01 - Doutorado - Microbiologia

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Resistência a nanopartícula de prata : análise fenotípica e genotípica em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae
(2020-09-28) Figueiredo, Érica Pelegrin; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nishio, Erick Kenji; Cyoia, Paula Signolfi; Gazal, Luís Eduardo de Souza
As infecções causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos, uma preocupação mundial, são responsáveis por aumentar o tempo de internação dos pacientes afetados, elevando o custo dos tratamentos e aumentando a taxa de morbimortalidade. Os metais têm sido usados desde a antiguidade como agentes antibacterianos e apresentam diferentes propriedades e espectros de ação. Dentre os metais, a prata é um dos mais utilizados devido à sua eficiência como antimicrobiano e sua baixa toxicidade. Com o advento da nanotecnologia na área médica, as nanopartículas de prata (AgNP) passaram a ser amplamente estudadas por sua ação antimicrobiana, inclusive contra bactérias multirresistentes. Em nosso estudo, avaliamos a alteração fenotípica e genotípica em cepas de bactérias Gram-negativas contra a exposição prolongada a subdoses de nanopartículas de prata sintetizadas biologicamente (AgNPbio). AgNPbio foi sintetizada biologicamente por utilizando extrato de Fusarium oxysporum. Após exposição prolongada, foi possível observar alteração na Concentração Inibitória Mínima (CIM) em 7 cepas bacterianas. Após o ensaio de indução, 3 cepas bacterianas apresentaram alteração na sensibilidade colateral e resistência cruzada frente a antimicrobianos convencionais. Nossos resultados mostraram uma atenção necessária na exposição prolongada de AgNPbio contra cepas bacterianas.
Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas
(2021-03-31) Souza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Pavanelli, Wander Rogério; Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José
O ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.
Efeito das nanopartículas de prata biogënicas sobre os fatores de virulência e sistema quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa
(2021-06-07) Saeki, Erika Kushikawa; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Garcia, Doroti de Oliveira; Eller, Lizziane Kretli Winkelströter
O estudo dos compostos com atividade antivirulência para o controle da patogenicidade bacteriana estão em destaque na literatura atual. Dentre estes compostos, as nanopartículas de prata são cada vez mais pesquisadas para o controle da disseminação das infecções por P. aeruginosa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das nanopartículas de prata biogênicas (bio-AgNP) nos fatores de virulência e Sistema Quorum Sensing (QS) em Pseudomonas aeruginosa. As bio AgNPs foram sintetizadas pelo método de redução da prata iônica pelo fungo Fusarium oxysporum e os ensaios foram realizados com isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa e com as cepas de referência PAO1 e PA14. A identificação dos isolados foi realizada por métodos bioquímicos e moleculares e foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM). Os ensaios para avaliar a produção de fatores de virulência (motilidade, ramnolipídeos, protease alcalina, elastase e piocianina) e capacidade de formação de biofilmes foram realizados. O ensaio de RT-qPCR foi realizado para determinar o efeito da bio-AgNP nos genes reguladores de QS (lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsA e mvfR). As CIM variaram de 15,62-62,50 µM, e a CBM foi de 125 µM para PAO1 e PA14. Os resultados mostraram que as concentrações subinibitórias (1/2 CIM) de bio-AgNP (7,81 a 31,25 µM) aumentaram significativamente (p < 0,050) as motilidades swarming, swimming e twitching, em 40,0%, 40,0% e 46,7% nos isolados clínicos e ambientais, respectivamente. Observou-se que a bio-AgNP aumentou significativamente (p < 0,050) a capacidade de formação de biofilmes em um isolado de paciente com fibrose cística. O tratamento com as concentrações subinibitórias de bio-AgNPs em PAO1 não afetou a produção de protease e biofilme. Entretanto, houve redução significativa (p < 0,05) na motilidade e na produção de ramnolipídeos e elastase. Na cepa PA14 houve estímulo na motilidade swarming e twitching, além da produção de elastase, piocianina e formação de biofilme. Os tratamentos com bio-AgNPs também aumentaram a expressão (p < 0,05) dos genes controladores do sistema QS em P. aeruginosa PAO1 e PA14. Conclui-se que o tratamento com concentrações subinibitórias de bio-AgNPs favoreceu o aumento fenotípico na maioria dos fatores de virulência testados. As cepas PAO1 e PA14 apresentaram diferentes respostas ao tratamento com as bio-AgNPs. A exposição bacteriana as baixas concentrações de bio-AgNPs pode promover o aumento na expressão dos genes reguladores do Sistema QS em P. aeruginosa. Por isso, a aplicação das bio-AgNP na terapia antibiofilme e antivirulência precisa ser avaliada com cautela, para que os compostos sejam utilizados na concentração adequada, o sistema QS seja definitivamente interrompido e os fatores de virulência sejam controlados.
Switching fenotípico em Candida tropicalis : alterações na resposta celular e fagocitose frente a estresses oxidativo e osmótico
(2021-12-20) Perini, Hugo Felix; Furlaneto, Márcia Cristina; Furlaneto-Maia, Luciana; França, Emanuele Júlio Galvão de; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Grasi, Melyssa Fernanda Negri
Switching fenotípico em Candida tropicalis promove alterações na manifestação de virulência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Uma vez que o evento pode estar relacionado com alterações na resposta adaptativa, o objetivo do presente trabalho foi availiar o papel do Switching fenotípico na resposta ao estresse osmótico e oxidativo. Para tal, dois sistemas de Switching fenotípico de C. tropicalis (49.07 e 100.10) compostos de cinco morfotipos cada (Parental, Crepe, Rugoso, Revertente de Rugoso e Revertente de Crepe) foram expostos à 1 M de NaCl e 5 mM de H2O2 por 10 e 60 min. Análises de resitência ao estresse foram realizadas por contagem de UFC após exposição e o dano em membrana com ensaio de iodeto de propídio. Análises de expressão dos genes HOG1, EFG1 e WOR1 foram realizadas por qPCR e a quantidade de componentes de parede por ensaio fluorimétrico. Análizou-se também, o efeito do Switching sobre a fagocitose e perfil de filamentação no contato com hemócitos e macrófagos e o efeito da pré-exposição ao H2O2 nessas variáveis. Respostas de alterações na parede celular, expressão dos genes testados e resistência ao estresse foram sistemas-dependente, não apresentando relação direta com o padrão morfológico do morfotipo. Variantes morfológicos (Crepe e Rugoso - 100.10) apresentaram menor e complexidade celular que o Parental, assim como alterações na quantidade de manana e na porosidade da parede. Revertentes morfológicos também apresentam maior quantidade de quitina, β-glucana e porosidade que o Parental. Em resposta ao estresse, 62,5% dos morfotipos derivados de Switching foram mais resistentes ao choque osmótico (10 min) e 25% à osmoadaptação (60 min). Sob estresse oxidativo 37,5% apresentaram maior viabilidade que o parental após 10 min, e 25% sob estresse prolongado (60 min). O morfotipo Crepe destacou-se como morfotipo com maior capacidade de resposta aos estresses testados. Esse morfotipo apresentou menor decréscimo no volume celular sob estresse osmótico e aumento de quitina e manana na parede celular. Sob estresse prolongado HOG1 manteve alta expressão nesse morfotipo (49.07). Sob estresse oxidativo Crepe teve alta expressão de todos os genes testados. Hemócitos e macrófagos apresentaram mesmo perfil de fagocitose. Crepe foi mais fagocitado que Parental, no entanto, houve redução no número de células do morfotipo fagocitadas após pré-exposição ao H2O2. Crepe apresentou alta capacidade de formação de hifas verdadeiras em co-cultivo com os fagócitos. A pré-exposição ao H2O2 promoveu regulação positiva de WOR1 e HOG1 em Crepe (49.07). Células de Crepe pré expostas apresentaram maior quantidade de quitina (100.10) e maior porosidade (ambos os sistemas) que o parental. O presente trabalho pode concluir que switching fenotípico promove alteração do fitness celular e consequentemente resposta alterada aos estresses osmótico e oxidativo em C. tropicalis, refletidas na regulação gênica, alterações da parede celular e na capacidade de morfogênese.
