; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Gionco, Bárbara; Tavares, Eliandro Reis; Kerbauy, Gilselena; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: Streptococcus agalactiae ou estreptococos do grupo B (EGB) de Lancefield continua sendo uma das principais causas de infecções invasivas e potencialmente fatais em recém-nascidos em todo o mundo, apesar da antibioticoterapia profilática intraparto (API) O objetivo principal deste estudo foi analisar estratégias alternativas para o controle de infecções neonatais por EGB Inicialmente, um ensaio de multiplex PCR em tempo real baseado em curva de melting foi padronizado para detecção simultânea de EGB e marcadores de resistência a macrolídeos e lincosamidas diretamente de swab vaginal-retal Oligonucleotídeos iniciadores específicos e complementares aos genes cfb (codifica para fator CAMP), erm(A) e erm(B) (codificam para metilases) e mef(A) (codifica para bomba de efluxo) foram desenhados a partir de sequências nucleotídicas de EGB depositadas em bancos de dados públicos O ensaio de multiplex PCR apresentou 1% de especificidade e um limite de detecção de 14 unidades formadoras de colônias equivalentes por reação A prevalência de colonização de EGB entre a população estudada foi de 157% (16/12) com base nos resultados de cultura positiva e do multiplex PCR em tempo real Entre os isolados de EGB, somente dois apresentaram resistência aos antimicrobianos, tanto pelo método fenotípico quanto molecular Também foi avaliado pela primeira vez o efeito do oleoresina obtido de Copaifera multijuga Hayne (óleo de copaíba) isoladamente ou em combinação com nanopartículas de prata produzidas metabólitos de Fusarium oxysporum (AgNPbio) contra célula planctônica e séssil de isolados de EGB O óleo de copaíba apresentou atividade bactericida dose-dependente em células planctônicas de EGB, incluindo aqueles resistentes à eritromicina ou clindamicina Análises de microscopia eletrônica de transmissão e varredura de células planctônicas tratadas com o óleo de copaíba apresentaram ruptura de parede celular com extravazamento de conteúdo citoplasmático Este composto também apresentou atividade antibacteriana sobre biofilmes de EGB, inibindo sua formação, bem como a viabilidade de biofilmes maduros Além disso, a combinação do óleo de copaíba com AgNPbio resultou em efeito sinérgico em células planctônicas e na formação de biofilme, reduzindo significativamente os valores de concentração inibitória mínima de ambos os compostos Os resultados obtidos neste estudo mostram que a multiplex PCR em tempo real é um ensaio rápido, acessível e sensível, adequado para detecção direta de EGB e marcadores de resistência à eritromicina ou clindamicina diretamente em swabs vaginal-retal Adicionalmente, revelam o potencial do óleo de copaíba, sozinho ou em combinação com AgNPbio, para o desenvolvimento de novas formulações farmacêuticas para o controle de colonização e infecções por EGBItem Desenvolvimento e avaliação da ação de formulações contendo polissacarídeo deAdenanthera pavonina e mangiferina contra herpesvírus, in vivoRechenchoski, Daniele Zendrini; Linhares, Rosa Elisa Carvalho [Orientador]; Nozawa, Carlos; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Vespero, Eliana Carolina; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Galhardi, Ligia Carla Faccin [Coorientadora]Resumo: A alta prevalência de infecções pelo vírus herpes simplex (HSV) e a emergência de cepas resistentes ao aciclovir têm estimulado a pesquisa e o desenvolvimento de novos agentes antivirais Neste contexto, os produtos naturais representam uma excelente fonte de descoberta de compostos bioativos com grande diversidade estrutural e química, capazes de apresentar múltiplos mecanismos de ação e, em geral, com baixa toxicidade A mangiferina é uma xantona glicosilada encontrada em muitas espécies de plantas, entre elas a mangueira (Mangifera indica) Adenanthera pavonina é uma árvore nativa da África e da Ásia, introduzida no Brasil para reflorestamento e indústria madeireira Ambas são tradicionalmente utilizadas para o tratamento de muitas doenças e possuem diversas atividades farmacológicas descritas cientificamente, inclusive atividade antiviral O objetivo deste estudo foi investigar a atividade anti-HSV-1 da mangiferina e do polissacarídeo sulfatado de A pavonina (SPAp), bem como, desenvolver formulações tópicas contendo estes compostos Duas cepas virais foram utilizadas, uma resistente (AR-29) e outra sensível (KOS) ao aciclovir A citotoxicidade dos compostos foi avaliada pelo método colorimétrico de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-difeniltetrazólio, em células Vero A atividade antiviral, in vitro, foi previamente realizada por ensaio de redução de plaque, utilizando diferentes protocolos de tratamento, tais como, tempo h, virucida e inibição da adsorção para mangiferina e simultâneo para SPAp A inibição da síntese da proteína ICP4 pela mangiferina