01 - Doutorado - Microbiologia
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Item Resistência a nanopartícula de prata : análise fenotípica e genotípica em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae(2020-09-28) Figueiredo, Érica Pelegrin; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nishio, Erick Kenji; Cyoia, Paula Signolfi; Gazal, Luís Eduardo de SouzaAs infecções causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos, uma preocupação mundial, são responsáveis por aumentar o tempo de internação dos pacientes afetados, elevando o custo dos tratamentos e aumentando a taxa de morbimortalidade. Os metais têm sido usados desde a antiguidade como agentes antibacterianos e apresentam diferentes propriedades e espectros de ação. Dentre os metais, a prata é um dos mais utilizados devido à sua eficiência como antimicrobiano e sua baixa toxicidade. Com o advento da nanotecnologia na área médica, as nanopartículas de prata (AgNP) passaram a ser amplamente estudadas por sua ação antimicrobiana, inclusive contra bactérias multirresistentes. Em nosso estudo, avaliamos a alteração fenotípica e genotípica em cepas de bactérias Gram-negativas contra a exposição prolongada a subdoses de nanopartículas de prata sintetizadas biologicamente (AgNPbio). AgNPbio foi sintetizada biologicamente por utilizando extrato de Fusarium oxysporum. Após exposição prolongada, foi possível observar alteração na Concentração Inibitória Mínima (CIM) em 7 cepas bacterianas. Após o ensaio de indução, 3 cepas bacterianas apresentaram alteração na sensibilidade colateral e resistência cruzada frente a antimicrobianos convencionais. Nossos resultados mostraram uma atenção necessária na exposição prolongada de AgNPbio contra cepas bacterianas.Item Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas(2021-03-31) Souza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Pavanelli, Wander Rogério; Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson JoséO ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.Item Efeito das nanopartículas de prata biogënicas sobre os fatores de virulência e sistema quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa(2021-06-07) Saeki, Erika Kushikawa; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Garcia, Doroti de Oliveira; Eller, Lizziane Kretli WinkelströterO estudo dos compostos com atividade antivirulência para o controle da patogenicidade bacteriana estão em destaque na literatura atual. Dentre estes compostos, as nanopartículas de prata são cada vez mais pesquisadas para o controle da disseminação das infecções por P. aeruginosa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das nanopartículas de prata biogênicas (bio-AgNP) nos fatores de virulência e Sistema Quorum Sensing (QS) em Pseudomonas aeruginosa. As bio AgNPs foram sintetizadas pelo método de redução da prata iônica pelo fungo Fusarium oxysporum e os ensaios foram realizados com isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa e com as cepas de referência PAO1 e PA14. A identificação dos isolados foi realizada por métodos bioquímicos e moleculares e foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM). Os ensaios para avaliar a produção de fatores de virulência (motilidade, ramnolipídeos, protease alcalina, elastase e piocianina) e capacidade de formação de biofilmes foram realizados. O ensaio de RT-qPCR foi realizado para determinar o efeito da bio-AgNP nos genes reguladores de QS (lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsA e mvfR). As CIM variaram de 15,62-62,50 µM, e a CBM foi de 125 µM para PAO1 e PA14. Os resultados mostraram que as concentrações subinibitórias (1/2 CIM) de bio-AgNP (7,81 a 31,25 µM) aumentaram significativamente (p < 0,050) as motilidades swarming, swimming e twitching, em 40,0%, 40,0% e 46,7% nos isolados clínicos e ambientais, respectivamente. Observou-se que a bio-AgNP aumentou significativamente (p < 0,050) a capacidade de formação de biofilmes em um isolado de paciente com fibrose cística. O tratamento com as concentrações subinibitórias de bio-AgNPs em PAO1 não afetou a produção de protease e biofilme. Entretanto, houve redução significativa (p < 0,05) na motilidade e na produção de ramnolipídeos e elastase. Na cepa PA14 houve estímulo na motilidade swarming e twitching, além da produção de elastase, piocianina e formação de biofilme. Os tratamentos com bio-AgNPs também aumentaram a expressão (p < 0,05) dos genes controladores do sistema QS em P. aeruginosa PAO1 e PA14. Conclui-se que o tratamento com concentrações subinibitórias de bio-AgNPs favoreceu o aumento fenotípico na maioria dos fatores de virulência testados. As cepas PAO1 e PA14 apresentaram diferentes respostas ao tratamento com as bio-AgNPs. A exposição bacteriana as baixas concentrações de bio-AgNPs pode promover o aumento na expressão dos genes reguladores do Sistema QS em P. aeruginosa. Por isso, a aplicação das bio-AgNP na terapia antibiofilme e antivirulência precisa ser avaliada com cautela, para que os compostos sejam utilizados na concentração adequada, o sistema QS seja definitivamente interrompido e os fatores de virulência sejam controlados.Item Switching fenotípico em Candida tropicalis : alterações na resposta celular e fagocitose frente a estresses oxidativo e osmótico(2021-12-20) Perini, Hugo Felix; Furlaneto, Márcia Cristina; Furlaneto-Maia, Luciana; França, Emanuele Júlio Galvão de; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Grasi, Melyssa Fernanda NegriSwitching fenotípico em Candida tropicalis promove alterações na manifestação de virulência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Uma vez que o evento pode estar relacionado com alterações na resposta adaptativa, o objetivo do presente trabalho foi availiar o papel do Switching fenotípico na resposta ao estresse osmótico e oxidativo. Para tal, dois sistemas de Switching fenotípico de C. tropicalis (49.07 e 100.10) compostos de cinco morfotipos cada (Parental, Crepe, Rugoso, Revertente de Rugoso e Revertente de Crepe) foram expostos à 1 M de NaCl e 5 mM de H2O2 por 10 e 60 min. Análises de resitência ao estresse foram realizadas por contagem de UFC após exposição e o dano em membrana com ensaio de iodeto de propídio. Análises de expressão dos genes HOG1, EFG1 e WOR1 foram realizadas por qPCR e a quantidade de componentes de parede por ensaio fluorimétrico. Análizou-se também, o efeito do Switching sobre a fagocitose e perfil de filamentação no contato com hemócitos e macrófagos e o efeito da pré-exposição ao H2O2 nessas variáveis. Respostas de alterações na parede celular, expressão dos genes testados e resistência ao estresse foram sistemas-dependente, não apresentando relação direta com o padrão morfológico do morfotipo. Variantes morfológicos (Crepe e Rugoso - 100.10) apresentaram menor e complexidade celular que o Parental, assim como alterações na quantidade de manana e na porosidade da parede. Revertentes morfológicos também apresentam maior quantidade de quitina, β-glucana e porosidade que o Parental. Em resposta ao estresse, 62,5% dos morfotipos derivados de Switching foram mais resistentes ao choque osmótico (10 min) e 25% à osmoadaptação (60 min). Sob estresse oxidativo 37,5% apresentaram maior viabilidade que o parental após 10 min, e 25% sob