Pseudomonas aeruginosa cepa LV produtora de um antibiótico organometálico : análise do transcriptoma na presença de cobre e atividade antibacteriana em isolados de Acinetobacter baumannii multirresistentes
Gionco, Bárbara; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Marroni, Floristher Elaine Carra; Pereira, Ulisses de Pádua; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Oliveira Júnior, Admilton Gonçalves de [Coorientador]
Resumo: As infecções causadas por microrganismos multirresistentes constituem um problema de saúde pública e apresentam altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos multiresistentes relacionados às infecções hospitalares, com altas taxas de resistência aos carbapenêmicos relatadas em importantes centros de saúde Atualmente a terapia antimicrobiana para o tratamento das infecções multirresistentes por A baumannii baseia-se no uso de polimixinas, e tigeciclina, além da combinação de fármacos Entretanto, isolados resistentes a essas drogas já foram detectados Frente a este problema crescente há uma incerteza na perspectiva do uso de antimicrobianos, levando à necessidade de descoberta de novos compostos O solo é um ecossistema promissor na busca de novos antimicrobianos e bactérias do gênero Pseudomonas isoladas desse hábitat se destacam como um dos microrganismos mais estudados na produção de compostos bioativos Estratégias de biologia molecular, como o sequenciamento de RNA, são fundamentais na elucidação das vias metabólicas de novos compostos, visando à melhoria e otimização de sua produção Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de analisar a expressão gênica diferencial de uma cepa ambiental de P aeruginosa, isolada do solo, produtora de um composto organometálico com atividade antimicrobiana, pela metodologia do RNA-seq, para a compreensão da via de síntese do agente bioativo Além disso, objetivamos testar o composto produzido pela cepa, isoladamente ou em combinação com os fármacos comerciais imipenem e polimixina B, em isolados multirresistentes de A baumannii, a fim de detectar sua possível ação sinérgica Pela análise dos transcritos foram anotados nove genes diferencialmente expressos com relevância estatística nas condições ausência/presença do composto: três deles relacionados ao transporte de íons metálicos (PA3521, PA3523 e PA392), três (PA2691, PA4141 e PA4782) não caracterizados em nenhum dos bancos utilizados, um gene (PA3574a) associado ao grupo de chaperonas ligadas ao cobre, um (PA4872) classificado como um regulador de transcrição e um dos genes (phzA2) relacionado à via biosintética das fenazínas Esses resultados nos permitiram associar a produção do composto com a via metabólica das fenazinas, entretanto mais estudos precisam ser realizados para a confirmação e elucidação da hipótese Para os cinco isolados multirresistentes de A baumannii testados dois apresentaram resistência a polimixina B e todos foram resistentes ao imipenem com concentração inibitória mínima para o composto organometálico foi de 7,8µg/ml A combinação do imipenem com o composto apresentou efeito antagônico para dois isolados e ação indiferente para os demais A combinação com a polimixina B foi mais eficiente, apresentando ação sinérgica para todas as amostras de A baumannii Portanto, essa combinação fornece uma perspectiva futura para uma nova forma de utilização da polimixina B no tratamento das infecções multirresistentes causadas por A baumannii
Caracterização das proteínas coesina e condensina do protozoário Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909)
Shimada, Márcia Kiyoe; Fragoso, Stênio Perdigão [Orientador]; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Zanata, Silvio Marques; Buchi, Dorly de Freitas; Ávila, Andréa Rodrigues
Resumo: As proteínas coesina e condensina pertencem à familia das proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos (do inglês, Structural Maintenance Chromosome, SMC), altamente conservadas desde leveduras até humanos Essas proteínas executam importantes funções no processo de divisão celular, uma vez que elas estão envolvidas na condensação cromossômica e na coesão das cromátides irmãs durante o processo de divisão celular Nós identificamos os ortólogos dessas proteínas no protozoário Trypanosoma cruzi Dm28c Esteparasita apresenta algumas características peculiares como limitada condensaçãocromossômica e a manutenção da integridade do envelope nuclear durante a divisão celularIsso o torna um modelo interessante para o estudo das funções das SMCs Os genes que codificam duas, das coesinas (SMC1 and Scc1) e duas, das condensinas (SMC4 and Cap-D2) foram caracterizados tanto por Southern e Northern blots quanto por análise in silico Os dados mostram que TcSMC1, TcScc1, TcSMC4 e TcCap-D2 são genes de cópia-única nogenoma do T cruzi Dm28c e são transcritos em mRNAs O alinhamento das sequências deaminoácidos deduzidas a partir dos genes das SMCs de T cruzi, T brucei, L major, X laevis,C elegans, H sapiens, S pombe e S cerevisiae mostrou que os motivos conservados dessasproteínas estão presentes em todos os organismos mencionados acima, sugerindo que suasestruturas foram conservadas durante a evolução, as quais são importantes para sua atividadede ATPase e de interações com DNA Pela imunofluorescência, as SMCs estão localizadas nonúcleo Além disso, a análise do perfil de expressão por Western blot mostrou que as SMCs estão expressas nas formas epimastigotas e tripomstigotas para as condensinas Cap-D2 eSMC4 Enquanto as coesinas SMC1 e Scc1 somente foram detectadas no estágio epimastigota, sugerindo que essas proteínas são importantes para a replicação e não para adiferenciação do parasita Esses dados também levantam a hipótese de que essas proteínas possam participar da regulação funcional da cromatina modulando sua organização espacialno núcleo e, consequentemente, modulando a expressão gênica do parasita
Diagnóstico molecular de paracoccidioidomicose pela técnica LAMP e avalação de nova formulação antifúngica complexo anfotericina B-7-dehidrocolesterol
Tatibana, Berenice Tomoko; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Venâncio, Emerson José; Linhares, Rosa Elisa Carvalho
Resumo: Paracoccidioidomicose (PCM) é epidemiologicamente uma das mais importantes micoses da América latina, especialmente no Brasil A doença ocorre por inalação do fungo Paracoccidioides brasiliensis (P brasiliensis) e o foco primário ocorre no pulmão do hospedeiro A PCM pode ser diagnosticada por observação direta da forma característica leveduriforme em amostra clínicas ou de cultura De forma mais frequente, o diagnóstico é feito de forma indireta por exames sorológicos, principalmente por imunodifusão e teste imunoenzimático O diagnóstico da PCM fora dos países endêmicos é difícil Necessita-se desenvolver um diagnóstico mais rápido e específico para PCM A amplificação circular isotérmica (LAMP) foi usada no presente estudo para detecção da presença de P brasiliensis em amostras de escarro de pacientes com PCM crônica, suspeitos para PCM e controle negativo O gene alvo gp43 de P brasiliensis foi amplificado em menos de quatro horas em 11 amostras de escarro O método LAMP possui a vantagem da velocidade e simplicidade quando comparado aos diagnósticos clássicos como o histopatológico ou cultura de material biológico e não requer aparato técnico sofisticado Pode constituir-se em um importante auxílio nos casos onde o estabelecimento do tratamento rápido pode significar a sobrevida do paciente, especialmente naqueles imunossuprimidos Apesar dos avanços significativos em muitas áreas da micologia médica, a PCM permanece com um tratamento de consenso ainda não estabelecido e assim representa a oitava causa comum de morte em doenças predominantemente