01 - Doutorado - Microbiologia

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Resistência a nanopartícula de prata : análise fenotípica e genotípica em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae
(2020-09-28) Figueiredo, Érica Pelegrin; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nishio, Erick Kenji; Cyoia, Paula Signolfi; Gazal, Luís Eduardo de Souza
As infecções causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos, uma preocupação mundial, são responsáveis por aumentar o tempo de internação dos pacientes afetados, elevando o custo dos tratamentos e aumentando a taxa de morbimortalidade. Os metais têm sido usados desde a antiguidade como agentes antibacterianos e apresentam diferentes propriedades e espectros de ação. Dentre os metais, a prata é um dos mais utilizados devido à sua eficiência como antimicrobiano e sua baixa toxicidade. Com o advento da nanotecnologia na área médica, as nanopartículas de prata (AgNP) passaram a ser amplamente estudadas por sua ação antimicrobiana, inclusive contra bactérias multirresistentes. Em nosso estudo, avaliamos a alteração fenotípica e genotípica em cepas de bactérias Gram-negativas contra a exposição prolongada a subdoses de nanopartículas de prata sintetizadas biologicamente (AgNPbio). AgNPbio foi sintetizada biologicamente por utilizando extrato de Fusarium oxysporum. Após exposição prolongada, foi possível observar alteração na Concentração Inibitória Mínima (CIM) em 7 cepas bacterianas. Após o ensaio de indução, 3 cepas bacterianas apresentaram alteração na sensibilidade colateral e resistência cruzada frente a antimicrobianos convencionais. Nossos resultados mostraram uma atenção necessária na exposição prolongada de AgNPbio contra cepas bacterianas.
Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas
(2021-03-31) Souza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Pavanelli, Wander Rogério; Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José
O ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.
Efeito das nanopartículas de prata biogënicas sobre os fatores de virulência e sistema quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa
(2021-06-07) Saeki, Erika Kushikawa; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Garcia, Doroti de Oliveira; Eller, Lizziane Kretli Winkelströter
O estudo dos compostos com atividade antivirulência para o controle da patogenicidade bacteriana estão em destaque na literatura atual. Dentre estes compostos, as nanopartículas de prata são cada vez mais pesquisadas para o controle da disseminação das infecções por P. aeruginosa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das nanopartículas de prata biogênicas (bio-AgNP) nos fatores de virulência e Sistema Quorum Sensing (QS) em Pseudomonas aeruginosa. As bio AgNPs foram sintetizadas pelo método de redução da prata iônica pelo fungo Fusarium oxysporum e os ensaios foram realizados com isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa e com as cepas de referência PAO1 e PA14. A identificação dos isolados foi realizada por métodos bioquímicos e moleculares e foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM). Os ensaios para avaliar a produção de fatores de virulência (motilidade, ramnolipídeos, protease alcalina, elastase e piocianina) e capacidade de formação de biofilmes foram realizados. O ensaio de RT-qPCR foi realizado para determinar o efeito da bio-AgNP nos genes reguladores de QS (lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsA e mvfR). As CIM variaram de 15,62-62,50 µM, e a CBM foi de 125 µM para PAO1 e PA14. Os resultados mostraram que as concentrações subinibitórias (1/2 CIM) de bio-AgNP (7,81 a 31,25 µM) aumentaram significativamente (p < 0,050) as motilidades swarming, swimming e twitching, em 40,0%, 40,0% e 46,7% nos isolados clínicos e ambientais, respectivamente. Observou-se que a bio-AgNP aumentou significativamente (p < 0,050) a capacidade de formação de biofilmes em um isolado de paciente com fibrose cística. O tratamento com as concentrações subinibitórias de bio-AgNPs em PAO1 não afetou a produção de protease e biofilme. Entretanto, houve redução significativa (p < 0,05) na motilidade e na produção de ramnolipídeos e elastase. Na cepa PA14 houve estímulo na motilidade swarming e twitching, além da produção de elastase, piocianina e formação de biofilme. Os tratamentos com bio-AgNPs também aumentaram a expressão (p < 0,05) dos genes controladores do sistema QS em P. aeruginosa PAO1 e PA14. Conclui-se que o tratamento com concentrações subinibitórias de bio-AgNPs favoreceu o aumento fenotípico na maioria dos fatores de virulência testados. As cepas PAO1 e PA14 apresentaram diferentes respostas ao tratamento com as bio-AgNPs. A exposição bacteriana as baixas concentrações de bio-AgNPs pode promover o aumento na expressão dos genes reguladores do Sistema QS em P. aeruginosa. Por isso, a aplicação das bio-AgNP na terapia antibiofilme e antivirulência precisa ser avaliada com cautela, para que os compostos sejam utilizados na concentração adequada, o sistema QS seja definitivamente interrompido e os fatores de virulência sejam controlados.