estresse prolongado (60 min). O morfotipo Crepe destacou-se como morfotipo com maior capacidade de resposta aos estresses testados. Esse morfotipo apresentou menor decréscimo no volume celular sob estresse osmótico e aumento de quitina e manana na parede celular. Sob estresse prolongado HOG1 manteve alta expressão nesse morfotipo (49.07). Sob estresse oxidativo Crepe teve alta expressão de todos os genes testados. Hemócitos e macrófagos apresentaram mesmo perfil de fagocitose. Crepe foi mais fagocitado que Parental, no entanto, houve redução no número de células do morfotipo fagocitadas após pré-exposição ao H2O2. Crepe apresentou alta capacidade de formação de hifas verdadeiras em co-cultivo com os fagócitos. A pré-exposição ao H2O2 promoveu regulação positiva de WOR1 e HOG1 em Crepe (49.07). Células de Crepe pré expostas apresentaram maior quantidade de quitina (100.10) e maior porosidade (ambos os sistemas) que o parental. O presente trabalho pode concluir que switching fenotípico promove alteração do fitness celular e consequentemente resposta alterada aos estresses osmótico e oxidativo em C. tropicalis, refletidas na regulação gênica, alterações da parede celular e na capacidade de morfogênese.Item Abordagem polifásica na taxonomia, filogenia e eficiência da fixação biológica do nitrogênio de rizóbios simbiontes de feijoeiroCardoso, Juscélio Donizete; Hungria, Mariangela [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Silva, Krisle da; Nogueira, Marco Antonio; Andrade, Diva Souza [Coorientadora]Resumo: O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L) é uma leguminosa com baixa especificidade em nodular com uma variedade de estirpes de rizóbios, os quais muitas vezes têm baixa efetividade na fixação de nitrogênio O objetivo geral desta tese foi o de estudar a eficiência simbiótica e a filogenia de um grupo elite de estirpes de rizóbios, microssimbiontes do feijoeiro, utilizando uma abordagem polifásica Avaliaram-se a eficiência simbiótica, características fenotípicas e genotípicas de estirpes de rizóbios isoladas de sementes, nódulos de feijoeiro, nódulos de amendoinzeiro (Arachis hypogaea L) e mucuna anã (Mucuna pruriens) cultivadas em solos de diversos agroecossistemas Quarenta e cinco estirpes elite foram analisadas quanto às propriedades simbióticas (nodulação, massa da parte aérea seca, N- total na parte aérea, porcentagem de N-ureído da seiva do xilema) em casa de vegetação, em vasos contendo solo arenoso não estéril cultivado com feijoeiro As estirpes elite também foram caracterizadas em relação às propriedades morfo-fisiológicas, perfis genéticos de rep-PCR (BOX) e polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP – Restriction Fragment of Length Polymorphism) do gene 16S rRNA, utilizando-se quatro enzimas de restrição Na análise parcial das sequências do 16S rRNA, foram utilizadas 17 estirpes representantes obtidas dos principais grupos resultantes das análises anteriores A estirpe mais eficiente foi a IPR-Pv268, que agrupou com Rhizobium sp, enquanto a IPR-Pv583, mostrando menor eficácia na fixação do N2 foi agrupada com Herbaspirillum lusitanum Estirpes 2 eficientes foram agrupadas com espécies simbióticas e gêneros pouco comuns entre simbióticos, incluindo Leifsonia xyli, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia e Enterobacter As seis estirpes que apresentaram dissimilaridade do gene 16S RNA do gênero Rhizobium foram submetidas às análises do MLSA (Multilocus Sequence Analyses) e do gene nifH Os índices de diversidade (Shannon), com base nas características fenótipicas (eficiência simbiótica, morfo-fisiológicas) e genéticas (BOX-PCR, RFLP do 16S rRNA e sequências do gene 16S rRNAs), calculados em função do número de grupos e de estirpes em cada grupo, apresentaram valores de 1,5 e 1,47, respectivamente Algumas estirpes utilizadas neste estudo se destacaram quanto à sua capacidade de fixação de nitrogênio e, portanto, mostraram alto potencial biotecnológico para a utilização em inoculantes comerciaisItem Aderência in vitro de isolados bucais de Candida albicans em diferentes materiais dentáriosCamacho, Daiane Pereira; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Silva, Cléverson de Oliveira e; Panagio, Luciano Aparecido; Almeida, Ricardo Sérgio Couto deResumo: Atualmente, diferentes técnicas e materiais têm sido empregados para reabilitação bucal por meio de próteses dentárias ou implantes A aderência inicial e a colonização por micro-organismos às superfícies rígidas como implante é um pré-requisito para a formação do biofilme que pode ocasionar infecções bucais O papel da levedura Candida albicans na patogênese de lesão peri-implantar está associado a sua característica de micro-organismo oportunista Sua transição de comensal para agente infeccioso depende tanto de fatores de virulência da levedura como da susceptibilidade do hospedeiro Entretanto, os processos biológicos que podem levar à falha dos implantes após a confecção das próteses ainda são pouco compreendidos Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo avaliar a aderência in vitro de isolados bucais de Candida albicans em diferentes materiais dentários, diferenciação celular ao nível ultraestrutural, determinar a produção de biofilme e o padrão de expressão de genes ALS Foram utilizados seis isolados clínicos e uma cepa padrão Candida albicans para a avaliação do perfil de aderência e a diferenciação celular dos isolados sobre a superfície de diferentes materiais dentários, produção de biofilme, bem como o padrão de expressão de genes da família ALS Os isolados avaliados apresentam eficiência quanto à formação de biofilme Todos os isolados apresentaram elevado potencial de aderência aos materiais confeccionados em resina composta microhíbridra com nanopartículas e liga metálica de Níquel-Cromo, enquanto que os menores valores de aderência foram observados nos materiais em porcelana feldspática e resinas acrílicas Observou-se uma diversidade no padrão de aderência e diferenciação celular, entre os isolados, de forma isolado-dependente Os isolados foram classificados conforme o perfil de adesão às superfícies dos materiais, seguindo quatro variações sendo estas: aderência difusa, localizada, agregativa e pseudo-hifal As maiores taxas de aderência dos isolados bucais de Candida albicans foram relacionadas principalmente às superfícies hidrofóbicas Foi observado um padrão complexo de expressão de genes da família ALS por isolados em modelo de aderência in vitro em diferentes materiais dentários Considerando os isolados individualmente, os transcritos mais frequentes em células aderidas aos diferentes materiais avaliados foram dos genes ALS1, ALS2 A indução de determinados genes ALS, no nosso caso ALS1 e ALS4, em função do material no qual o isolado estava aderido foi isolado-dependente; já a repressão de genes ALS7 e ALS9 parece ser dependente do material dentário, uma vez que em determinados tipos de materiais nenhum dos seis isolados analisados produziram transcritos relacionados as adesinas Als7 e Als9 Os resultados obtidos no presente estudo confirmam o potencial de aderência e consequente formação de biofilme por Candida albicans de origem bucal Entretanto a variação no padrão de expressão dos genes ALS nos diferentes materiais testados