crônicas ou reemergentes, entre as infecciosas e parasitárias e a mais elevada taxa de mortalidade entre as micoses sistêmicas A anfotericina B (AMB) permanece como a principal escolha terapêutica para micoses severas No entanto, sua utilização é limitada pela toxicidade Para melhorar a eficácia terapêutica e reduzir a toxicidade da AMB em altas doses, muitas estratégias incluindo a utilização de mudança no sistema de veiculação da droga têm sido utilizadas O complexo anfotericina B-7-dehidrocolesterol (AMB-7DC) é uma nova estratégia para AMB para redução de sua toxicidade, utilizando como solvente HCO-6, tornando-se mais hidrossolúvel e resistente às variações térmicas Este trabalho apresenta dados preliminares da avaliação de AMB-7DC em relação a anfotericina B comercial (AMB-D, Fungizona) Parâmetros in vitro de concentração inibitória mínima (MIC) e teste de hemólise em eritrócito de carneiro foram utilizados Testes in vivo avaliaram a LD5 das drogas, o CFU de pulmão em PCM murina, e a taxa de sobrevivência em modelo agudo de criptococose Os resultados indicaram uma baixa toxicidade in vitro para AMB-7DC que não foi hemolítica nas concentrações testadas enquanto a AMB-D mostrou atividade hemolítica O MIC demonstrou sensibilidade para ambas as drogas ao Cryptococcus neoformans Os resultados in vivo em relação ao CFU mostraram resultados semelhantes na PCM para ambas as drogas, não havendo erradicação do fungo Já os dados da criptococose foram favoráveis ao grupo tratado com AMB-D, havendo dose dependência para ambas O presente estudo indica que AMB-7DC possui potencial de utilização e, sendo assim, mais estudos são indicados para sua melhor avaliação
Brevibacillus brevis LABIM 17 : potencial fonte de novos antimicrobianos
Chagas, Larissa de Medeiros; Oliveira Junior, Admilton Gonçalves de [Orientador]; Araújo, Daniela Cristina de Medeiros; Oliveira, José Francis de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Nakazato, Gerson; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Coorientadora]
Resumo: Com o surgimento das “superbactérias” e a descrição de mecanismos de resistência bacteriana contra diversos medicamentos disponíveis no mercado, se faz necessária a busca por novos bioativos antimicrobianos Bactérias ambientais têm se mostrado valiosas ferramentas nessa busca, uma vez que têm capacidade de produzir compostos bioativos como produtos de seu metabolismo secundário Diante deste cenário o presente estudo teve por objetivo a prospecção de bactérias produtoras de antibióticos, bem como estudar alguns parâmetros de produção e estabilidade Inicialmente, foi feita a caracterização fenotípica de 33 isolados em solo de um fragmento de floresta secundária semidecídua em Londrina-PR, Brasil (23 ° 19'37,8 "S 51 ° 12'22,4" O) Dentre os isolados prospectados, 1% eram Gram positivas, 67% apresentavam a capacidade de produzir endósporos e 94% apresentavam-se na forma de bacilos Deu-se prosseguimento, então aos testes de atividade antagônica por cultura dupla contra os patógenos Acinetobacter baumannii (oxa23-positivo), Staphylococcus aureus ATCC 29213 e Escherichia coli ATCC 8739 apenas com os isolados que apresentavam morfologia de bacilos e capacidade de produzir endósporos Dentre os 22 isolados submetidos ao teste de cultura-dupla, LABIM 17 o único isolado capaz de inibir todos os três marcadores, mostrando assim uma atividade de amplo espectro A identificação molecular por rDNA 16S classificou LABIM17 como Brevibacillus sp LABIM 17 Por fermentação liquida submersa foi avaliado a produção de metabolitos extracelulares antibacterianos por LABIM 17 Os resultados obtidos demostraram a produção de metabólitos extracelulares antibacterianos em meio MAK a partir de 72 h Afim de avaliar a estabilidade dos metabólitos, sobrenadante livre de células foram submetidos a diferentes temperaturas e comprimentos de onda de luz visível e UV Os resultados demostraram que os metabólitos foram estáveis a temperaturas abaixo de 7°C e sob todos os comprimentos de onda testados Em antecipação a futuras análises genômicas em profundidade e suas aplicações potenciais, realizamos o sequenciamento completo do genoma da LABIM 17 e foi identificada como Brevibacillus brevis Em análises preliminares de agrupamentos gênicos envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários antibacterianos foram identificados agrupamentos para produção de Petrobactina, Octapeptina, Tirocidina, Gramicidina, Zwittermicin e Aurantinina Todos estes resultados sugerem que B brevis LABIM 17 tem um bom potencial para uso como agente produtor de antibacterianos, porém mais estudos são necessários para purificação, caracterização e aumento de produção dos compostos antibacterianos
Avaliação in vitro e in vivo da atividade do óleo de copaíba contra Leishmania amazonensis
Santos, Adriana Oliveira dos; Nakamura, Celso Vataru [Orientador]; Nakazato, Gerson; Souza, Tatiana de Arruda Campos Brasil de; Toledo, Max Jean de Ornelas; Bruschi, Marcos Luciano
Resumo: A leishmaniose é um problema grave de saúde pública, com altas taxas de morbidade e mortalidade Esforços para encontrar novos fármacos de administração oral eficazes e seguros para o tratamento da leishmaniose estão em curso há várias décadas, a fim de evitar os problemas com o antimoniais usados atualmente No presente estudo, verificou-se que o tratamento oral com óleo de copaíba ocasionou redução significativa no tamanho da lesão em camundongos infectados por Leishmania amazonensis quando comparados com camundongos não tratados Para avaliar a segurança do óleo, a toxicidade e a genotoxicidade foram determinados Avaliação histopatológica não revelou alterações nos animais tratados com óleo de copaíba em relação aos animais controle Na avaliação de mutagenicidade (teste do micronúcleo), a dose testada (2 mg/kg) não mostrou efeitos genotóxicos Análises morfológicas e ultra-estruturais demonstraram mudanças notáveis em células de parasitas tratados com óleo de copaíba obtidos de Copaifera reticulata e Copaifera martii O principal efeito ultraestrutural observado nas células dos parasitas tratados foi um acentuado inchaço mitocondrial No presente estudo, também observou-se que o tratamento in vitro com óleo de copaíba ocasiona o aumento na permeabilidade da membrana plasmática e despolarização do potencial de membrana mitocondrial em células do parasita Além disso, compostos isolados do óleo de copaíba obtidos de Copaifera officinales (ácido agático, ácido hidróxi-copálico, ácido caurenóico, copalato de metila, ácido pinifólico e ácido poliáltico) mostraram atividade frente a L amazonensis Ácido hidroxi-copálico e copalato de metila foram os mais efetivos contra formas promastigotas Por outro lado, o ácido pinifólico e ácido caurenóico foram os mais efetivos na inibição do crescimento de formas amastigotas axênicas O ácido agático, ácido caurenóico e ácido pinifólico induziram o aumento na permeabilidade da membrana plasmática e despolarização do potencial de membrana mitocondrial nas células dos parasitas Embora o mecanismo de ação do óleo de copaíba ainda não esteja totalmete elucidado, estes resultados indicam que o óleo de copaíba pode ser uma opção no desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da leishmaniose
Efeito imunopatológico de co-infeção de camundongos com Paracoccidioides brasiliensis e com Schistosoma mansoni
Oliveira, Francisco José de Abreu; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Falavigna-Guilherme, Ana Lucia; Menezes, Maria Claudia Noronha Dutra de; Costa, Ivete Conchon; Nakazato, Gerson