Switching fenotípico em Candida tropicalis : alterações na resposta celular e fagocitose frente a estresses oxidativo e osmótico
(2021-12-20) Perini, Hugo Felix; Furlaneto, Márcia Cristina; Furlaneto-Maia, Luciana; França, Emanuele Júlio Galvão de; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Grasi, Melyssa Fernanda Negri
Switching fenotípico em Candida tropicalis promove alterações na manifestação de virulência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Uma vez que o evento pode estar relacionado com alterações na resposta adaptativa, o objetivo do presente trabalho foi availiar o papel do Switching fenotípico na resposta ao estresse osmótico e oxidativo. Para tal, dois sistemas de Switching fenotípico de C. tropicalis (49.07 e 100.10) compostos de cinco morfotipos cada (Parental, Crepe, Rugoso, Revertente de Rugoso e Revertente de Crepe) foram expostos à 1 M de NaCl e 5 mM de H2O2 por 10 e 60 min. Análises de resitência ao estresse foram realizadas por contagem de UFC após exposição e o dano em membrana com ensaio de iodeto de propídio. Análises de expressão dos genes HOG1, EFG1 e WOR1 foram realizadas por qPCR e a quantidade de componentes de parede por ensaio fluorimétrico. Análizou-se também, o efeito do Switching sobre a fagocitose e perfil de filamentação no contato com hemócitos e macrófagos e o efeito da pré-exposição ao H2O2 nessas variáveis. Respostas de alterações na parede celular, expressão dos genes testados e resistência ao estresse foram sistemas-dependente, não apresentando relação direta com o padrão morfológico do morfotipo. Variantes morfológicos (Crepe e Rugoso - 100.10) apresentaram menor e complexidade celular que o Parental, assim como alterações na quantidade de manana e na porosidade da parede. Revertentes morfológicos também apresentam maior quantidade de quitina, β-glucana e porosidade que o Parental. Em resposta ao estresse, 62,5% dos morfotipos derivados de Switching foram mais resistentes ao choque osmótico (10 min) e 25% à osmoadaptação (60 min). Sob estresse oxidativo 37,5% apresentaram maior viabilidade que o parental após 10 min, e 25% sob estresse prolongado (60 min). O morfotipo Crepe destacou-se como morfotipo com maior capacidade de resposta aos estresses testados. Esse morfotipo apresentou menor decréscimo no volume celular sob estresse osmótico e aumento de quitina e manana na parede celular. Sob estresse prolongado HOG1 manteve alta expressão nesse morfotipo (49.07). Sob estresse oxidativo Crepe teve alta expressão de todos os genes testados. Hemócitos e macrófagos apresentaram mesmo perfil de fagocitose. Crepe foi mais fagocitado que Parental, no entanto, houve redução no número de células do morfotipo fagocitadas após pré-exposição ao H2O2. Crepe apresentou alta capacidade de formação de hifas verdadeiras em co-cultivo com os fagócitos. A pré-exposição ao H2O2 promoveu regulação positiva de WOR1 e HOG1 em Crepe (49.07). Células de Crepe pré expostas apresentaram maior quantidade de quitina (100.10) e maior porosidade (ambos os sistemas) que o parental. O presente trabalho pode concluir que switching fenotípico promove alteração do fitness celular e consequentemente resposta alterada aos estresses osmótico e oxidativo em C. tropicalis, refletidas na regulação gênica, alterações da parede celular e na capacidade de morfogênese.