ocorreu de forma isolado- dependente Desta forma, nossos dados podem contribuir para o entendimento do processo da peri-implantite, corroborando com seu caráter multifatorial, sugerindo que este processo é dependente do material dentário utilizado nos implantes, bem como da capacidade do micro-organismo em desenvolver a infecção, via expressão diferenciada de genes associados a patogêneseItem Caracterização genotípica e fenotípica de isolados clínicos de Proteus mirabilis de pacientes do Hospital Universitário de LondrinaWaldrich, Taynara de Lacqua; Rocha, Sérgio Paulo Dejato da [Orientador]; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Faccin-Galhardi, Ligia Carla; Vespero, Eliana CarolinaResumo: O gênero Proteus é causador de diferentes infecções hospitalares, como: infecções no trato respiratório, feridas, olhos, nariz, garganta, pele e gastroenterite Dentre as espécies deste gênero, Proteus mirabilis é a mais prevalente em infecções em humanos, principalmente as do trato urinário Este trabalho objetivou investigar a ocorrência e a diversidade de P mirabilis isolados de diversas infecções em humanos, já que há pouco conhecimento sobre a epidemiologia e o genoma deste patógeno em isolados que não são de fonte urinária Deste modo, foram realizados 3 estudos, sendo o primeiro com análise genômica de um isolado de secreção traqueal – Este é o primeiro estudo de isolado de secreção traqueal que foi sequenciado A cepa Proteus mirabilis LBUELH-11 tem 3973423 bp e 9913% de similaridade com Proteus mirabilis PM5226 e 996% com Proteus mirabilis AR155, sugerindo pela análise filogenética que LBUELH-11 é P mirabilis O segundo estudo, com base em dados epidemiológicos da resistência de Proteus mirabilis e no terceiro estudo, foram analisadas 68 cepas de P mirabilis atendidos no Hospital Universitário de Londrina Quanto ao perfil genotípico e fenotípico, constatou-se a presença do gene hpmA em 975% dos isolados de origem urinária e em 1% dos isolados de outras fontes de infecção, pmfA em 975% dos isolados de origem urinária e 1% dos isolados de outras fontes de infecção, ucaA em 8235% dos isolados de origem urinária e em 8529% dos isolados de outras fontes de infecção, zapA está presente em 9411% dos isolados de origem urinária e em 8823% dos isolados de outras fontes de infecção, mrpA está presente em 1% dos isolados de origem urinária e em 975% dos isolados de outras fontes de infecção Os genes hlyA e fimH não foram encontrados em nenhum dos isolados e os genes atfA e ureA estão presentes em 1% deles Todos os microrganismos analisados apresentaram forte capacidade em formar biofilme No teste de adesão, 1% dos isolados de fonte urinária foram capazes de formar adesão agregativa (AA); já nos isolados de outras fontes de infecção, 1765% não foram aderentes (NA) e 8235% foram capazes de formar adesão agregativa (AA) O patógeno apresentou resistência à maioria dos fármacos testados, principalmente à ceftriaxona Portanto, pode-se inferir que houve diferenças genotípicas e fenotípicas entre os isolados de Proteus mirabilis, sejam ele de fonte urinária ou não urináriaItem Switching fenotípico em C. tropicalis : caracterização ultraestrutural de colônias e associação com virulênciaMoralez, Alane Tatiana Pereira; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Negri, Melyssa Fernanda Norman; Furlaneto-Maia, Luciana; Almeida, Ricardo Sérgio Couto deResumo: Candida tropicalis é um patógeno humano associado a altas taxas de mortalidade O switching fenotípico é um importante fator de virulência desta espécie Este estudo foi realizado para avaliar, primeiramente, o efeito do switching fenotípico em C tropicalis quanto a dano celular em células FaDu e virulência em Galleria mellonella Para isso foram utilizados o isolado 497 e seus variantes e revertentes derivados de switching O variante crepe e seu revertente promoveram maior dano celular em células FaDu comparativamente ao do isolado parental Variantes de switching apresentaram virulência distinta em G mellonella Larvas infectadas com o variante crepe tiveram morte mais rápida comparada às larvas infectadas com o isolado parental Além disso, a carga fúngica foi 6,1 superior em larvas infectadas com o variante crepe comparada a de larvas infectadas com o parental O variante rugoso foi o menos virulento comparado ao parental Além disso, foi avaliado o efeito do switching na formação de biofilme, e verificadas a filamentação e a virulência em larvas de G mellonella por células planctônicas e sésseis recuperadas de biofilmes formados por morfotipos distintos O efeito do switching na formação de biofilme foi variável entre os sistemas de switching testados Células sésseis foram mais filamentosas do que células planctônicas para o revertente de crepe (497) Filamentação entre células sésseis do variante rugoso (497) foi maior comparativamente a do seu respectivo parental Virulência foi superior para larvas infectadas com células sésseis comparativamente à células planctônicas obtidas do revertente de crepe (isolado 497) e do isolado parental (isolado 711) Diferentemente, células planctônicas do variante enrugado (711) foram mais virulentas que células sésseis Células sésseis do variante crepe, e revertentes de crepe e enrugado apresentaram virulência superior à do seu respectivo isolado parental Por fim, colônias de padrões morfológicos liso e estruturado foram caracterizadas quanto a ultraestrutura e composição de matriz extracelular (carboidratos e proteínas) O variante rugoso (isolado 497) exibiu níveis superiores de ambos componentes do que seu respectivo parental Colônias de padrão estrutural liso do isolado 11 apresentaram quantidades superiores de carboidratos e proteínas, comparadas a colônias de mesmo fenótipo do isolado 497 Diferenças significativas foram observadas entre os níveis de carboidratos comparando os variantes crepes de ambos isolados Concluindo, foi demonstrado que o switching fenotípico tem efeito na virulência e em fatores de virulência de C tropicalis Este estudo relatou pela primeira vez a ocorrência de switching durante a infecção em G mellonella Pela primeira vez foi comparada a virulência de células sésseis e planctônicas a partir de biofilmes formados por isolados de switching fenotípico e avaliada a composição de matriz extracelular de colônias switchingItem Produção de metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa cepa LV : otimização das condições de cultura através da metodologia de superfície de respostaBedoya Pérez, Juan Carlos; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Viana, Renato Márcio Ribeiro; Celligoi, Maria Antonia Pedrine Colabone; Melo, Marcelo Rodrigues de; Scarminio, Ieda Spacino; Oliveira Júnior, Admilton Gonçalves de [Coorientador]Resumo: Pseudomonas aeruginosa cepa LV produz em seu metabolismo secundário fenazina-1-ácido carboxílica (PCA), fenazina-1-carboxiamida (PCN), 2-carboxi-2-heptano-indol-3-ona (IDC) e um composto antibiótico organometálico (OAC), que demonstrou ter atividade antimicrobiana (PCA e OAC) e efeito elicitor que estimula a indução de resistência adquirida (SAR) em plantas (PCN e IDC) Estes metabólitos possuem um alto potencial para serem usados nos mais diferentes setores biotecnológicos Porém os rendimentos são baixos e são necessários