Resumo: A Paracoccidioidomicose (PCM), uma das mais importantes micoses da América Latina, é uma doença sistêmica de natureza granulomatosa, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), e a sua principal defesa está ligada ao padrão Th1 da resposta imune A esquistossomose é considerada uma das doenças endêmicas mais importantes e mais difundidas do mundo, constituindo-se de um grande problema de saúde pública No Brasil, a doença é causada por Schistosoma mansoni (Sm), e é caracterizada por resposta imune Th2 As principais lesões patológicas na esquistossomose mansônica são decorrentes de desenvolvimento de granulomas em torno de ovos no fígado devido à resposta imune do hospedeiro Ambas as doenças são crônicas, com sobreposição geográfica em várias regiões no Brasil, possibilitando assim a co-infecção com esses agentes Considerando a inexistência de dados sobre efeito imunopatológico na PCM e na esquistossomose, associada à infecção crônica com P brasiliensis e com S mansoni na fase de oviposição, caracterizada pela resposta Th2, o presente trabalho investigou efeito dessa associação utilizando modelo experimental murino Camundongos Balb/c foram infectados com P brasiliensis durante 7 (Pb7) ou 8 dias (Pb8) e associados com S mansoni infectados durante 42 (Pb7Sm42) e ou 52 dias (Pb8Sm52) ou somente com S mansoni durante 42 (Sm42) ou 52 dias (Sm52) Para a investigação de efeito da co- infecção na PCM, foram realizadas determinação da carga fúngica por CFU no fígado e pulmão, histopatologia de fígado e determinação de níveis de citocinas (IFN-?, TGF-ß, TNF-a, IL-4, IL-1 e IL-17) no fígado e determinação de níveis séricos de anticorpos IgG anti-P brasiliensis (ExoAg) e citocinas séricas (IFN-?, IL-4, TGF-ß e IL-1), por ELISA, tendo como controles grupos Pb7 e Pb8 Para a investigação de efeito de co-infecção na esquistossomose foram determinados números de ovos no fígado e intestino (grosso e delgado) e de ovos fecais, análise histopatológica do figado, determinação das citocinas no fígado e soro e níveis séricos de anticorpos IgG para antigeno solúvel de ovos (SEA), tendo como controles os grupos Sm42 e Sm52 Os resultados obtidos demonstraram aumento nos números de CFUs de P brasiliensis no fígado (Pb7Sm42 e Pb8Sm52) e no pulmão (Pb8Sm52) em relação ao controle mono-infectado, Pb7 ou Pb8, (p<,5) Os níveis de todas as citocinas no fígado foram maiores no grupo Pb7Sm42 que o controle Sm42 (p<,5), exceto IFN-? que resultou em menor nível (p<,5) Na fase mais prolongada de infecção, foi detectada alteração nesse perfil, resultando em menor nível de IL-1 e TNF-a em Pb8Sm52, mantendo o perfil para IL-4 e IL-17 Os níveis séricos de IL-4 e IL-1 demonstraram perfil similar ao de fígado, enquanto que o nível de IFN-?, de forma distinta ao de fígado, foi maior em ambos os grupos co-infectadas (Pb7Sm42 e Pb8Sm52), em relação aos seus controles (p<,5) Foi detectado também aumento no nível sérico de TGF-ß em grupo Pb8Sm52 em relação ao controle (p<,5) O nível sérico de IgG anti-ExoAg foi maior apenas no grupo Pb7Sm42 em relação ao Pb7 (p<,5) Os resultados de co-infecção na esquistossomose demonstraram reduções nos números de ovos no fígado, intestino e fezes (p<,5), diminuição no número e no tamanho de granulomas hepáticos (p<,5) Os níveis de citocinas IL-4, IL-1 e de TNF-a no fígado foram menores em ambos os grupos coinfectados (Pb7Sm42 e Pb8Sm52) e o de TGF-ß somente no grupo Pb7Sm42, em relação aos seus respectivos controles (p<,5) Por outro lado o nível de IFN-? foi maior no grupo co-infectado Pb8Sm52, em relação ao Sm52 (p<,5) Os níveis séricos de IFN-? e IL-1 demonstraram perfil similar ao de fígado em ambos os grupos co-infectados, o mesmo ocorrendo com TGF-ß, no grupo Pb7Sm52, todavia foi observado aumento significativo de TGF-ß em co-infecção mais prolongada (Pb8Sm52), em relação ao controle (p<,5) Em contraste com o de fígado, foi detectado nível sérico elevado de IL-4 no grupo co-infectado (Pb8Sm52) em relação ao controle (p<,5) O nível sérico de IgG anti-SEA foi maior no grupo Pb7Sm42 e menor no Pb8Sm52 em relação a cada controle (p<,5) Em conclusão, a forma cronica de PCM doença se torna mais grave quando associada à infecção com S mansoni principalmente na fase de oviposição de S mansoni e, a co-infecção a induz modulação distinta de níveis de citocinas no fígado e no soro Além disso, a co-infecção na fase inicial de oviposição de S mansoni pode induzir aumento na resposta imune humoral específica aos antígenos de P brasiliensis Se essas modulações de resposta imune estão associadas com a gravidade da PCM doença, requer estudos adicionais Na esquistossomose mansônica, a co-infecção com P brasiliensis induz redução no número de ovos no fígado, com diminuição no tamanho de granulomas hepático bem como decrescimo no número de ovos nas mucosas intestinais ou nas fezes, o que poderia favorecer o hospedeiro Por outro lado, também induz modulação de citocinas local (fígado) ou sistemica e supressão de resposta humoral aos antígenos de ovos de S mansoni o que poderia ser prejudicial ao hospedeiro, o que requer também estudos adicionais Em conjunto, a co-infecção de P brasiliensis e S mansoni induz mutuamente modulações de citocinas e anticorpos que podem afetar ambas as doenças, PCM e esquistossomose
Fixação biológica do nitrogênio, estado nutricional, rendimento e qualidade de grãos de soja sob diferentes densidades de plantas
De Luca, Marcos Javier; Hungria, Mariangela [Orientador]; Kaschuk, Glaciela; Nogueira, Marco Antonio; Mercante, Fábio Martins; Vieira, José Carlos; Nogueira, Marco Antonio [Coorientador]
Resumo: A crescente demanda mundial por alimentos tem resultado em pressões para o incremento na produção de grãos, sendo a soja (Glycine max (L) Merr) uma cultura amplamente difundida no mundo por causa da sua plasticidade e potencialidade de rendimento Dentre os fatores críticos para obter altos rendimentos, existe um interesse renovado em arranjos diferenciais na densidade de plantas Hoje, altas densidades de plantas são recomendadas, mas em menores densidades pode haver uma menor competição por água, nutrientes e luz solar, o que pode conduzir à maior sustentabilidade do sistema, particularmente em condições de estresses bióticos e abióticos O objetivo deste trabalho foi o de determinar se a fixação biológica do nitrogênio (FBN) da soja é capaz de fornecer o nitrogênio (N) necessário para a obtenção de altos rendimentos; para isso, foi avaliada a capacidade de FBN da planta sob diferentes densidades A hipótese do estudo é de que a capacidade de FBN é regulada pelo mecanismo de fonte:dreno, com taxas mais elevadas quando existe maior demanda pela planta Foram conduzidos, por quatro anos consecutivos, ensaios a campo em Londrina, Estado do Paraná, com soja sob diferentes densidades, avaliando-se os parâmetros de FBN, nutrição das plantas, rendimento e qualidade dos grãos No primeiro ensaio, foram avaliadas quatro densidades, variando de 4 a 32 plantas ha-1 Em menores densidades verificou-se um estímulo da fotossíntese e da FBN por planta Rendimentos de grãos semelhantes foram obtidos nas diferentes densidades, com redução apenas na densidade mais baixa, de 4 plantas ha-1, que também foi o único tratamento com diferenças nos teores de óleo e proteína nos grãos Nas três safras seguintes, foram realizadas avaliações em densidades variando de 8 a 32 plantas ha–1 e os resultados obtidos no primeiro ano foram confirmados Nesses três ensaios, embora a densidade de plantas tenha sido reduzida em até 75%, o rendimento de grãos foi inferior em apenas uma safra, na menor densidade, e da ordem de 16% Esses resultados indicam alta plasticidade da soja em adaptar a capacidade de fotossíntese e FBN a diferentes densidades Além disso, o plantio em densidades mais baixas traz como vantagens o menor custo de implementação da cultura e menor suscetibilidade a estresses ambientais e nutricionais