Bioinsumos na agricultura brasileira: uma avaliação de bactérias solubilizadoras de fosfato em consórcio com fungo micorrízico arbuscular Rhizophagus clarus na cultura do algodão
(2025-02-21) Andreata, Matheus Felipe de Lima; Andrade Filho, Galdino; Simionato, Ane Stéfano; Gonçalves, Leandro Simões Azeredo; Watanabe, Lycio Shinji; Assis, Rafael de
No contexto atual de busca por uma agricultura com práticas mais sustentáveis, menor impacto ambiental e alimentos de maior qualidade nutricional, cresce a cada ano o mercado de insumos biológicos para agricultura no Brasil. Projeções indicam que esse mercado deve continuar crescendo nos próximos anos, podendo atingir 17 bilhões em 2030. Neste cenário, este trabalho teve como objetivo realizar um levantamento dos inoculantes e biodefensivos registrados no Brasil, destacando os principais microrganismos utilizados na promoção de crescimento vegetal e no biocontrole de doenças e pragas, e os seus mecanismos de ação. Com base nisso, realizamos uma discussão sobre as tendências, desafios e perspectivas futuras do mercado brasileiro de bioinsumos frente aos desafios enfrentados pela agricultura do país. Quanto aos inoculantes, com a utilização de bactérias fixadoras de nitrogênio bem estabelecida, existe uma tendência do desenvolvimento de produtos capazes de melhorar a absorção de outro nutrientes, como fósforo e potássio, sendo importante ferramenta para a redução da dependência de fertilizantes químicos, além de cepas eficientes na resistência contra estresses abióticos, que devem ser um dos grandes desafios para agricultura nos próximos anos. Em relação aos biodefensivos, um mercado que está em expansão no Brasil, o estímulo ao manejo integrado de pragas deve consolidar cada vez mais a utilização desses insumos, e a utilização de novas tecnologias, cepas multifuncionais, consórcios microbianos, otimização de bioprocessos e formulações serão fundamentais para aumentar a eficiência desses produtos e consequentemente a adesão do mercado consumidor. Além disso, com a finalidade de desenvolver um inoculante eficiente na disponibilização de fósforo no solo, prospectamos e caracterizamos in vitro 13 isolados bacterianos quanto a produção de ácido indolacético, produção de sideróforos, produção de exopolyssacarídeos, atividade lítica de proteínas, celulose e amido, e colonização de raízes. Dois isolados foram selecionados, identificados como Micrococcus sp cepa BE1 e Lysinibacillus sp cepa SF1, avaliadas quanto ao perfil de produção de ácidos orgânicos in vitro e a capacidade promover crescimento em casa de vegetação na cultura do algodão, com base em aspectos como: biomassa de raiz e parte aérea, altura, entrenó e teores de fósforo (P) e nitrogênio (N). As cepas foram inoculadas de forma isolada e em associação com o fungo micorrízicos arbuscular Rhizophagus clarus. A duas cepas apresentaram uma produção significativa de ácido málico e ácido glucônico em meio suplementado com fosfato tricácico. Quanto ao experimento em casa de vegetação, o tratamento contendo a cepa SF1 de Lysinibacillus sp. aumentou em 63% os teores de P das folhas algodão em relação ao controle, enquanto a cepa BE1 de Micrococcus sp, demonstrou aumento de 20% nos teores de nitrogênio. Porém, não demonstraram efeito de promoção de crescimento significativo, quando aplicadas de forma isolada e quando coinoculadas com R. clarus.
Atividade antibiofilme de cateter revestido internamente com nanopartículas de prata contra bactérias uropatogênicas
(2025-02-27) Guidone, Gustavo Henrique Migliorini; Rocha, Sérgio Paulo Dejato da; Oliveira Júnior, Admilton Gonçalves de; Nakazato, Gerson; Vespero, Eliana Carolina; Scandorieiro, Sara
As infecções do trato urinário associadas a cateteres estão entre as infecções nosocomiais mais comuns. Diversas bactérias estão associadas a essas infecções, dentre eles pode-se destacar E. coli, K. pneumoniae e P. mirabilis. Diante disso, este estudo desenvolveu um método para revestir cateteres urinários com AgNP e polidopamina como agente de ancoragem. Para isso, foram realizados testes de concentração inibitória e bactericida mínima (CIM e CBM), ensaios de inibição da formação de biofilme e destruição de biofilme e teste dos cateteres revestidos em modelo de bexiga in vitro. Todos os testes foram realizados com E. coli ATCC 25922, K. pnuemoniae ATCC 600703 e P. mirabilis ATCC 7002. As nanopartículas apresentaram CIM de 125 μM e uma CBM de 250 μM para todas as cepas testadas. Concentrações iguais ou maiores que o valor de CIM inibiram a formação de biofilme em placas de poliestireno, enquanto biofilmes pré-formados exigiram concentrações maiores. O revestimento foi aplicado na parte interna do cateter, e a presença de prata foi confirmada por EDS. Em um modelo de bexiga in vitro, o cateter revestido inibiu a formação de biofilme por E. coli em teste com densidade celular de 106 UFC/mL e reduziu a formação de biofilme por K. pneumoniae nas densidades celulares de 106 e 108 UFC/mL, 98% e 99%, respectivamente. Não houve redução do biofilme formado por P. mirabilis mesmo com o revestimento de BioAgNP. A eficiência contra E. coli foi dependente da carga bacteriana inicial. Esses resultados sugerem que, embora o revestimento de nanopartículas de prata tenha o potencial de prevenir infecções associadas ao cateter urinário, sua eficácia pode variar dependendo das espécies bacterianas e das condições iniciais de colonização.