estudos para otimizar os processos de produção tornando menos custosos e mais produtivos Portanto, o objetivo deste trabalho foi aumentar a concentração final desses metabólitos através da otimização das condições de cultura analisadas pela metodologia de superfície de resposta (MSR) Primeiramente, fatores experimentais únicos foram utilizados para avaliar os efeitos tanto do tamanho do inoculo quanto dos três componentes utilizados no meio de cultivo (peptona, extrato de carne e CuCl22H2O) na produção final dos metabólitos Em seguida, o nível ótimo das variáveis foi determinado pela MSR utilizando o planejamento de Box-Behnken Nesta etapa, as maiores concentrações de IDC, PCA, PCN e OAC representaram um aumento, em porcentagem, de 269, 62, 5286 e 84, respectivamente, em comparação com o meio de cultura básico (MCB) Posteriormente, a concentração inibitória mínima (CIM) de OAC contra a cepa LV foi estimada em 15 µg mL-1, indicando que a concentração obtida (11,11 ± 1,5 mg L-1) era provavelmente a máxima possível Em uma segunda etapa, foi utilizada uma abordagem estatística de quatro passos para avaliar o efeito de nove componentes diferentes de meio de cultura (peptona, extrato de carne, proteína de soja, extrato de levedura, glicose, etanol, solução salina, KH2PO4 e triptofano) e dois parâmetros físicos (temperatura e pH inicial), sobre os rendimentos de IDC, PCA e PCN Dois planejamentos fatoriais sucessivos foram aplicados para investigar os fatores que afetam a produção dos metabólitos de interesse Após essa análise, a proteína de soja, a glicose, o extrato de levedura e o KH2PO4 foram otimizados por MSR usando um delineamento composto central (CCD) Além disso, um dos meios otimizados foi utilizado para determinar as condições adequadas de temperatura e pH inicial empregando um delineamento fatorial completo de três níveis Estabelecidas as condições ótimas, as concentrações máximas registradas de IDC, PCA e PCN foram 15,61, 112,89 e 177,31 mg L-1, respectivamente Em conclusão, em condições otimizadas, a produção de IDC, PCA e PCN aumentaram em 42, 38 e 25 vezes, respectivamente, em relação ao sistema de produção Portanto, essas novas condições de produção devem ser implementadasItem Caracterização de Escherichia coli produtora de ESBL e AmpC de amostras clínicas humanas e de carcaças de frangoKoga, Vanessa Lumi; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama [Orientador]; Nakazato, Gerson; Vespero, Eliana Carolina; Perugini, Marcia Regina Eches; Brito, Benito Guimarães deResumo: A emergência de bactérias produtoras de betalactamases de espectro estendido (ESBL) e/ ou AmpC em humanos e nas carnes de origem animal tem criado uma grande preocupação quanto à possibilidade de transmissão da resistência aos antimicrobianos por meio da cadeia alimentar O objetivo do nosso trabalho foi estudar amostras de Escherichia coli produtoras de ESBL e AmpC mediadas por plasmídios (pAmpC), isoladas da carcaça de frango e da clínica humana na cidade de Londrina, e estes foram analisados quanto ao perfil de resistência antimicrobiana, virulência e relação clonal O primeiro estudo refere-se às amostras de E coli produtoras de ESBL isoladas de infecção do trato urinário (ITU) e de carcaças de frango Entre as amostras isoladas de ITU, identificamos genes de ESBL, como blaCTX-M-2, blaCTX-M-3, blaCTX-M-8, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-27, enquanto que nas amostras de carcaças de frango identificamos blaCTX-M-1, blaCTX-M-2 e blaCTX-M-8 As amostras apresentaram fatores de virulência associados a E coli patogênica aviária (APEC) (931% em ITUs e 7143% em carcaças de frango) e ilhas de patogenicidade (524% em ITUs e 31% em carcaças de frango) Por meio do “Pulsed Field Gel Electrophoresis” (PFGE) e do “Multilocus Sequence Typing” (MLST), nossos resultados demonstraram uma alta diversidade de cepas entre ambos os grupos de amostras O segundo estudo refere-se às amostras produtoras de pAmpC isoladas de carcaças de frango e amostras clínicas humanas Nesse trabalho, todas as amostras apresentaram o gene blaCMY-2, e foram consideradas multirresistentes A maioria das amostras (7143%) estavam associadas a sequência de inserção ISEcp1 Por meio do MLST, 11 “Sequence types” foram identificados, sendo apenas o ST354 encontrado em ambos os grupos de amostras PFGE demonstrou uma alta diversidade entre as amostras clínicas com as amostras de frango Nossos trabalhos demonstraram uma alta diversidade bacteriana entre as amostras clínicas com as isoladas de carcaças de frango No entanto, a presença de fatores de virulência e genes de resistência, associados a infecções humanas, nas amostras isoladas de carne de frango representam um potencial zoonótico ao homemItem Baixa dose de concanavalina-A aumenta a imunidade inata e previne injúria no fígado em camundongos infectados com candida albicansCosta, Ivete Conchon; Felipe, Ionice [Orientador]; Saridakis, Halha Ostrensky; Pelayo, Jacinta Sanchez; Pinge Filho, Phileno; Svidzinski, Terezinha Inez EstivaletResumo: Candida albicans causa infecções desde mucocutâneas à sistêmicas, dependendo das condições imunológicas do hospedeiro Vários fatores de virulência contribuem para a patogenicidade, como as aspartil proteinases e fosfolipases, as quais degradam queratina, colágeno, lactoferrina, imunoglobulinas, componentes do complemento, além de membranas celulares, possibilitando sua disseminação e colonização As adesinas são essenciais por permitirem a aderência a células epiteliais e endoteliais e a morfogênese que consiste na ransição reversível entre leveduras e formas filamentosas Macrófagos e neutrófilos são extremamente importantes na defesa não específica, mas a sinalização de ativação ou desativação dos mecanismos fungicidas são mediadas por células Th1 e Th2 dependentes da reposta imune do hospedeiro Os mecanismos através dos quais C albicans é reconhecida pelas células imunes e como é ativada a defesa do hospedeiro não são completamente elucidadas Neste estudo, avaliamos o efeito da Concanavalina-A (Con-A) na eliminação de C albicans em camundongos infectados e a produção da citocina pró-inflamatória TNF-a Grupos de 5 animais foram pré-tratados com Con-A (25 µg/ml PBS) e após 96 horas foram infectados intraperitonealmente com 17 células de C albicans CR15 (um isolado de paciente HIV+); 3 minutos, 2, 6, 24, 72 horas após a infecção os camundongos foram mortos A fagocitose de C albicans por macrófagos peritoneais foi maior 3 minutos após a infecção nos camundongos prétratados com Con A O fígado apresentou o maior número de unidades formadoras de colônia, e este número foi reduzido pelo tratamento com Con-A Animais controle infectados com C albicans apresentaram significante aumento de alanina aminotrasnferase plasmática, o que não foi observado em camundongos pré-tratados com Con-A Após duas horas de infecção a produção de TNF-a no fígado de animais pré-tratados com Con-A foi significativamente aumentada Estes resultados sugerem que uma única dose de Con-A causou uma ação moduladora benéfica na resposta inflamatória durante a infecção com C albicansItem Pesquisa de fatores de virulência de Escherichia coli patogênica extraintestinal (ExPEC) em amostras de águas de consumo no município de Londrina - ParanáLopes, Angélica