Análise polifásica de estirpes brasileiras de beta-rizóbios do gênero Paraburkholderia
Paulitsch, Fabiane; Hungria, Mariangela [Orientador]; Batista, Jesiane Stefânia da Silva; Reis Junior, Fábio Bueno dos; Helene, Luisa Caroline Ferraz; Ribeiro, Renan Augusto
Resumo: Um grupo restrito de bactérias diazotróficas presentes no solo é capaz de realizar simbiose com plantas da familia Fabaceae, levando à formação de nódulos radiculares, especializados no processo de Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) Esses microrganismos são coletivamente chamados de rizóbios e estão presentes nas classes Alfa e Betaproteobacteria Dentre as Betaproteobacterias, o gênero Paraburkholderia se destaca pela sua diversidade, encontrada especialmente no Brasil e na África do Sul No sentido de melhor compreender a diversidade e evolução de rizóbios do gênero Paraburkholderia, quatro estudos foram conduzidos Utilizando a taxonomia polifásica, foram descritas as novas espécies P guartelaensis (Estudo 1), P atlantica e P franconis (Estudo 2) A espécie P guartelaensis foi isolada de nódulos de Mimosa gymnas em uma região de ecótono entre a Mata Atlântica e o Cerrado As análises filogenéticas revelaram que as estirpes em estudo apresentam uma posição isolada em relação as outras espécies conhecidas do gênero: apresentou como espécies mais próximas P oxyphila na análise do 16S RNAr, compartilhando 98,7–98,9% de IN (identidade nucleotídica), e P nodosa Br3437T na análise de sequências multilocus (MLSA), apresentando menos de 95,7% de IN Análises comparativas baseadas em sequenciamento genômico resultaram em valores inferiores aos sugeridos para a delimitação de espécie, respaldando a descrição da nova espécie No mesmo sentido, o estudo 2 descreve as espécies P atlantica e P franconis, isoladas de solos da Mata Atlantica no estado do Rio de Janeiro, utilizando como plantas-iscas Mimosa pudica e Phaseolus vulgaris As estirpes de P atlantica apresentaram maior IN na filogenia do 16S RNAr (99,6%) e MLSA (96,5%) com P piptadeniae enquanto as estirpes de P franconis apresentaram como espécie mais próxima P tuberum, com IN de 99% e 96% nas filogenias do 16S RNAr e MLSA, respectivamente Nas análises genômicas, as estirpes de P atlantica e P franconis apresentaram os valores de 94,4% e 92,7% de identidade genômica com as espécies mais próximas O estudo 3 identificou simbiovares dentre as espécies de rizóbios do gênero Paraburkholderia Os genes simbióticos nodA, nodC e nifH foram submetidos à análises filogenéticas, revelando a presença de pelo menos cinco simbiovares distintos dentro do gênero Paraburkholderia, com alto suporte estatístico Os simbiovares sugeridos foram denominados como mimosae, atlantica, tropicalis, piptadeniae e africana Por fim, o estudo 4 tem como objetivo realizar uma revisão sobre Paraburkholderia nodulíferas com ênfase em estirpes brasileiras As informações foram relacionadas com a descoberta da capacidade de nodulação e FBN pelas bactérias desse gênero, o histórico taxônomico, a distribuição mundial das espécies, a presença de simbiovares, características filogenéticas, ecológicas e o potencial agrobiotecnológico Os referidos estudos demonstram que o Brasil é um rico reservatório de espécies nodulíferas de Paraburkholderia e nossos resultados contribuíram para compreensão das relações evolutivas dentre as espécies do gênero e com seus hospedeiros Por fim, os quatro estudos reforçam a grande diversidade genotípica e metabólica de rizóbios do gênero Paraburkholderia, em especial no Brasil, que pode ser considerado um importante centro de diversidade do gênero e fonte de bactérias com potenciais inovadores
Análise microbiológica de pontas de cateteres venosos centrais de pacientes do Hospital Universitário - Londrina - Paraná
Ross, Claudia; Pelayo, Jacinta Sanchez [Orientador]; Venâncio, Emerson José; Saridakis, Halha Ostrensky; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Bedendo, João
Resumo: Cateteres venosos centrais (CVC) são utilizados com a finalidade de facilitar o diagnóstico e o tratamento de pacientes hospitalizados Entretanto, o uso destes oferece riscos de infecção local e sistêmica Staphylococcus aureus e S epidermidis são agentes etiológicos de infecções relacionadas a CVC e possuem a capacidade de produzir biofilme A formação do biofilme depende da produção de uma substância chamada Polysaccharide Intercellular Adhesin (PIA) sintetizada pelo operon ica O presente trabalho teve por objetivos isolar e identificar microrganismos de pontas de CVC de pacientes internados entre junho de 23 à junho de 24, no Hospital Universitário (HU) da Universidade Estadual de Londrina (UEL) Estabelecer o perfil de resistência dos isolados frente a anti-sépticos, desinfetantes, e antimicrobianos e realizar a ribotipagem de cepas de S aureus e S epidermidis através da técnica Ribosome Spacer-Polymerase Chain Reaction (RS-PCR) Investigar a presença dos genes icaA e icaD nessas cepas através do método da Polymerase Chain Reaction (PCR), verificar a expressão fenotípica de biofilme através dos testes em Microplaca de Poliestireno (MP) e em Ágar Vermelho Congo (AVC) e avaliar a eficácia desses métodos utilizados na detecção de cepas produtoras de biofilme Neste estudo, 198 pontas de CVC foram avaliadas e 15 (53%) foram consideradas positivas, pois apresentaram crescimento microbiano igual ou superior a 15 Unidades Formadoras de Colônia (UFC) Os microrganismos mais isolados foram: Estafilococos coagulase-negativa (ECN) (35,2%), S aureus (25,7%), Klebsiella pneumoniae (8,5%), Acinetobacter baumannii (7,6%), Pseudomonas aeruginosa (7,6%), e Candida albicans (4,7%) Todas as bactérias estudadas foram sensíveis ao PVP-I degermante 1%, Clorexidina alcoólica ,5%, Clorexidina degermante 2%, e ao Ácido peracético ,5% Duas (4%) cepas de Staphylococcus sp foram resistentes ao PVP-I tópico 1% e 3 (6%) resistentes ao Hipoclorito de sódio 1% Entre as bactérias Gram-negativas, 1 (4%) foi resistente ao PVP-I tópico 1% e 4 (16%) resistentes ao Hipoclorito de sódio 1% O perfil de resistência de cepas de ECN e S aureus aos antimicrobianos foi: ciprofloxacina (81,5 e 91,3%), eritromicina (81,5 e 1%), gentamicina (81,5 e 91,3%), oxacilina (96,3 e 95,7%), penicilina (1%), respectivamente Nenhuma cepa apresentou resistência a vancomicina O perfil de resistência apresentado por A baummannii, P aeruginosa e K pneumoniae foi: amicacina (1, 75 e 6%), ampicilina-sulbactam (5, 62,5, e 1%) cefotaxima (1%), ceftazidima (1%), ciprofloxacina (1, 87,5, e 4%), gentamicina (1, 1 e 8%), respectivamente A baumannii e P aeruginosa apresentaram 37,5% e 75% de resistência ao imipenem, e todas as cepas de K pneumoniae foram sensíveis Cem por cento (1%) das cepas de A baumannii foram sensíveis ao meropenem e 37,5% das cepas de P aeruginosa foram resistentes ao meropenem, mas sensíveis a colistina A tipagem molecular mostrou 6 diferentes perfis de ribotipagem para S aureus O perfil I foi verificado em 21 (8,8%) das cepas que também foram multiresistentes a antimicrobianos Destas, 18 (69,2%) cepas de S aureus apresentaram a mesma biotipagem, perfil de resistência a antimicrobianos e ribotipagem Observou-se que os outros perfis de ribotipagem encontrados (perfil II-VI) estavam associados com cepas de S aureus que mostraram uma menor resistência a antimicrobianos S epidermidis apresentaram biotipagem e perfil de resistência a antimicrobianos diferentes, porém o mesmo perfil de ribotipagem Os genes icaA1 e icaD1 foram detectados em 22 (95,7%) cepas de S aureus e os genes icaA2 e icaD2 em 16 (8%) cepas de S epidermidis Todos os isolados estudados de S aureus e 19 (95%) de S epidermidis foram produtores de biofilme em MP Apenas 1 (4,3%) cepa de S aureus e 7 (35%) de S epidermidis foram positivas em AVC A identificação de microrganismos isolados em pontas de CVC e o conhecimento do perfil de resistência destes frente aos anti-sépticos, desinfetantes e antimicrobianos são de extrema importância para o controle de infecções e para a determinação de ações terapêuticas e epidemiológicas A técnica de RS-PCR pode ser usada para tipagem de cepas de S aureus, por ser um método rápido, barato e reprodutível O método PCR permitiu a detecção de genes ica nos isolados analisados de S aureus e S epidermidis e o teste em MP foi mais eficaz para a detecção fenotípica de biofilme do que o AVC