também foi avaliada pelo ensaio de imunofluorescência As formulações tópicas foram desenvolvidas, contendo ,7% (p/p) de mangiferina e ,5% (p/p) de SPAp A atividade antiviral, in vivo, foi realizada em camundongos Balb/c infectados por escarificação da pele e tratados com estas formulações, quatro horas após a infecção, em intervalos de aproximadamente três horas, exceto a noite, durante oito a dez dias A análise histológica da pele dos animais também foi realizada As concentrações citotóxicas de 5% (CC5) foram acima de 5 µg/mL para mangiferina e de 47,81 µg/mL para SPAp As concentrações inibitórias 5% (CI5) para mangiferina foram de 2,9 µg/mL (Índice de seletividade - IS > 172,4) e 3,5 µg/mL (IS > 142,8), para as cepas AR-29 e KOS, respectivamente A mangiferina inibiu principalmente a cepa AR-29, por contato direto com o vírus, mas também foi capaz de interferir nos processos de adsorção e síntese de proteínas As CI5 encontradas para SPAp foram de ,54 µg/mL (IS = 88,5) e ,49 µg/mL (IS = 97,5), para as cepas AR-29 e KOS, respectivamente No ensaio antiviral, in vivo, os animais tratados com as formulações contendo mangiferina e SPAp apresentaram um atraso no desenvolvimento e na progressão das lesões de pele em comparação ao grupo controle Portanto, estas formulações exibiram atividade anti-herpética promissora, com ênfase na potencialidade da mangiferina no controle da infecção pela cepa AR-29, resistente ao aciclovirItem Caracterização polifásica de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) no Mato Grosso do SulCosta, Maira Rejane; Hungria, Mariangela [Orientador]; Andrade, Diva de Souza; Ribeiro, Renan Augusto; Delamuta, Jakeline Renata Marçon; Fagotti, Dáfila dos Santos Lima; Mercante, Fábio Martins [Coorientador]Resumo: O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) é uma leguminosa importante do ponto de vista social e econômico No entanto, um dos fatores que limita a produção reside no cultivo em solos deficientes em nitrogênio Neste contexto, uma estratégia importante consiste no suprimento de nitrogênio via fixação biológica de nitrogênio (FBN), pela simbiose da planta com variedade de rizóbios Nos solos brasileiros existe grande diversidade de rizóbios capazes de nodular o feijoeiro, mas que apresentam, com frequência, baixa capacidade de fixar nitrogênio Nesse contexto, estudos de taxonomia e filogenia de bactérias fixadoras de nitrogênio são de fundamental importância, não só para entender os processos evolutivos e obter avanços no conhecimento sobre ecologia de rizóbios, como também para a produção de inoculantes microbianos Através das análises de perfil de DNA por BOX-PCR, sequências de 16S rRNA e análise de genes conservados (housekeeping) por MLSA (Multilocus Sequencing Analysis), além das características fenotípicas, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de 73 bactérias capazes de nodular o feijoeiro, isoladas de 45 locais em 22 municípios do Mato Grosso do Sul, Brasil As relações evolutivas estabelecidas, tanto com base no sequenciamento do gene 16S, como na análise individual e concatenada de três genes conservados (glnII, gyrB and recA) indicaram elevada diversidade de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro Os resultados obtidos também revelaram isolados que podem representar novas espécies de rizóbios simbiontes de feijoeiroItem Aderência in vitro de isolados bucais de Candida albicans em diferentes materiais dentáriosCamacho, Daiane Pereira; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Silva, Cléverson de Oliveira e; Panagio, Luciano Aparecido; Almeida, Ricardo Sérgio Couto deResumo: Atualmente, diferentes técnicas e materiais têm sido empregados para reabilitação bucal por meio de próteses dentárias ou implantes A aderência inicial e a colonização por micro-organismos às superfícies rígidas como implante é um pré-requisito para a formação do biofilme que pode ocasionar infecções bucais O papel da levedura Candida albicans na patogênese de lesão peri-implantar está associado a sua característica de micro-organismo oportunista Sua transição de comensal para agente infeccioso depende tanto de fatores de virulência da levedura como da susceptibilidade do hospedeiro Entretanto, os processos biológicos que podem levar à falha dos implantes após a confecção das próteses ainda são pouco compreendidos Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo avaliar a aderência in vitro de isolados bucais de Candida albicans em diferentes materiais dentários, diferenciação celular ao nível ultraestrutural, determinar a produção de biofilme e o padrão de expressão de genes ALS Foram utilizados seis isolados clínicos e uma cepa padrão Candida albicans para a avaliação do perfil de aderência e a diferenciação celular dos isolados sobre a superfície de diferentes materiais dentários, produção de biofilme, bem como o padrão de expressão de genes da família ALS Os isolados avaliados apresentam eficiência quanto à