Marim; Pelayo, Jacinta Sanchez [Orientador]; Vespero, Eliana Carolina; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Burgos, Tatiane das Neves; Rechenchoski, Daniele ZendriniResumo: A contaminação de água e alimentos com bactérias fecais permanece um problema comum e persistente, impactando a saúde pública e econômica do mundo todo Dessa forma, a água é considerada um importante meio de transmissão de enfermidades ao ser humano e animais, sendo a Escherichia coli de grande importância, especialmente o grupo de E coli patogênica extraintestinal (ExPEC) A capacidade deste grupo de causar infecções nos homens e nos animais, está associada a presença de diferentes fatores de virulência que as caracterizam como patogênicas Diante disso, fez-se a necessidade de realizar uma pesquisa, a fim de verificar se a água é uma fonte potencial de ExPEC, através de marcadores moleculares específicos para identificação deste grupo Os genes de virulência de ExPEC pesquisados neste estudo foram determinados utilizando a técnica da PCR O ensaio de aderência em células HEp-2 e biofilme foi realizado em todas as amostras que apresentaram algum gene característico de ExPEC Das 75 amostras de água coletadas 25 (33,3%) estavam contaminadas com E coli Do total de 25 amostras, 75,2% apresentaram algum gene relacionado a ExPEC, sendo que 17,5% foram positivas para os fatores de virulência que caracterizam APEC (iutA, iroN, hlyF, iss e ompT) Os genes mais prevalentes foram fimH e fyuA, sendo identificados em 62,8% e 59,8% dos isolados, respectivamente Os genes iutA e traT também apresentaram alta frequência, sendo detectados em 57,4% e 52,1% dos isolados, respectivamente Os genes iroN, papC, papG, ompT, ibeA, iss, sitA, hlyF, cnf1 e cnf2 foram encontrados com frequência menor que 2% O hlyA e sfa/focDE foram os genes menos prevalentes neste estudo, ambos detectados em apenas 5,3% dos isolados, seguidos pelo gene tsh (1,2%) Não foram detectados os genes afa/draBC e kpsMT K1 Na análise filogenética as amostras pesquisadas pertenceram principalmente ao filogrupo B2 Entre os padrões de adesão pesquisados em cultura de células HEP-2 o padrão agregativo foi predominante nestas amostras No teste de formação de biofilme as amostras positivas para ExPEC foram classificadas em dois grupos com base em seus valores de absorbância: grupo 1 (OD 57 > ,2) 142 amostras e grupo 2 (OD 57 = ,2) com 46 amostras Assim, foi possível demonstrar que ExPEC são patógenos importantes na contaminação da água para consumo humano e compreender melhor as implicações que esse reservatório pode trazer para a saúde pública e por meio desses resultados melhorar a qualidade microbiológica da águaItem Taxonomia bacteriana na era genômica e a descrição de dez novas espécies de BradyrhizobiumKlepa, Milena Serenato; Hungria, Mariangela [Orientador]; Batista, Jesiane Stefânia da Silva; Nogueira, Marco Antonio; Ribeiro, Renan Augusto; Helene, Luisa Caroline FerrazResumo: Os rizóbios são bactérias amplamente difundidas nos solos e contribuem significativamente para o aporte de nitrogênio em ambientes naturais e agrícolas pela simbiose com plantas leguminosas No entanto, a magnitude da diversidade desses microrganismos, juntamente com suas propriedades metabólicas e evolutivas, ainda está longe de ser totalmente decifrada Identificar, classificar e nomear bactérias seguindo critérios específicos é tarefa da taxonomia, uma ciência que é realizada desde a década de 187, mas que tem sido revolucionada com o progresso tecnológico Os objetivos deste trabalho foram estudar como a taxonomia bacteriana evoluiu e as implicações na taxonomia de rizóbios, além da descrição de dez novas espécies de Bradyhrizobium, um gênero amplamente conhecido pela interação bem-sucedida com a soja, além de várias outras espécies de leguminosas, particularmente nos trópicos O capítulo I se refere a uma revisão bibliográfica na qual são detalhados os caminhos que a taxonomia bacteriana percorreu até chegar à era genômica São abordados ainda os requisitos necessários para a descrição de novas espécies bacterianas, desde as técnicas comumente utilizadas, até as regras estabelecidas por comitês de taxonomia bacteriana Para finalizar, analisa-se como isso impactou no número de espécies bacterianas e na compreensão da diversidade e evolução dos rizóbios Os capítulos II, III e IV envolvem a descrição de dez novas espécies de Bradyrhizobium, nomeadas como B archetypum, B australiense, B murdochi, B agreste, B diversitatis, B glycinis, B australafricanum, B cenepequi, B hereditatis e B semiaridum, as quais foram isoladas de nódulos radiculares de leguminosas da Austrália e da África do Sul As estirpes estudadas foram diferenciadas das demais espécies do gênero por uma abordagem polifásica, incluindo aspectos filogenéticos, genômicos e fenotípicos Além disso, foi possível identificar a existência de três novos simbiovares no gênero, grupos de estirpes que podem se assemelhar por filogenia de genes simbióticos ou planta hospedeira, os quais foram nomeados como sv cenepequi, sv glycinis, e sv cajani, de acordo com o nome da espécie da estirpe que ocupava a posição central no ramo da filogenia dos genes de nodulação nodC e de fixação de nitrogênio nifH O primeiro capítulo revela a importância da taxonomia bacteriana como uma ciência colaborativa e dinâmica, que vem sendo alterada com o passar do tempo Além disso, a reunião de informações acerca da taxonomia bacteriana e descrição de novas espécies podem servir como um guia para microbiologistas e taxonomistas Os resultados obtidos nos capítulos II, III e IV, contribuem com informações sobre a diversidade do gênero Bradyrhizobium, mais especificamente, sobre aspectos metabólicos, evolutivos e genômicos Destaca-se a importância de tais estudos na microbiologia do solo para a compreensão de quem são os habitantes do solo, a sua variabilidade genética, seus aspectos evolutivos e quais interações realizam, de modo a revelar estirpes que possam ser exploradas biotecnologicamenteItem Atividade antibacteriana de nanopartículas de prata associadas ao eugenolBodnar, Giovana Carolina; Nakazato, Gerson [Orientador]; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Panagio, Luciano Aparecido; Perugini, Marcia Regina Eches; Campos, Anna Carolina Leonelli Pires deResumo: Bactérias multirresistentes representam um grande problema que desafiam a saúde pública em encontrar estratégias utilizando os antimicrobianos atuais disponíveis no mercado para combater estas infecções Por outro lado, o desenvolvimento de novos fármacos não ocorre no mesmo ritmo dos mecanismos de resistência desenvolvidos pelas bactérias A resistência aos antimicrobianos não é apenas um problema da área clínica No setor de alimentos diversos patógenos humanos vêm adquirindo resistência aos desinfetantes utilizados na indústria alimentícia Sendo assim, pesquisadores buscam por novas substâncias antimicrobianas que podem auxiliar no tratamento das infecções multirresistentes pelo desenvolvimento de alternativas aos antibióticos e aos desinfetantes disponíveis Os produtos naturais e a associação de compostos tornaram-se um importante campo de pesquisa para descoberta de novos antimicrobianos O objetivo desta pesquisa foi avaliar a atividade antibacteriana de nanopartículas