Ação protetora de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia L. contra infecção por Candida albicans através do aumento das funções de fagócitos
Loyola, Wagner; Felipe, Ionice [Orientador]; Silva, João Santana da; Saridakis, Halha Ostrensky; Gaziri, Luis Carlos Jabur; Panagio, Luciano Aparecido
Resumo: Este trabalho pesquisou os principais efeitos de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia (EJ), na fagocitose e morte de Candida albicans, na produção de TNF-a e envolvimento com a sobrevivência dos animais a um inóculo letal do fungo Os macrófagos de animais pré-tratados com EJ por 72 h foram co-incubados 1:5 leveduras de C albicans (CR15) por 3 minutos a 37ºC A eficiência fagocítica foi de 68% de macrófagos fagocitantes na presença de soro, cuja atividade fungicida reduziu 76% do inóculo de C albicans Esta ativação dos fagócitos pode ser explicada pelo aumento significativo na produção de anion superóxido comparado ao de fagócitos de animais controle (PBS) A atividade dos receptores foi pesquisada na presença de Manose (5 mM) e Manana (1mg) ou Laminarina (1mg) A eficiência da fagocitose aumentou significativamente (52%) nos macrófagos de camundongos pré-tratados com JE 72 h antes dos ensaios, contra 2% dos macrófagos controle Este aumento foi reduzido a 34% na presença de bloqueadores do receptor de manose (Manose mais Manana) e para 16% na presença de glucana solúvel (laminarina), um inibidor do receptor Dectina-1 Os macrófagos pré-tratados com JE 72h apresentaram aumento na produção de TNF-a após serem co-incubados com C albicans, por 2h, ação que foi inibida com a presença de laminarina durante os ensaios Neste trabalho, avaliamos também a ação do EJ na proteção contra candidíase, assim, animais pré-tratados 72h com o extrato, apresentaram aumento na produção de TNF-a após 2h de infecção com C albicans e uma redução na concentração do fungo no exsudato peritoneal, fígado, baço e rim durante este tempo Estes resultados sugerem que EJ aumentou significativamente os níveis de TNF-a, a atividade dos receptores de Manose, Dectina-1 e de Complemento, sendo estes processos relacionados com maior atividade fagocítica e candidacida, o que possibilitou 9% dos animais tratados com extrato sobreviverem a um inóculo letal de C albicans versus 2% do controle
Caracterização de Escherichia coli produtora de ESBL e AmpC de amostras clínicas humanas e de carcaças de frango
Koga, Vanessa Lumi; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama [Orientador]; Nakazato, Gerson; Vespero, Eliana Carolina; Perugini, Marcia Regina Eches; Brito, Benito Guimarães de
Resumo: A emergência de bactérias produtoras de betalactamases de espectro estendido (ESBL) e/ ou AmpC em humanos e nas carnes de origem animal tem criado uma grande preocupação quanto à possibilidade de transmissão da resistência aos antimicrobianos por meio da cadeia alimentar O objetivo do nosso trabalho foi estudar amostras de Escherichia coli produtoras de ESBL e AmpC mediadas por plasmídios (pAmpC), isoladas da carcaça de frango e da clínica humana na cidade de Londrina, e estes foram analisados quanto ao perfil de resistência antimicrobiana, virulência e relação clonal O primeiro estudo refere-se às amostras de E coli produtoras de ESBL isoladas de infecção do trato urinário (ITU) e de carcaças de frango Entre as amostras isoladas de ITU, identificamos genes de ESBL, como blaCTX-M-2, blaCTX-M-3, blaCTX-M-8, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-27, enquanto que nas amostras de carcaças de frango identificamos blaCTX-M-1, blaCTX-M-2 e blaCTX-M-8 As amostras apresentaram fatores de virulência associados a E coli patogênica aviária (APEC) (931% em ITUs e 7143% em carcaças de frango) e ilhas de patogenicidade (524% em ITUs e 31% em carcaças de frango) Por meio do “Pulsed Field Gel Electrophoresis” (PFGE) e do “Multilocus Sequence Typing” (MLST), nossos resultados demonstraram uma alta diversidade de cepas entre ambos os grupos de amostras O segundo estudo refere-se às amostras produtoras de pAmpC isoladas de carcaças de frango e amostras clínicas humanas Nesse trabalho, todas as amostras apresentaram o gene blaCMY-2, e foram consideradas multirresistentes A maioria das amostras (7143%) estavam associadas a sequência de inserção ISEcp1 Por meio do MLST, 11 “Sequence types” foram identificados, sendo apenas o ST354 encontrado em ambos os grupos de amostras PFGE demonstrou uma alta diversidade entre as amostras clínicas com as amostras de frango Nossos trabalhos demonstraram uma alta diversidade bacteriana entre as amostras clínicas com as isoladas de carcaças de frango No entanto, a presença de fatores de virulência e genes de resistência, associados a infecções humanas, nas amostras isoladas de carne de frango representam um potencial zoonótico ao homem
Atividade antibacteriana e mecanismos de ação de nanopartículas de ouro
Nishio, Erick Kenji; Nakazato, Gerson [Orientador]; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nakamura, Celso Vataru; Bodnar, Giovana Carolina; Cyoia, Paula Signolfi
Resumo: Os metais nobres têm um histórico de uso na medicina bastante antigo Há relatos de uso desde 15 AC, no entanto deram lugar aos antibióticos após a grande descoberta da penicilina Porém com a emergência de microrganismos multirresistentes, a busca por “novos antimicrobianos” tem levado pesquisadores a “antigos medicamentos”, como o ouro Apesar de antigo, o ouro vem ganhando uma nova forma de destaque, a nanopartícula de ouro (AuNP) Neste estudo, foi avaliada a atividade antimicrobiana de AuNP quimicamente sintetizadas, bem como seus possíveis mecanismos de ação A atividade antibacteriana foi testada frente a cepas Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo multirresistentes utilizando técnicas de microdiluição em caldo para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e curva de tempo e morte Já as alterações na bactéria, internas e externas, foram avaliadas através de microscopia eletrônica de transmissão (MET) e varredura (MEV) respectivamente Com relação a avaliação dos mecanismos que a AuNP age sobre a bactéria, foram testados permeabilidade de membrana, produção total de espécies reativas de oxigênio (EROs), peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas, degradação de ácidos nucleicos e perfil de proteínas totais Além disso, foi avaliada a citotoxicidade em células primárias (hemácias) e de linhagem (HEp-2) Os valores de CIM5 foram de ,5 µg/ml e de 1,56 µg/ml, para Gram-positivos e Gram-negativos, respectivamente Para ambos os grupos, a AuNP apresentou efeito bactericida Nas imagens de MEV observamos extravasamento de material citoplasmático, e na MET observamos acúmulo de AuNP na membrana e citoplasma, lise de membrana e liberação de vesículas de membrana externa, que podem estar relacionadas ao quorum-sensing ocasionando aglomeração das células bacterianas Os ensaios de mecanismos mostraram desestabilização de membrana e permeabilidade, indução de EROs e consequente danos a proteínas, lipídeos e material genético Já os ensaios de citotoxicidade mostraram uma concentração citotóxica (CC5) de 2,12 µg/ml, e uma concentração hemolítica (HC5) de 5,97 µg/ml Esses resultados indicam um grande potencial bactericida das AuNP, agindo em vários alvos dentro da bactéria O valor de CC5 relativamente baixo, pode ser devido às propriedades antitumorais relatadas para as AuNP Portanto, as AuNPs exibem um grande potencial para aplicação como antimicrobiano e controle de microrganismos multirresistentes