formação de biofilme Todos os isolados apresentaram elevado potencial de aderência aos materiais confeccionados em resina composta microhíbridra com nanopartículas e liga metálica de Níquel-Cromo, enquanto que os menores valores de aderência foram observados nos materiais em porcelana feldspática e resinas acrílicas Observou-se uma diversidade no padrão de aderência e diferenciação celular, entre os isolados, de forma isolado-dependente Os isolados foram classificados conforme o perfil de adesão às superfícies dos materiais, seguindo quatro variações sendo estas: aderência difusa, localizada, agregativa e pseudo-hifal As maiores taxas de aderência dos isolados bucais de Candida albicans foram relacionadas principalmente às superfícies hidrofóbicas Foi observado um padrão complexo de expressão de genes da família ALS por isolados em modelo de aderência in vitro em diferentes materiais dentários Considerando os isolados individualmente, os transcritos mais frequentes em células aderidas aos diferentes materiais avaliados foram dos genes ALS1, ALS2 A indução de determinados genes ALS, no nosso caso ALS1 e ALS4, em função do material no qual o isolado estava aderido foi isolado-dependente; já a repressão de genes ALS7 e ALS9 parece ser dependente do material dentário, uma vez que em determinados tipos de materiais nenhum dos seis isolados analisados produziram transcritos relacionados as adesinas Als7 e Als9 Os resultados obtidos no presente estudo confirmam o potencial de aderência e consequente formação de biofilme por Candida albicans de origem bucal Entretanto a variação no padrão de expressão dos genes ALS nos diferentes materiais testados ocorreu de forma isolado- dependente Desta forma, nossos dados podem contribuir para o entendimento do processo da peri-implantite, corroborando com seu caráter multifatorial, sugerindo que este processo é dependente do material dentário utilizado nos implantes, bem como da capacidade do micro-organismo em desenvolver a infecção, via expressão diferenciada de genes associados a patogêneseItem Caracterização do biofilme formado por Cryptococcus gattii utilizando abordagens fenotípicas e molecularesTavares, Eliandro Reis; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Ishida, Kelly; Lopes, Fabrício Martins; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, pertencentes aos complexos C gattii sensu lato (sl) e C neoformans sensu lato (sl) Esta enfermidade constitui-se em uma das principais causas de morbidade e mortalidade de indivíduos imunocomprometidos, principalmente aqueles portadores de HIV/AIDS Entretanto, esses patógenos também são agentes oportunistas importantes em pacientes com câncer e naqueles que se submetem às terapias imunossupressoras, procedimentos médicos invasivos ou utilizam antibióticos de amplo espectro Além disso, relatos de criptococoses em indivíduos imunocompetentes têm emergido mundialmente Embora não seja um fator de virulência clássico, a capacidade de formar biofilme tem contribuído consideravelmente na virulência de muitas espécies de fungos, sendo relacionado com a persistência de infecções e diminuição da sensibilidade aos agentes antimicrobianos Apesar da importância de C gattii sl na perspectiva clínica, o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na formação de biofilme por este complexo é escasso Diante disso, este trabalho teve como objetivo determinar a capacidade de formação de biofilme por C gattii sl, a caracterização fenotípica e a identificação de possíveis genes envolvidos no seu desenvolvimento A capacidade de formação do biofilme foi avaliada em superfície de poliestireno a 37 ºC por 48 horas em isolados clínicos e ambientais de C gattii sl, e a biomassa foi determinada por coloração com cristal violeta A cinética do desenvolvimento do biofilme foi determinada em superfície de poliestireno e vidro nos tempos de 6, 12, 48, 72 e 96 horas por C gattii ATCC 2465, determinada pela quantificação da biomassa e da atividade metabólica, por cristal violeta e redução do XTT, respectivamente A estrutura do biofilme foi determinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de varredura confocal a laser (MVCL) Para a identificação de genes envolvidos na formação do biofilme, C gattii ATCC 2465 foi incubado a 37 ºC por 48 horas, e utilizado para obtenção do RNA para determinar o perfil transcricional durante o desenvolvimento do biofilme por sequenciamento de RNA (RNA-seq) Nossos resultados mostraram que C gattii sl apresenta a capacidade de formar biofilme em diferentes superfícies; além disso, a cinética da formação apresentou um aumento exponencial da biomassa entre os tempos de incubação de 24 e 96 horas, enquanto que a atividade metabólica teve o seu aumento entre 24 e 72 horas Os resultados de MEV mostraram que entre e 12 horas as células leveduriformes encontraram-se aderidas à superfície, com aumento gradativo de densidade celular; em 24 horas houve o início da formação de matriz