de prata biologicamente sintetizada pelo fungo Fusarium oxysporum em associação ao eugenol Eugenol e bio-AgNP demonstraram efeito bactericida, com concentração inibitória mínima (MIC) entre 12 a 2% (v/v) e 394 a 63 µM, respectivamente; e todos os isolados clínicos de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) analisados foram sensíveis aos compostos Para a curva de crescimento e morte, eugenol agiu em menos de 2 h, enquanto as nanopartículas levaram de 5 a 1 h para eliminar totalmente as bactérias Gram-negativas e 24 h para as Gram-positivas O efeito sinérgico ou aditivo foi observado quando os compostos foram combinados, com redução dos valores de MIC, para ½ MIC, 1/3 MIC ou até mesmo ¼ MIC, o que melhorou o tempo de ação da bio-AgNP comparado ao uso em isolado A Microscopia Eletrônica de Varredura demonstrou alterações morfológicas celulares após os tratamentos com os compostos em isolado ou em combinação No ensaio de biofilme, a combinação dos compostos reduziu em 5-log o número de células As bio-AgNP associadas ao eugenol, composto derivado do óleo de cravo, são alternativas antimicrobianas que neste estudo demonstraram um importante papel contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo também cepas multirresistentes, além de atuar contra o biofilme formado por estas bactérias Sendo assim, podem ser uma estratégia alternativa para o controle de infecções, e apresentam um potencial não somente na área clínica/hospitalar, mas também aplicação na indústriaItem Ação antibacteriana de enterocinas produzidas por espécies de Enterococcus sobre células planctônicas e biofilmesRocha, Kátia Real; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Costa, Giselle Aparecida Nobre; França, Emanuele Júlio Galvão de; Rocha, Sérgio Paulo Dejato da; Panagio, Luciano Aparecido; Furla Neto-Maia, Luciana [Coorientadora]Resumo: Enterocococcus spp pertencem ao grupo bactérias ácido láticas produtoras de bacteriocinas (enterocinas) que apresentam atividade contra várias bactérias patogênicas de origem alimentar Este estudo foi realizado primeiramente para selecionar enterococos produtores de enterocinas contra Listeria innocua 12612, bem como seu espectro de ação contra outras bactérias oportunistas e em seguida avaliar a influência de suas enterocinas em biofilme bacteriano Para tal, os isolados potencialmente produtores de enterocinas (Ent+) contra L innocua 12612 foram caracterizados quanto a presença de genes estruturais para enterocinas e produção de componente hemolítico Em seguida foi obtido o sobrenadante de cultivo livre de células (CFS) dos Ent+, para avaliar sua ação contra L innocua 12612 por método de disco-difusão, após tratamento com calor (8°C e 1°C), enzimas proteolíticas (a- quimiotripsina, protease e tripsina), resistência a catalase, quantificação da atividade antibacteriana do CFS e do CFS parcialmente purificado por unidade arbitrária (UA), bem como determinar seu respectivo modo de ação e espectro antibacteriano contra outras bactérias Dos 76 enterococos de diferentes fontes, 11 foram considerados Ent+ (5 isolados provenientes de alimentos e 6 de ambiente), além disso 9 destes apresentavam ao menos um gene codificador de enterocina, entA, entB, entP, ent171 e/ou entX Não houve isolados com atividade hemolítica Após a obtenção dos CFS 7/11 dos isolados Ent+ (5 de alimentos e 2 de ambientes) apresentaram halo de inibição contra L innocua Esses 7 CFS foram termoestáveis, de natureza proteica e a ação antibacteriana por peróxido de hidrogênio foi descartada pela utilização de catalase, indicando a ação antagônica pela presença de enterocina Ao concentrar a enterocina (CFS parcialmente purificado) os valores de UA tenderam a aumentar O modo de ação observado foi bactericida A ativididade antagônica dos 7 CFS contendo enterocina contra outras 33 bactérias indicadoras ocorreu principalmente em L innocua, Listeria monocytogenes e Listeria ivanovii Os CFS que apresentaram maiores valores de UA e espectro de ação foram os provenientes de alimentos, provavelmente isso possa estar relacionada com a maior quantidade de genes codificadores de enterocinas por parte desses isolados Além disso, foram selecionados 4 CFS provenientes de alimentos para avaliar sua atividade anti-biofilme de Listeria spp, no desenvolvimento e após a pré- formação do biofilme por 24h a 3°C e 37°C O biofilme foi formado em superfícies abiótica e avaliado por biomassa total (cristal violeta), atividade metabólica (redução de XTT) e microscopio de fluorescência (com marcador de célula morta utilizando iodeto de propidio) Para tal, 8 Listeria spp foram avaliadas quanto a formação de biofime por biomassa total Dessas foram selecionados 3 Listeria spp (Listeria monocytogenes 232, Listeria ivanovii 256 e Listeria innocua 25) para serem submetidas ao tratamento com os CFS Os resultados mostraram que houve atividade anti-biofilme das Listeria spp, por parte de todos os CFS avaliados (desenvolvimento e no biofilme pré-formado), em ambas temperaturas avaliadas De uma maneira geral, a atividade anti-biofilme listerial provocadas pelos CFS, foi acompanhada por uma menor atividade metabólica, bem como redução da estrutura do biofilme e maior quantidade de células mortas nas imagens obtidas, quando comparado com o controle Concluindo, com base nos esforços consideráveis para a busca por novas bacteriocinas para serem aplicadas na área alimentícia principalmente contra Listeria, um importante patógeno alimentar, tem que os enterococos aqui avaliados apresentam-se como potenciais candidatos no controle de bactérias patogênicas sejam em células planctônicas ou sésseisItem Taxonomia e filogenia molecular de rizóbios microssimbiontes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)Ribeiro, Renan Augusto; Cunha, Mariangela Hungria da [Orientador]; Pavanelli, Pâmela Menna Pereira; Nogueira, Marco Antônio; Andrade, Diva de Souza; Barcellos, Fernando GomesResumo: O feijão comum (Phaseolus vulgaris L) é uma leguminosa que foi originalmente domesticada nas Américas Central e do Sul Os rizóbios são bactérias que vivem em simbiose com algumas leguminosas, resultando em um complexo processo denominado fixação biológica de nitrogênio Apesar da alta diversidade procariótica presente no solo, o grande desafio consiste em identificar e classificar um número cada vez maior de microrganismos, de modo que se consiga extrair ao máximo o potencial tecnológico dessas bactérias em favor de um incremento no rendimento das culturas e na sustentabilidade da agricultura Os estudos taxonômicos possuem um papel fundamental para a classificação dessa biodiversidade Atualmente, a filogenia dos procariotos é baseada principalmente no gene 16S RNAr, embora alguns estudos tenham demonstrado que os genes ribossomais podem, ocasionalmente, sofrer transferência horizontal e recombinação genética, fazendo com que os resultados nem sempre possam refletir a verdadeira filogenia procariótica Além disso, o gene 16S RNAr apresenta um nível elevado de conservação, dificultando a identificação e classificação taxonômica para grupos de microrganismos intimamente relacionados Com isso, a técnica de MLSA (Multilocus Sequencing Analysis), que consiste na análise concatenada de pelo menos cinco genes conservados e que estejam presentes