Caracterização fenotípica e molecular de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa produtores de metalo-beta-lactamases
Carrara-Marroni, Floristher Elaine; Pelayo, Jacinta Sanchez [Orientador]; Garcia, Lourdes Botelho; Venâncio, Emerson José; Nóbrega, Gisele Maria Andrade de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Tognim, Maria Cristina Bronharo [Coorientadora]
Resumo: A produção de metalo-beta-lactamases (MßL) é um importante mecanismo de resistência aos carbapenêmicos detectado com aumentada freqüência entre isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa recuperados no Brasil Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, pesquisar a ocorrência de MßL e caracterizar fenotipicamente e genotipicamente isolados de Pseudomonas aeruginosa recuperados de pacientes internados ou atendidos no Hospital Universitário de Londrina e no Ambulatório do Hospital das Clínicas Um total de 24 isolados de P aeruginosa, coletados consecutivamente durante o período de março de 23 a março de 25, foram avaliados Destes, 141 isolados que não apresentaram sensibilidade à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram selecionados para a pesquisa de MßLs e detecção por PCR de genes codificadores destas enzimas Uma alta taxa de resistência aos antimicrobianos foi verificada entre as P aeruginosa estudadas sendo que somente as polimixinas mostraram atividade contra 1% dos isolados Quarenta e sete isolados foram produtores de MßL e os genes blaSPM-1 e blaIMP-16 foram encontrados em 45 e 2 isolados, respectivamente Os isolados produtores de SPM-1 foram agrupados em 11 clones com diferentes perfis de multirresistência aos antimicrobianos As cepas de P aeruginosa pertencentes ao clone A apresentaram relação genética com o clone epidêmico brasileiro produtor de SPM-1, denominado SP, e a disseminação deste clone foi verificada em diferentes setores do HU Os isolados produtores de SPM-1 foram recuperados com maior freqüência entre pacientes internados na Enfermaria Masculina e nas UTIs do HU, sugerindo um importante papel destes setores na disseminação e manutenção de cepas produtoras de MßLs neste hospital Os isolados Pa3 e Pa43, produtores de IMP-16, não apresentaram resistência aos carbapenêmicos e foram agrupados em um clone distinto O seqüenciamento dos isolados Pa3 e Pa43 mostrou a presença do gene blaIMP-16 como um único cassete gênico localizado em um novo integron da classe 1 O gene cassete blaIMP-16 foi precedido por um promotor Pc fraco e por um outro promotor P2 inativo Este gene está localizado num plasmídeo de 6Kb nos dois isolados produtores de IMP-16 Os isolados Pa3 e Pa43 apresentaram níveis transcricionais de oprD e de ampC similares aos da cepa de referência Pa1 indicando que, provavelmente, estes isolados apresentam uma expressão normal da porina OprD e produzem quantidades basais da enzima AmpC Uma hiperexpressão dos sistemas de efluxo MexAB-OprM, MexCD-OprJ e MexXY foi verificada em ambos isolados produtores de IMP-16 Este estudo relata a primeira detecção do gene blaIMP-16 na região Sul do Brasil e a primeira descrição de isolados clínicos de P aeruginosa produtores de IMP-16 não resistentes aos carbapenêmicos
Análise do potencial de virulência de isolados de Cryptococcus gattii sensu lato
Yoshizawa, Natália de Souza Botelho; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Morey, Alexandre Tadachi; Izumi, Érika; Ribeiro, Renan Augusto
Resumo: A criptococose é uma doença fúngica que atinge mais de um milhão de pessoas no mundo todo, sendo os principais agentes causadores Cryptococus neoformans e Cgattii, que estão amplamente distribuídos pelos mais diversos ambientes Esse trabalho teve como objetivo analisar os fatores de virulência (produção de cápsula, melanina, crescimento a 37oC e produção de enzimas), determinar o perfil de sensibilidade à anfotericina B e à nanopartículas de prata biológicas de isolados ambientais e clínicos de Cryptococcus gattii Além disso, também foi realizada infecção experimental em camundongos BALB/c e análises histológicas dos órgãos infectados Todos isolados apresentaram cápsula, apenas dois não apresentaram produção de melanina Todos isolados cresceram a 37oC, porém, nenhum isolado estudado apresentou elevada produção das enzimas analisadas (proteases e fosfolipases) A concentração inibitória de anfotericina B variou de ,25 a 8 µg/mL, sendo um isolado de origem ambiental classificado como resistente a este antifúngico (CIM > 16 µg/mL) As CIMs das nanopartículas de prata variaram de ,39 a 2 µM Para a infecção experimental foi utilizada a via nasal para inoculação das leveduras nos camundongos Os animais infectados apresentaram sintomas como pelo eriçado, dificuldade em abrir os olhos, movimentos repetitivos de coçar e andar em círculos, indicando alterações no sistema nervoso central Durante o período de observação (6 dias) 12,8% dos animais foram a óbito Em conclusão, os diferentes isolados de C gattii, independente da origem, expressam fatores de virulência e são capazes de desenvolver infecção em camundongo imunocompetente Outras análises devem ser conduzidas para esclarecer os mecanismos envolvidos na patogênese de C gattii e dessa forma desenvolver novas estratégias de controle da criptococose
Avaliação da eficiência de bioprodutos e da inoculação micorrízica no controle da ferrugem asiática da soja e no desempenho da cultura
Barazetti, André Riedi; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Grange, Luciana; Cely, Martha Viviana Torres; Navarro, Miguel Octávio Pérez; Canteri, Marcelo Giovanetti
Resumo: A soja é a principal cultura no Brasil, no entanto seu cultivo é prejudicado pela Ferrugem Asiática da Soja (FAS), doença causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, que pode levar a perda de plantações inteiras Para que altas produtividades sejam atingidas uma série de manejos são realizados, dentre eles o uso de defensivos agrícolas e fertilizantes minerais Apesar de trazer benefícios, essas medidas também causam uma série de impactos ambientais e à saúde, como seleção de microrganismos resistentes e contaminação do solo, água subterrânea e rios Para contornar esses problemas uma alternativa é a pesquisa de novos compostos de origem natural com potencial antimicrobiano e utilização de inoculantes agrícolas para melhor aproveitamento dos nutrientes do solo Bactérias do genêro Pseudomonas sp possuem grande potencial de produção de metabólitos secundários, do mesmo modo, fungos micorrízicos arbusculares (FMA) são conhecidos por desenvolverem associações simbióticas com raízes de plantas e auxiliarem na absorção de nutrientes do solo, em especial o fósforo Os objetivos desse trabalho foram avaliar a utilização da fração F4A, produzida pelo metabolismo secundário da cepa de P aeruginosa LV, no controle biológico e na indução de resistência da FAS e, seus efeitos na morfologia e na colonização rizosférica do FMA Rhizophagus clarus bem como no desenvolvimento agronômico da cultura da soja Sementes foram inoculadas com o FMA e semeadas em área experimental da fazenda escola da Universidade Estadual de Londrina, Brasil Após os primeiros sintomas da FAS as plantas foram tratadas com duas concentrações da fração semi-purificada F4A (1 µg mL-1e 1 µg mL-1), misturadas ou não com fungicidas comerciais (Unizeb Gold® ou Sphere Max®) Após 24 horas de aplicação, folhas foram colhidas e preparadas para avaliação Imagens de microscopia eletronica de varredura (MEV) e microscopia óptica (MO) revelaram alterações ultraestruturais em hifas e esporos de P pachyrhizi, similarmente aos fungicidas comerciais A colonização micorrízica, massa seca, altura e produtividade foram maiores nas plantas tratadas com F4A 1 µg mL-1 e F4A 1 e 1 µg mL-1 + Sphere max® Através de análise metabolômica foi possível observar que nas plantas tratadas com F4A 1 e 1 µg mL-1 e nas plantas tratadas com Sphere max® houve incremento na produção flavonóides, compostos com propriedades antioxidantes, possivelmente uma resposta da planta à produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) induzidas pela aplicação de fenazinas, presentes na fração F4A