exopolissacarídica (EPS); e em 96 horas o biofilme apresentou-se como agregado celular embebidos na EPS Imagens de MCLV, em 72 horas de incubação, mostraram o biofilme como uma monocamada de 8 micrômetros de espessura, composto por células metabolicamente ativas envoltas pela EPS A avaliação do perfil transcricional, após o tratamento estatístico, mostrou um total de 321 genes diferencialmente expressos durante a formação do biofilme Destes, 98 genes apresentaram-se como hiperexpressos, enquanto 223 estavam subexpresso Dos 98 genes, com expressão aumentada, após análise das possíveis funções, 38 corresponderam a proteínas não caracterizadas, 35 corresponderam a proteínas ribossomais e proteínas componentes da estrutura do ribossomo e 25 corresponderam a proteínas caracterizadas Sendo assim, nossos resultados mostraram que, além da capacidade de formar biofilme, o complexo C gattii sl apresenta um aparato de regulação consistente, indicando centenas de genes envolvidos no desenvolvimento desta estruturaItem Análise do potencial de virulência de isolados de Cryptococcus gattii sensu latoYoshizawa, Natália de Souza Botelho; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Morey, Alexandre Tadachi; Izumi, Érika; Ribeiro, Renan AugustoResumo: A criptococose é uma doença fúngica que atinge mais de um milhão de pessoas no mundo todo, sendo os principais agentes causadores Cryptococus neoformans e Cgattii, que estão amplamente distribuídos pelos mais diversos ambientes Esse trabalho teve como objetivo analisar os fatores de virulência (produção de cápsula, melanina, crescimento a 37oC e produção de enzimas), determinar o perfil de sensibilidade à anfotericina B e à nanopartículas de prata biológicas de isolados ambientais e clínicos de Cryptococcus gattii Além disso, também foi realizada infecção experimental em camundongos BALB/c e análises histológicas dos órgãos infectados Todos isolados apresentaram cápsula, apenas dois não apresentaram produção de melanina Todos isolados cresceram a 37oC, porém, nenhum isolado estudado apresentou elevada produção das enzimas analisadas (proteases e fosfolipases) A concentração inibitória de anfotericina B variou de ,25 a 8 µg/mL, sendo um isolado de origem ambiental classificado como resistente a este antifúngico (CIM > 16 µg/mL) As CIMs das nanopartículas de prata variaram de ,39 a 2 µM Para a infecção experimental foi utilizada a via nasal para inoculação das leveduras nos camundongos Os animais infectados apresentaram sintomas como pelo eriçado, dificuldade em abrir os olhos, movimentos repetitivos de coçar e andar em círculos, indicando alterações no sistema nervoso central Durante o período de observação (6 dias) 12,8% dos animais foram a óbito Em conclusão, os diferentes isolados de C gattii, independente da origem, expressam fatores de virulência e são capazes de desenvolver infecção em camundongo imunocompetente Outras análises devem ser conduzidas para esclarecer os mecanismos envolvidos na patogênese de C gattii e dessa forma desenvolver novas estratégias de controle da criptococoseItem Atividade antibiótica de metabólito secundário produzido por Pseudomonas aeruginosa em Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemaseLopes, Gilselena Kerbauy; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Oliveira Junior, Admilton Gonçalves de; Nakamura, Celso Vataru; Vespero, Eliana Carolina; Nakazato, Gerson; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Coorientadora]Resumo: Mais da metade das infecções relacionadas à assistência à saúde são causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos, desafiando a terapia com os fármacos disponíveis A resistência bacteriana aos carbapenêmicos, com destaque para infecções causadas por Klebsiella pneumoniae produtora da arbapenemase KPC, estão associadas à elevadas taxas de mortalidade diretamente relacionadas às limitações impostas por este importante mecanismo de resistência Em contrapartida, o desenvolvimento de novos fármacos não mantém o mesmo rítmo dos múltiplos mecanismos de resistência desenvolvidos pelas bactérias Tendo em vista este cenário, a pesquisa por novas substâncias antimicrobianas é indispensável para o controle das infecções multirresistentes Os produtos naturais desempenham papel importante na descoberta de novos fármacos antimicrobianos Neste sentido, metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa possuem potencial na produção de substâncias antibióticas, tendo em vista sua complexidade genética e diversidade metabólicaItem Produção de inóculo in vitro de Rhizophagus clarus e sua aplicação em sistemas agrícolasCely, Martha Viviana Torres; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Zangaro Filho, Waldemar; Kasuka, Maria Catarina Megumi; Colozzi Filho, Arnaldo; Oliveira Junior, Admilton Gonçalves deResumo: A agricultura é um dos setores mais importantes da economia brasileira e está em constante desenvolvimento A manutenção da produtividade