Fluopsina C lipossomal: propriedades físico-químicas, efeito citotóxico e atividade antibacteriana contra Klebsiella pneumoniae multirresistente in vitro e in vivo
(2025-03-25) Gomes, Mickely Liuti Dealis; Andrade Filho, Galdino; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Perugini, Marcia Regina Eches; Cely, Martha Viviana Torres; Mello, João Carlos Palazzo de; Cabeça, Luís Fernando
A Fluopsina C (Flp) é um antimicrobiano de amplo espectro descoberto há cinco décadas e seu uso desencorajado devido à alta toxicidade. Para viabilizar seu uso clínico, esse trabalho objetivou a otimização da Flp por lipossomas. A Flp foi purificada do sobrenadante de cultura em presença de cobre de Pseudomonas aeruginosa cepa LV com posterior purificação utilizando diversos métodos cromatográficos padronizados. O encapsulamento lipossomal foi obtido via extrusão contando com a formulação de fosfatidilcolina de soja, colesterol e diesteroil fosfatidil etanolamina (DSPE)-polietilenoglicol (PEG) em diferentes proporções formando quatro formulações iniciais, também com variações quanto a presença de dimetilsulfóxido (DMSO). As formulações foram avaliadas quanto ao tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta, eficiência de encapsulação, estabilidade de armazenamento, taxa de liberação em sistema in vitro, citotoxicidade e atividade antimicrobiana contra Klebsiella pneumoniae multirresistente (MDR) in vitro e em modelo de infecção de corrente sanguínea in vivo em camundongos Swiss. Os resultados indicam que a formulação DSPE-PEG DMSO+Flp apresentou estabilidade físico-química, além de atividade antimicrobiana semelhante a Flp livre, com vantagens quanto à liberação controlada e citotoxicidade reduzida da concentração citotóxica de 50% (CC50) em 54% nos testes in vitro. Não houve mortalidade na maior dose administrada, sendo possível inferir uma dose letal maior que 8 mg/kg. A melhor dose efetiva in vivo foi de 2 doses de 2 mg/kg para Flp livre frente 1 dose de 2 mg/kg para DSPE-PEG DMSO+Flp, com 40% de redução da mortalidade. Não foi observada hemorragia hepática, apenas infiltração inflamatória discreta. A avaliação dos rins apresentou necrose discreta a moderada, contudo não houve presença de infiltrado inflamatório e hemorragia em nenhum dos grupos analisados. Os órgãos analisados também apresentaram tendência de recuperação dos parâmetros normais ao longo dos tempos estudados. Dessa forma, a encapsulação em lipossomas pode viabilizar o uso da mesma para o controle de infecções causadas por K. pneumoniae MDR.