Caracterização fenotípica e molecular de mecanismos de resistência aos antimicrobianos e de fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa
Paula, Suelen Balero de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Picão, Renata Cristina; Gionco, Bárbara; Venâncio, Emerson José; Pelayo, Jacinta Sanchez; Marroni, Floristher Elaine Carrara [Coorientadora]
Resumo: Objetivo: O presente estudo teve como objetivo caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, quinolonas, aminoglicosídeos e colistina mediados por plasmídeos e diversos fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa Artigo científico 1: Uma coleção de duzentos e dez isolados de P aeruginosa não sensíveis à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram incluídos no estudo Os isolados foram recuperados no Laboratório de Microbiologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina (HU) no período de junho de 212 a maio de 214 A identificação bacteriana foi realizada pelo Vitek-2® (bioMéurieux) e por testes bioquímicos convencionais, seguida pela confirmação por PCR O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de disco-difusão para treze antimicrobianos A concentração inibitória mínima (CIM) à ceftazidima, aos carbapenêmicos e às polimixinas foi determinada pelo método de microdiluição em caldo Os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos foram interpretados segundo o documento M1-S27 (CLSI,217) e a classificação da resistência foi determinada segundo os critérios de Magiorakos (212) A produção de carbapenemases foi avaliada pelo Blue Carba Test (BCT) e a produção de metalo-beta-lactamases (MBL) foi determinada pelo Teste de Sinergismo de Disco Triplo (TSDT) A presença de genes codificadores de beta-lactamases, carbapenemases, Qnr, 16S rRNA metiltransferases e integrases foi investigada por PCR convencional ou multiplex seguida por sequenciamento A produção de fatores de virulência produzidos por P aeruginosa foi detectada entre os isolados produtores de carbapenemases utilizando testes fenotípicos Além disso, a capacidade de formação de biofilme foi avaliada em microplacas de poliestireno e os genes codificadores de fatores de virulência foram pesquisados por PCR A clonalidade dos isolados produtores de carbapenemases foi avaliada por ERIC-PCR e o Sequence Type (ST), de cinco isolados escolhidos aleatoriamente produtores de diferentes genes de carbapenemases e de clones distintos, foi determinado por Multilocus Sequence Typing (MLST) Altas taxas de resistência aos carbapenêmicos foram verificadas (8,9% para o imipenem e 78,% para o meropenem) e somente as polimixinas apresentaram 1,% de atividade contra todos os isolados do estudo Cerca de 54,7% dos isolados foram classificados como multirresistentes (MR) e 31,9% como extensivamente resistentes (ER) A produção de carbapenemases e de MBL foi detectada em 33,3% e 31,9% dos isolados pelo BCT e pelo TSDT, respectivamente Uma diversidade de genes codificadores de carbapenemases foi verificada entre 7 isolados: blaSPM-1 (63/3,%), blaKPC-2 (3/1,4%), blaIMP-16 (2/,9%), blaVIM-1 (1/,4%) e blaVIM-7 (1/,4%) Foram detectados genes codificadores de beta-lactamases (blaGES-26, blaOXA-46 e blaCTX-M-15) e de resistência aos aminoglicosídeos (rmtD) O gene blaIMP-16 foi detectado como o único gene cassete de um integron da classe I nos dois isolados produtores de IMP-16 O contexto genético dos genes blaVIM-1 e blaVIM-7 foram semelhantes: o gene codificador da MBL como o primeiro cassete gênico, seguido por uma enzima modificadora de aminoglicosídeos (aadA1) e o gene blaOXA-46 anteriormente ao qac?E/sulI Todos os isolados produtores de carbapenemases formaram biofilme e apresentaram o gene lasI codificador de um dos componentes do quorum sensing Um total de 98,6% e 94,3% foram produtores de hemolisinas e proteases, respectivamente Os genes que codificam a fosfolipase hemolítica (plcH), elastase (lasB), exotoxina A (toxA) e exotoxina S foram detectados em 94,3% dos isolados produtores de carbapenemases Apenas um e quatro isolados apresentaram os genes que codificam neuraminidase (nanI) e a exotoxina U, respectivamente A tipagem molecular dos isolados produtores de carbapenemases evidenciou grande diversidade clonal com a presença de 18 genótipos distintos, dos quais os isolados portadores de blaSPM-1 foram agrupados em 14 genótipos e os isolados portadores de blaKPC-2, blaIMP-16, blaVIM-1 e blaVIM-7 foram agrupados em clones únicos Diferentes STs foram obtidos para os cinco isolados submetidos ao MLST e dentre estes dois foram relacionados à disseminação de determinantes de resistência: o portador de blaSPM-1 pertenceu ao ST277, relacionado à disseminação de SPM-1 no Brasil e o portador de blaKPC-2 ao ST235, um importante clone epidêmico mundial Artigo científico 2: Este estudo relatou a primeira descrição de um isolado de P aeruginosa produtor de VIM-7 no Brasil O isolado foi recuperado em maio de 213 da secreção traqueal (17 UFC/mL) de um paciente internado no HU que apresentou resistência a todos os antimicrobianos, com exceção das polimixinas A produção de carbapenemases foi avaliada pelo BCT e a de MBL pelo TDST O gene blaVIM-7 foi localizado num plasmídeo de 52 Kb como o primeiro gene cassete de um integron da classe I seguido por um gene aadA1 e o blaOXA-46 situado anteriormente ao qac?E/sulI O isolado pertenceu ao ST1284, foi um forte produtor de biofilme e apresentou os genes codificadores de fatores de virulência lasI, lasB, plcH, toxA e exoS Artigo científico 3: O artigo relata a presença de um isolado de P aeruginosa produtor de KPC-2 pertencente ao ST235 em 28, anteriormente à primeira detecção do gene blaKPC no Brasil e de um surto de Enterobactérias produtoras de blaKPC no HU Este isolado foi recuperado da urina de uma paciente internada no setor de queimados do HU, foi classificado como ER e apresentou sensibilidade apenas às polimixinas A produção de carbapenemases foi detectada pelo BCT e o resultado negativo no TSDT caracterizou uma carbapenemase não MBL O gene blaKPC-2 apresentou localização cromossomal, em um contexto genético idêntico a isolados recuperados no HU em 21 O gene blaKPC-2 foi flanqueado à montante pela sequência de inserção ISKpn6, entretanto à jusante não foram detectadas ISKpn7 e ISKpn8 O isolado foi considerado hipervirulento, um forte formador de biofilme, produziu hemolisina e protease e apresentou os genes lasI, lasB, plcH, toxA, exoY e exoU Conclusões: As altas taxas de resistência aos antimicrobianos, a diversidade de genes codificadores de carbapenemases, a produção de importantes fatores de virulência e a detecção de STs relacionados a clones epidêmicos nacional e mundial refletem o problema da resistência aos antimicrobianos em P aeruginosa no HU Desta forma o estudo enfatiza a necessidade de medidas estritas de controle de infecção e de programas efetivos para o uso racional dos antimicrobianos neste hospital

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