agrícola requer o uso de fertilizantes, prática que pode ter alto impacto no meio ambiente e gerar altos custos de produção Diante este cenário, é importante considerar o uso de alternativas que possam tanto diminuir o custo de produção como garantir um manejo mais adequado do solo através do aproveitamento de processos biológicos naturais Uma destas alternativas é a associação micorrízica O aproveitamento das vantagens da associação micorrízica em grandes áreas de lavoura, onde sua ocorrência natural pode ser diminuída pela própria atividade agrícola, pode ser feita através da inoculação, que ainda é restringida pela baixa disponibilidade de inoculantes comerciais As técnicas de cultivo in vitro de fungos micorrízicos possibilita a obtenção de culturas axênicas com potencial para a produção em grande escala de inoculantes Neste trabalho um isolado do fungo micorrízico arbuscular, Rhizophagus clarus, foi adaptado ao cultivo in vitro com o objetivo da produção de inóculos, os quais foram testados no desenvolvimento de soja (Glycine max L) e algodão (Gossypium hirsutum L) em condições de campo A eficiência da inoculação micorrízica foi comparada com o uso de fertilizantes (NPK) Nestes experimentos foi observado que a inoculação de R clarus tem um efeito positivo no desenvolvimento das culturas e no aumento da produçãoItem Análise polifásica de estirpes de Bradyrhizobium e descrição de novas espéciesDelamuta, Jakeline Renata Marçon; Hungria, Mariangela [Orientador]; Zilli, Jerri Édson; Gomes, Douglas Fabiano; Ribeiro, Renan Augusto; Barcellos, Fernando GomesResumo: O Brasil sobressai no cenário agrícola por ser um grande produtor de diversas culturas de importância econômica, como por exemplo, a soja (Glycine max) Atualmente, tem-se buscado incrementar a produtividade das culturas, mas o manejo inadequado dos solos e das culturas pode limitar a qualidade dos solos e a sustentabilidade agropecuária A fixação biológica de nitrogênio, realizada por bactérias diazotróficas conhecidas de modo geral como rizóbios, em simbiose com plantas leguminosas, destaca-se como uma importante prática na sustentabilidade agrícola, mas estima-se que a diversidade dessas bactérias ainda é pouco conhecida A técnica polifásica, utilizada hoje na taxonomia e sistemática dos procariotos, engloba informações genotípicas, fenotípicas e filogenéticas para garantir uma classificação apropriada dos microrganismos A essas informações deve-se destacar o incremento, na última década, na incorporação de dados de sequências genômicas e os avanços computacionais para analisar tais sequências, proporcionando uma verdadeira revolução nos estudos taxonômicos e filogenéticos de procariotos Neste trabalho, foram conduzidos estudos polifásicos, incluindo a análise genômica, em grupos de estirpes de Bradyrhizobium com forte indicativo de representarem novas espécies O primeiro estudo englobou duas estirpes, CNPSo 1112 e CNPSo 2833, microssimbiontes de soja perene (Neonotonia wightii) e desmodium (Desmodium heterocarpon), inicialmente relacionadas às espécies Bradyrhizobium elkanii e Bradyrhizobium pachyrhizi, respectivamente A análise polifásica dos dados morfofisiológicos, genotípicos e genômicos suportam a proposta de duas novas espécies, para as quais estão sendo propostos os nomes Bradyrhizobium tropiciagri sp nov (CNPSo 1112) e Bradyrhizobium embrapense sp nov (CNPSo 2833) No segundo estudo, diferenças genéticas (rep-PCR, hibridação DNADNA), genômicas (identidade média de nucleotídeos, conteúdo C+G), fenotípicas (testes morfofisiológicos e perfil de ácidos graxos) e filogenéticas (análise do gene 16S RNAr e multilocus sequence analysis - MLSA) revelaram que um grupo representado por quatro estirpes relevantes para a agricultura e simbiontes de soja, classificadas como Bradyrhizobium japonicum grupo Ia deveriam ser reclassificadas na nova espécie Bradyrhizobium diazoefficiens, sendo a estirpe USDA 11 eleita como estirpe tipo Os resultados obtidos contribuem para o maior conhecimento da diversidade de rizóbios, com ênfase no gênero Bradyrhizobium, que aparentemente representa a maior porcentagem de rizóbios nos trópicos Também houve grande aporte de conhecimento sobre a aplicação da genômica em estudos de sistemática procarióticaItem Fixação biológica do nitrogênio, estado nutricional, rendimento e qualidade de grãos de soja sob diferentes densidades de plantasDe Luca, Marcos Javier; Hungria, Mariangela [Orientador]; Kaschuk, Glaciela; Nogueira, Marco Antonio; Mercante, Fábio Martins; Vieira, José Carlos; Nogueira, Marco Antonio [Coorientador]Resumo: A crescente demanda mundial por alimentos tem resultado em pressões para o incremento na produção de grãos, sendo a soja (Glycine max (L) Merr) uma cultura amplamente difundida no mundo por causa da sua plasticidade e potencialidade de rendimento Dentre os fatores críticos para obter altos rendimentos, existe um interesse renovado em arranjos diferenciais na densidade de