em todos os organismos em análise, vem sendo empregada para conferir maior confiabilidade a estudos taxonômicos e de filogenia No primeiro trabalho desta tese foi realizado um estudo polifásico, incluindo caracterização morfo-fisiológica, genética por rep-PCR e MLSA e hibridização DNA-DNA, com o objetivo de reclassificar as estirpes hoje denominadas como R tropici tipo A, em um nova espécie, R leucaenae, sendo a estirpe CFN 299T proposta como estirpe tipo da nova espécie No segundo trabalho, foram utilizadas quinze estirpes de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro provenientes do México, Equador e Brasil, com o objetivo de correlacioná-las taxonomicamente e filogeneticamente, através da técnica de MLSA As análises dos cinco genes (recA, rpoA, gltA, glnII, gyrB), além do 16S RNAr indicaram a formação de três grupos principais envolvendo essas estirpes Oito estirpes ficaram agrupadas com R etli e R leguminosarum, que por serem duas espécies intimamente relacionadas evolutivamente, só foram claramente separadas e identificadas na árvore concatenada com os cinco genes Três estirpes agruparam com R tropici, com nítida separação entre os tipos A (agora proposto como R leucaenae) e B, principalmente na árvore concatenada Outras quatro estirpes foram posicionadas no grupo de R radiobacter, mas pela grande distância evolutiva apresentada, podem ser representantes de uma nova espécie Em ambos os trabalhos a técnica de MLSA demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação precisa e consistente quando comparada à utilização de apenas um gene, principalmente dentro do grupo dos rizóbiosItem Análise polifásica de estirpes de Bradyrhizobium e descrição de novas espéciesDelamuta, Jakeline Renata Marçon; Hungria, Mariangela [Orientador]; Zilli, Jerri Édson; Gomes, Douglas Fabiano; Ribeiro, Renan Augusto; Barcellos, Fernando GomesResumo: O Brasil sobressai no cenário agrícola por ser um grande produtor de diversas culturas de importância econômica, como por exemplo, a soja (Glycine max) Atualmente, tem-se buscado incrementar a produtividade das culturas, mas o manejo inadequado dos solos e das culturas pode limitar a qualidade dos solos e a sustentabilidade agropecuária A fixação biológica de nitrogênio, realizada por bactérias diazotróficas conhecidas de modo geral como rizóbios, em simbiose com plantas leguminosas, destaca-se como uma importante prática na sustentabilidade agrícola, mas estima-se que a diversidade dessas bactérias ainda é pouco conhecida A técnica polifásica, utilizada hoje na taxonomia e sistemática dos procariotos, engloba informações genotípicas, fenotípicas e filogenéticas para garantir uma classificação apropriada dos microrganismos A essas informações deve-se destacar o incremento, na última década, na incorporação de dados de sequências genômicas e os avanços computacionais para analisar tais sequências, proporcionando uma verdadeira revolução nos estudos taxonômicos e filogenéticos de procariotos Neste trabalho, foram conduzidos estudos polifásicos, incluindo a análise genômica, em grupos de estirpes de Bradyrhizobium com forte indicativo de representarem novas espécies O primeiro estudo englobou duas estirpes, CNPSo 1112 e CNPSo 2833, microssimbiontes de soja perene (Neonotonia wightii) e desmodium (Desmodium heterocarpon), inicialmente relacionadas às espécies Bradyrhizobium elkanii e Bradyrhizobium pachyrhizi, respectivamente A análise polifásica dos dados morfofisiológicos, genotípicos e genômicos suportam a proposta de duas novas espécies, para as quais estão sendo propostos os nomes Bradyrhizobium tropiciagri sp nov (CNPSo 1112) e Bradyrhizobium embrapense sp nov (CNPSo 2833) No segundo estudo, diferenças genéticas (rep-PCR, hibridação DNADNA), genômicas (identidade média de nucleotídeos, conteúdo C+G), fenotípicas (testes morfofisiológicos e perfil de ácidos graxos) e filogenéticas (análise do gene 16S RNAr e multilocus sequence analysis - MLSA) revelaram que um grupo representado por quatro estirpes relevantes para a agricultura e simbiontes de soja, classificadas como Bradyrhizobium japonicum grupo Ia deveriam ser reclassificadas na nova espécie Bradyrhizobium diazoefficiens, sendo a estirpe USDA 11 eleita como estirpe tipo Os resultados obtidos contribuem para o maior conhecimento da diversidade de rizóbios, com ênfase no gênero Bradyrhizobium, que aparentemente representa a maior porcentagem de rizóbios nos trópicos Também houve grande aporte de conhecimento sobre a aplicação da genômica em estudos de sistemática procarióticaItem Combinação de nanopartículas de prata biogênicas e derivados do Origanum vulgare (Orégano) no combate a bactérias multirresistentes e produtoras de biofilmeScandorieiro, Sara; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama [Orientador]; Nakazato, Gerson; Panagio, Luciano Aparecido; Costa, Idessania Nazareth da; Mikcha, Jane Martha GratonResumo: Bactérias multirresistentes são um problema de saúde pública de impacto global, uma vez que há pouca ou nenhuma opção de tratamento eficaz para muitas dessas doenças infecciosas Portanto, o desenvolvimento de novos antimicrobianos é urgentemente necessário Nanopartículas de prata e derivados do Origanum vulgare (orégano) são potentes antimicrobianos, no entanto os primeiros apresentam características organolépticas marcantes e a emergência de resistência bacteriana à prata acontece rapidamente Com objetivo de prevenir emergência de resistência, reduzir efeito organoléptico do orégano e desenvolver um mistura de antimicrobianos com mecanismo de ação estratégico, este estudo avaliou o efeito de quatro associações contendo nanopartículas de prata biogênicas (bioAgNP, sintetizadas com Fusarium oxysporum) e derivados do orégano (óleo essencial de orégano – OEO, carvacrol – CAR ou timol – Thy) contra bactérias Gram-positivas e negativas As seguintes combinações foram testadas: OEO/bioAgNP, CAR/bioAgNP, Thy/bioAgNP e CAR/Thy As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) médias contra bactérias planctônicas e sésseis (SCIM=95) foram, respectivamente, ,84 e ,59 mg/mL (OEO), ,48 e ,46 mg/mL (CAR), ,47 e ,37 mg/mL (Thy) e 92 e 115,62 µM (bioAgNP) Os derivados do orégano foram bactericidas em pelo menos 1 s, enquanto bioAgNP agiram mais rápido contra Gram-negativas (3 min) do que Gram-positivas (7 h) As combinações foram pouco hemolíticas e exibiram efeito antibacteriano aditivo contra células planctônicas, reduzindo significativamente CIM de todos os compostos e tempo de ação de bioAgNP As associações também mostraram maior efeito antibiofilme do que os antimicrobianos isolados, pois quando combinados exibiram menor SCIM=95; e mesmo quando não houve redução de SMIC=95, provocaram maior redução na biomassa (cristal violeta) e atividade metabólica (MTT) dos biofilmes bacterianos CAR/bioAgNP e Thy/bioAgNP se destacam, pois inibiram extensivamente o crescimento de biofilme pré-formado em poliestireno e superfície de vidro, interferindo com sua atividade metabólica e organização estrutural (analisada por microscopia eletrônica de varredura) Além disso, em ensaio de exposição prolongada, Thy/bioAgNP preveniu a emergência de cepas resistentes, enquanto bioAgNP sozinho perdeu a eficiência antibacteriana após 12 dias de tratamento diário O mecanismo