plantas Hoje, altas densidades de plantas são recomendadas, mas em menores densidades pode haver uma menor competição por água, nutrientes e luz solar, o que pode conduzir à maior sustentabilidade do sistema, particularmente em condições de estresses bióticos e abióticos O objetivo deste trabalho foi o de determinar se a fixação biológica do nitrogênio (FBN) da soja é capaz de fornecer o nitrogênio (N) necessário para a obtenção de altos rendimentos; para isso, foi avaliada a capacidade de FBN da planta sob diferentes densidades A hipótese do estudo é de que a capacidade de FBN é regulada pelo mecanismo de fonte:dreno, com taxas mais elevadas quando existe maior demanda pela planta Foram conduzidos, por quatro anos consecutivos, ensaios a campo em Londrina, Estado do Paraná, com soja sob diferentes densidades, avaliando-se os parâmetros de FBN, nutrição das plantas, rendimento e qualidade dos grãos No primeiro ensaio, foram avaliadas quatro densidades, variando de 4 a 32 plantas ha-1 Em menores densidades verificou-se um estímulo da fotossíntese e da FBN por planta Rendimentos de grãos semelhantes foram obtidos nas diferentes densidades, com redução apenas na densidade mais baixa, de 4 plantas ha-1, que também foi o único tratamento com diferenças nos teores de óleo e proteína nos grãos Nas três safras seguintes, foram realizadas avaliações em densidades variando de 8 a 32 plantas ha–1 e os resultados obtidos no primeiro ano foram confirmados Nesses três ensaios, embora a densidade de plantas tenha sido reduzida em até 75%, o rendimento de grãos foi inferior em apenas uma safra, na menor densidade, e da ordem de 16% Esses resultados indicam alta plasticidade da soja em adaptar a capacidade de fotossíntese e FBN a diferentes densidades Além disso, o plantio em densidades mais baixas traz como vantagens o menor custo de implementação da cultura e menor suscetibilidade a estresses ambientais e nutricionaisItem Switching fenotípico em C. tropicalis : caracterização ultraestrutural de colônias e associação com virulênciaMoralez, Alane Tatiana Pereira; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Negri, Melyssa Fernanda Norman; Furlaneto-Maia, Luciana; Almeida, Ricardo Sérgio Couto deResumo: Candida tropicalis é um patógeno humano associado a altas taxas de mortalidade O switching fenotípico é um importante fator de virulência desta espécie Este estudo foi realizado para avaliar, primeiramente, o efeito do switching fenotípico em C tropicalis quanto a dano celular em células FaDu e virulência em Galleria mellonella Para isso foram utilizados o isolado 497 e seus variantes e revertentes derivados de switching O variante crepe e seu revertente promoveram maior dano celular em células FaDu comparativamente ao do isolado parental Variantes de switching apresentaram virulência distinta em G mellonella Larvas infectadas com o variante crepe tiveram morte mais rápida comparada às larvas infectadas com o isolado parental Além disso, a carga fúngica foi 6,1 superior em larvas infectadas com o variante crepe comparada a de larvas infectadas com o parental O variante rugoso foi o menos virulento comparado ao parental Além disso, foi avaliado o efeito do switching na formação de biofilme, e verificadas a filamentação e a virulência em larvas de G mellonella por células planctônicas e sésseis recuperadas de biofilmes formados por morfotipos distintos O efeito do switching na formação de biofilme foi variável entre os sistemas de switching testados Células sésseis foram mais filamentosas do que células planctônicas para o revertente de crepe (497) Filamentação entre células sésseis do variante rugoso (497) foi maior comparativamente a do seu respectivo parental Virulência foi superior para larvas infectadas com células sésseis comparativamente à células planctônicas obtidas do revertente de crepe (isolado 497) e do isolado parental (isolado 711) Diferentemente, células planctônicas do variante enrugado (711) foram mais virulentas que células sésseis Células sésseis do variante crepe, e revertentes de crepe e enrugado apresentaram virulência superior à do seu respectivo isolado parental Por fim, colônias de padrões morfológicos liso e estruturado foram caracterizadas quanto a ultraestrutura e composição de matriz extracelular (carboidratos e proteínas) O variante rugoso (isolado 497) exibiu níveis superiores de ambos componentes do que seu respectivo parental Colônias de padrão estrutural liso do isolado 11 apresentaram quantidades superiores de carboidratos e proteínas, comparadas a colônias de mesmo fenótipo do isolado 497 Diferenças significativas foram observadas entre os níveis de carboidratos comparando os variantes crepes de ambos isolados Concluindo, foi demonstrado que o switching fenotípico tem efeito na virulência e em fatores de virulência de C tropicalis Este estudo relatou pela primeira vez a ocorrência de switching durante a infecção em G mellonella Pela primeira vez foi comparada a virulência de células sésseis e planctônicas a partir de biofilmes formados por isolados de switching fenotípico e avaliada a composição de matriz extracelular de colônias switchingItem Efeito imunopatológico de co-infeção de camundongos com Paracoccidioides brasiliensis e com Schistosoma mansoniOliveira, Francisco José de Abreu; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Falavigna-Guilherme, Ana Lucia; Menezes, Maria Claudia Noronha Dutra de; Costa, Ivete Conchon; Nakazato, GersonResumo: A Paracoccidioidomicose (PCM), uma das mais importantes micoses da América Latina, é uma doença sistêmica de natureza granulomatosa, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), e a sua principal defesa está ligada ao padrão Th1 da resposta imune A esquistossomose é considerada uma das doenças endêmicas mais importantes e mais difundidas do mundo, constituindo-se de um grande problema de saúde pública No Brasil, a doença é causada por Schistosoma mansoni (Sm), e é caracterizada por resposta imune Th2 As principais lesões patológicas na esquistossomose mansônica são decorrentes de desenvolvimento de granulomas em torno de ovos no fígado devido à resposta imune do hospedeiro Ambas as doenças são crônicas, com sobreposição geográfica em várias regiões no Brasil, possibilitando assim a co-infecção com esses agentes Considerando a inexistência de dados sobre efeito imunopatológico na PCM e na esquistossomose, associada à infecção crônica com P brasiliensis e com S mansoni na fase de oviposição, caracterizada pela resposta Th2, o presente trabalho investigou efeito dessa associação utilizando modelo experimental murino Camundongos Balb/c foram infectados com P brasiliensis durante 7 (Pb7) ou 8 dias (Pb8) e associados com S mansoni infectados durante 42 (Pb7Sm42) e ou 52 dias (Pb8Sm52) ou somente com S mansoni durante 42 (Sm42) ou 52 dias (Sm52) Para a investigação de efeito da co- infecção na PCM, foram realizadas determinação da carga fúngica por CFU no fígado e pulmão, histopatologia de fígado e determinação de níveis de citocinas (IFN-?, TGF-ß, TNF-a, IL-4, IL-1 e IL-17) no fígado e determinação de níveis séricos de anticorpos IgG anti-P brasiliensis (ExoAg) e citocinas séricas (IFN-?, IL-4, TGF-ß e IL-1), por ELISA, tendo como controles grupos Pb7 e Pb8 Para a investigação de efeito de co-infecção na esquistossomose foram determinados números de ovos no fígado e intestino (grosso e delgado) e de ovos fecais, análise histopatológica do figado, determinação das citocinas no fígado e soro e níveis séricos de anticorpos IgG para antigeno solúvel de ovos (SEA), tendo como controles os grupos Sm42 e Sm52 Os resultados obtidos demonstraram aumento nos números de CFUs de P brasiliensis no fígado (Pb7Sm42 e Pb8Sm52) e no pulmão (Pb8Sm52) em relação ao controle mono-infectado, Pb7 ou Pb8, (p<,5) Os níveis de todas as citocinas no fígado foram maiores no grupo Pb7Sm42 que o controle Sm42 (p<,5), exceto IFN-? que resultou em menor nível (p<,5) Na fase mais prolongada de infecção, foi detectada alteração nesse perfil, resultando em menor nível de IL-1 e TNF-a em Pb8Sm52, mantendo o perfil para IL-4 e IL-17 Os níveis séricos de IL-4 e IL-1 demonstraram perfil similar ao de fígado, enquanto que o nível de IFN-?, de forma distinta ao de fígado, foi maior em ambos os grupos co-infectadas (Pb7Sm42 e Pb8Sm52), em relação aos seus controles (p<,5) Foi detectado também aumento no nível sérico de TGF-ß em grupo Pb8Sm52 em relação ao controle (p<,5) O nível sérico de IgG anti-ExoAg foi maior apenas no grupo Pb7Sm42 em relação ao Pb7 (p<,5) Os resultados de co-infecção na esquistossomose demonstraram reduções nos números de ovos no fígado, intestino e fezes (p<,5), diminuição no número e no tamanho de granulomas hepáticos (p<,5) Os níveis de citocinas IL-4, IL-1 e de TNF-a no fígado foram menores em ambos os grupos coinfectados (Pb7Sm42 e Pb8Sm52) e o de TGF-ß somente no grupo Pb7Sm42, em relação aos seus respectivos controles (p<,5) Por outro lado o nível de IFN-? foi maior no grupo co-infectado Pb8Sm52, em relação ao Sm52 (p<,5) Os níveis séricos de IFN-? e IL-1 demonstraram perfil similar ao de fígado em ambos os grupos co-infectados, o mesmo ocorrendo com TGF-ß, no grupo Pb7Sm52, todavia foi observado aumento significativo de TGF-ß em co-infecção mais prolongada (Pb8Sm52), em relação ao controle (p<,5) Em contraste com o de fígado, foi detectado nível sérico elevado de IL-4 no grupo co-infectado (Pb8Sm52) em relação ao controle (p<,5) O nível sérico de IgG anti-SEA foi maior no grupo Pb7Sm42 e menor no Pb8Sm52 em relação a cada controle (p<,5) Em conclusão, a forma cronica de PCM doença se torna mais grave quando associada à infecção com S mansoni principalmente na fase de oviposição de S mansoni e, a co-infecção a induz modulação distinta de níveis de citocinas no fígado e no soro Além disso, a co-infecção na fase inicial de oviposição de S mansoni pode induzir aumento na resposta imune