de ação de Thy, bioAgNP e combinação de ambos (contra Escherichia coli) envolve estresse oxidativo, uma vez que causaram aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) e peroxidação lipídica, dano à membrana plasmática e parede celular (protusões na superfície celular observadas por microscopia eletrônica), com consequente perda de conteúdo citoplasmático (proteínas, DNA, RNA e ATP) OEO e CAR atuaram como antioxidantes, porém afetaram a membrana e parede celular bacterianas (protrusões na superfície e extravasamento de conteúdo citoplasmático) Este estudo descreve, pela primeira vez, o mecanismo de ação antibacteriana de derivados do orégano e bioAgNP em associações que podem ser aplicadas em indústrias e ambientes clínicos e hospitalaresItem Caracterização parcial de fatores hemolíticos e citotóxicos de Arthrographis kalrae e imunomodulação no decorrer da infecção experimental murinaNagashima, Luciene Airy; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Furlaneto, Márcia Cristina; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Ono, Mário AugustoResumo: Arthrographis kalrae é um fungo dimórfico, neurotrópico e cosmopolita que vem sendo descrito como um raro patógeno humano com diversas manifestações clínicas Este estudo investigou as atividades hemolítica e citotóxica de antígenos solúveis (cell-free antigens - CFA) de A kalrae e a resposta imunopatológica ao fungo durante a infecção murina experimental CFA total e suas frações cromatográficas (Sephadex G-15/12) foram testados em hemácias de camundongo para hemólise por teste em placa com leitura a 55 nm, e em linhagem celular P3U1 para citotoxicidade por método de metiltiazolil tetrazólio (MTT) Para caracterizar melhor o fator hemolítico, anticorpos anti-hemácias isogênicas sensibilizadas com CFA foram produzidos e testados em ensaio de inibição Também, teste de hemólise foi realizado após aquecimento do CFA e a reatividade dos anticorpos foi analisada após tratamento com periodato Na infecção experimental, camundongos Balb/c foram inoculados intravenosamente com A kalrae (5x16 células) e a carga fúngica (unidades formadoras de colônias - CFU - e antigenemia por ELISA de inibição), análise histopatológica do cérebro, respostas imunes humoral (IgG e sub-classes IgG1, IgG2b e IgG2a, por ELISA) e celular (hipersensibilidade tipo tadio - DTH) e níveis de citocinas (IFN-y, IL-4, IL-1 e IL-17) séricos e cerebrais foram avaliados 7, 14, 28 e 56 dias após infecção Os resultados obtidos demonstraram atividades hemolítica e citotóxica em concentrações distintas e em frações de alta e baixa massa molecular (MM), respectivamente Os anticorpos obtidos inibiram a hemólise, mas não a citotoxicidade A atividade hemolítica não foi afetada pelo aquecimento e a sua maior reatividade foi detectada nas frações ricas em carboidratos, sendo essa atividade reduzida por tratamento com periodato Em camundongos infectados foi detectada maior carga fúngica na fase inicial, principalmente no baço, fígado e cérebro, com pequena resposta inflamatória, com perda de peso e apresentando alterações comportamentais No decorrer da infecção houve diminuição da carga fúngica, porém com CFU positivo em alguns órgãos mesmo após 56 dias de infecção Houve um aumento gradual no nível de IgG anti-A kalrae (IgG1>IgG2a>IgG2b) com permanência alta de antigenemia e de menor peso corporal no decorrer de infecção, em relação ao grupo controle Foi detectado aumento de resposta de DTH em 14 dias, ocorrendo diminuição após esse período Houve diminuição de IFN-y (14 a 56 dias), aumento de IL-4 (7 e 56 dias) e aumento (7 dias) ou diminuição (56 dias) de IL-17 no soro Diminuição nos níveis das citocinas foi observada no cérebro 56 dias após a infecção Concluímos que A kalrae secreta fatores solúveis com atividade hemolítica e citotóxica, sendo o primeiro de natureza glicoproteica, termoestável e de alta MM, possivelmente distinto do fator citotóxico Concluímos também que o isolado A kalrae induz alteração comportamental, perda de peso, imunodepressão celular com modulação sistêmica de citocinas, possivelmente para padrão de resposta Th2, induzindo também modulação de citocinas no cérebro na infecção experimental em camundongosItem Caracterização e epidemiologia molecular de cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBLs isoladas de pacientes do Hospital Universitário de Londrina, no período de 2000-2004Vespero, Eliana Carolina; Saridakis, Halha Ostrensky [Orientador]; Barth, Afonso Luis; Tognim, Maria Cristina; Cunha, Mariangela Hungria da; Pelayo, Jacinta SanchezResumo: Klebsiella pneumoniae desempenha papel importante em infecções hospitalares causando, principalmente, pneumonia, sepse, infecção urinária e de ferida cirúrgica Os objetivos deste estudo foram: determinar os perfis de resistência a antimicrobianos, caracterizar ESBLs (ß-lactamases de espectro ampliado), avaliar a similaridade genética, comparar técnicas de tipagem molecular bacteriana e pesquisar a presença de integrons, em 141 cepas de K pneumoniae isoladas de pacientes do Hospital Universitário de Londrina, no período de cinco anos (2-24) Após determinados os perfis de resistência (Kirby-Bauer), foram definidas as CIMs (Concentrações Inibitórias Mínimas) aos antimicrobianos, utilizando o método de diluição em ágar (CLSI 26) A produção de ESBLs foi confirmada utilizando os testes de associação com ácido clavulânico e de disco sinergismo A pesquisa de genes de ß-lactamases blaTEM, blaSHV e blaCTX-M, foi realizada por PCR e sequenciamento; foi ainda realizada pesquisa de classes de integrons e caracterização do integron classe 1 Para determinar a similaridade genética entre as cepas foram utilizados métodos baseados em PCR e RFLP-PFGE Todas as amostras apresentaram sensibilidade aos antimicrobianos imipenem, meropenem e cefoxitina Presença de diferentes genes e combinações de genes que codificam enzimas nas cepas, foi observado, sendo blaCTX-M-2 o mais freqüente (131 isolados) A presença de integrons revelou: 131 (93%) cepas com integron classe 1; nove (6,4%) com classe 2 e sete (5%) cepas com ambas as classes Não foi detectada a presença de integron classe 3 A caracterização do integon classe 1 transportando o gene blaCTX-M-2 demostrou tratar-se de um integron classe 1 incomum Entre os métodos de tipagem, PFGE apresentou elevado índice de discriminação (DI) com ,989, REP-PCR (,969), combinação dos cinco métodos (,999), combinação rep-PCR e RAPD (,986); seguidos de RAPD (,946), ERIC-PCR (,938) e BOX-PCR (,937) Nossos resultados sugerem que os métodos baseados em PCR são apropriados para análise inicial de cepas de K pneumoniae e que RFLP-PFGE seria indicada para análise complementar CTX-M-2 foi a ESBL prevalente em nossa região e os genes que a codificam encontram-se localizadas em um integron classe 1 incomum Este integron já foi descrito transportando a mesma enzima na Argentina e no Uruguai, no entanto, este é o primeiro relato deste integron em nossa região, no Brasil Nossos resultados sugerem que ESBLs, em K pneumoniae, sobre tudo CTX-M-2 e SHV-5 são as enzimas mais freqüentes em nossa região E que a multiplicidade de genótipos pode ser resultante da disseminação da enzima CTX-M-2 e de genes de resistência presentes em elementos genéticos móveis, incluindo integrons