humoral específica aos antígenos de P brasiliensis Se essas modulações de resposta imune estão associadas com a gravidade da PCM doença, requer estudos adicionais Na esquistossomose mansônica, a co-infecção com P brasiliensis induz redução no número de ovos no fígado, com diminuição no tamanho de granulomas hepático bem como decrescimo no número de ovos nas mucosas intestinais ou nas fezes, o que poderia favorecer o hospedeiro Por outro lado, também induz modulação de citocinas local (fígado) ou sistemica e supressão de resposta humoral aos antígenos de ovos de S mansoni o que poderia ser prejudicial ao hospedeiro, o que requer também estudos adicionais Em conjunto, a co-infecção de P brasiliensis e S mansoni induz mutuamente modulações de citocinas e anticorpos que podem afetar ambas as doenças, PCM e esquistossomoseItem Ação antibacteriana de enterocinas produzidas por espécies de Enterococcus sobre células planctônicas e biofilmesRocha, Kátia Real; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Costa, Giselle Aparecida Nobre; França, Emanuele Júlio Galvão de; Rocha, Sérgio Paulo Dejato da; Panagio, Luciano Aparecido; Furla Neto-Maia, Luciana [Coorientadora]Resumo: Enterocococcus spp pertencem ao grupo bactérias ácido láticas produtoras de bacteriocinas (enterocinas) que apresentam atividade contra várias bactérias patogênicas de origem alimentar Este estudo foi realizado primeiramente para selecionar enterococos produtores de enterocinas contra Listeria innocua 12612, bem como seu espectro de ação contra outras bactérias oportunistas e em seguida avaliar a influência de suas enterocinas em biofilme bacteriano Para tal, os isolados potencialmente produtores de enterocinas (Ent+) contra L innocua 12612 foram caracterizados quanto a presença de genes estruturais para enterocinas e produção de componente hemolítico Em seguida foi obtido o sobrenadante de cultivo livre de células (CFS) dos Ent+, para avaliar sua ação contra L innocua 12612 por método de disco-difusão, após tratamento com calor (8°C e 1°C), enzimas proteolíticas (a- quimiotripsina, protease e tripsina), resistência a catalase, quantificação da atividade antibacteriana do CFS e do CFS parcialmente purificado por unidade arbitrária (UA), bem como determinar seu respectivo modo de ação e espectro antibacteriano contra outras bactérias Dos 76 enterococos de diferentes fontes, 11 foram considerados Ent+ (5 isolados provenientes de alimentos e 6 de ambiente), além disso 9 destes apresentavam ao menos um gene codificador de enterocina, entA, entB, entP, ent171 e/ou entX Não houve isolados com atividade hemolítica Após a obtenção dos CFS 7/11 dos isolados Ent+ (5 de alimentos e 2 de ambientes) apresentaram halo de inibição contra L innocua Esses 7 CFS foram termoestáveis, de natureza proteica e a ação antibacteriana por peróxido de hidrogênio foi descartada pela utilização de catalase, indicando a ação antagônica pela presença de enterocina Ao concentrar a enterocina (CFS parcialmente purificado) os valores de UA tenderam a aumentar O modo de ação observado foi bactericida A ativididade antagônica dos 7 CFS contendo enterocina contra outras 33 bactérias indicadoras ocorreu principalmente em L innocua, Listeria monocytogenes e Listeria ivanovii Os CFS que apresentaram maiores valores de UA e espectro de ação foram os provenientes de alimentos, provavelmente isso possa estar relacionada com a maior quantidade de genes codificadores de enterocinas por parte desses isolados Além disso, foram selecionados 4 CFS provenientes de alimentos para avaliar sua atividade anti-biofilme de Listeria spp, no desenvolvimento e após a pré- formação do biofilme por 24h a 3°C e 37°C O biofilme foi formado em superfícies abiótica e avaliado por biomassa total (cristal violeta), atividade metabólica (redução de XTT) e microscopio de fluorescência (com marcador de célula morta utilizando iodeto de propidio) Para tal, 8 Listeria spp foram avaliadas quanto a formação de biofime por biomassa total Dessas foram selecionados 3 Listeria spp (Listeria monocytogenes 232, Listeria ivanovii 256 e Listeria innocua 25) para serem submetidas ao tratamento com os CFS Os resultados mostraram que houve atividade anti-biofilme das Listeria spp, por parte de todos os CFS avaliados (desenvolvimento e no biofilme pré-formado), em ambas temperaturas avaliadas De uma maneira geral, a atividade anti-biofilme listerial provocadas pelos CFS, foi acompanhada por uma menor atividade metabólica, bem como redução da estrutura do biofilme e maior quantidade de células mortas nas imagens obtidas, quando comparado com o controle Concluindo, com base nos esforços consideráveis para a busca por novas bacteriocinas para serem aplicadas na área alimentícia principalmente contra Listeria, um importante patógeno alimentar, tem que os enterococos aqui avaliados apresentam-se como potenciais candidatos no controle de bactérias patogênicas sejam em células planctônicas ou sésseis