A valorização da microbiologia e bioquímica do solo na agricultura contemporânea: bioinsumos e bioindicadores
(2025-04-17) Bocatti, Camila Rafaeli; Nogueira, Marco Antonio; Nunes, Amanda Letícia Pit; Rondina, Artur Berbel Lirio; Klepa, Milena Serenato; Marcon, Sônia Silva
Estimativas sobre o crescimento da população mundial até 2050 levantam discussões acerca do aumento da demanda por produtos agropecuários. Todavia, o manejo inadequado do solo e o uso excessivo de insumos químicos podem causar perdas na fertilidade do solo e causar degradação ambiental, evidenciando a necessidade pela busca de soluções sustentáveis. Neste cenário, os microrganismos têm se destacado como alternativa ou complemento aos agroquímicos por meio dos chamados bioinsumos. Compreender a dinâmica das comunidades microbianas do solo é fundamental para aperfeiçoar suas funções e melhorar os processos agropecuários. Os objetivos deste trabalho foram apresentar, no capítulo I, uma revisão de literatura que descreve a trajetória de uso de bioinsumos em alguns países que têm tradição de uso destes produtos em seus sistemas de produção. Aprimorar o uso de microrganismos na agricultura pode ser um passo fundamental para um futuro agrícola mais produtivo e ambientalmente responsável. Além do uso de bioinsumos na agricultura, o capítulo II, traz o resultado de um estudo que foi conduzido em uma propriedade agrícola produtora de grãos em Santa Catarina, Brasil. Além dos atributos químicos do solo, foram avaliadas as atividades das enzimas β-glicosidase e arilsulfatase, utilizadas como indicadores da qualidade biológica do solo, mediante diversificação de culturas de grãos e de cobertura do solo no inverno. A tecnologia de Bioanálise do Solo (BioAS) permitiu verificar o efeito das práticas agrícolas, sobretudo a diversificação de culturas, sobre as propriedades biológicas do solo e, consequentemente, na produtividade das culturas exploradas comercialmente, soja, milho, trigo e feijão. Os resultados obtidos revelaram que a produtividade mostrou-se mais associada a fatores integrados do que a aspectos isolados e revelou uma correlação modesta com a maioria das variáveis avaliadas, indicando que, embora fatores químicos e biológicos sejam relevantes no sucesso das culturas, todos os componentes são válidos, como manejo adequado e práticas conservacionistas e sustentáveis.
Análise do genoma e da expressão gênica diferencial de entomotoxinas de Photorhabdus asymbiotica subsp. paranaensis subsp. nov.
(2025-04-25) Silva, Leandro Afonso da; Andrade Filho, Galdino; Alves, Viviane Sandra; Souza, Emanuel Maltempi de; Gonçalves, Leandro Simões Azeredo; Yamada-Ogatta, Sueli Fumie
O gênero Photorhabdus é composto por bactérias bacilares Gram-negativas simbiontes de nematoides entomopatogênicos do gênero Heterorhabditis, nos quais são encontradas colonizando seus intestinos. Na última década, a taxonomia de Photorhabdus tem sido revisitada pela aplicação de dados oriundos de sequenciamento do genoma total, aperfeiçoando o posicionamento taxonômico e intensificando a identificação de características desejáveis para aplicação biotecnológica. Nesta pesquisa, caracterizamos a cepa de Photorhabdus UENP 3, obtida a partir de um nematoide Heterorhabditis não descrito, isolado a partir de amostras de solo do sul do Brasil, a fim de determinar sua posição taxonômica e também avaliamos o efeito da variação fásica sobre a produção de entomotoxinas por meio da análise da expressão gênica diferencial. A filogenia baseada em 16S rRNA reiterou seu pertencimento ao gênero Photorhabdus, mas apresentou ambiguidades quanto à espécie devido a indicação de altas similaridades com P. australis subsp. australis (97,34%) e P. heterorhabditis subsp. aluminescens (96,75%). A reconstrução filogenética utilizando o genoma core delimitou que a cepa UENP 3 pertence a espécie P. asymbiotica; entretanto, forma um novo clado dentro deste grupo. Comparações genômicas foram realizadas para potencializar a circunscrição taxonômica, e os maiores valores de ANI e dDDH foram obtidos para P. asymbiotica ATCC 43950, sendo 97,30%, e 75,30%, respectivamente. Os valores obtidos encontram-se abaixo do ponto de corte para delimitação de subespécies (ANI > 98,00; dDDH > 79,00%). Portanto, UENP 3 representa uma nova subespécie dentro de P. asymbiotica e propomos o nome Photorhabdus asymbiotica subsp. paranaensis subsp. nov. com UENP 3 como cepa-tipo. A análise da expressão gênica diferencial revelou a presença de 631 genes downregulated e 158 upregulated (p < 0,05). Entre os 22 genes relacionados às entomotoxinas da classe Tc, apenas 9 apresentavam-se diferencialmente expressos, indicando moderada regulação transcricional entre as fases. Nossos dados corroboram a exploração de Photorhabdus como uma fonte de proteínas inseticidas e indicam um impacto limitado sobre a produção de entomotoxinas frente à variação de fase de curto prazo.
Seleção de bactérias promotoras do crescimento de plantas em processos multifuncionais
(2025-10-06) Vasques, Natalia Caetano; Hungria, Mariangela; Nogueira, Marco Antônio; Cerezini, Paula; Pavanelli, Pâmela Menna Pereira; Klepa, Milena Serenato
A substituição de insumos químicos por soluções biológicas sustentáveis tem ganhado destaque global, especialmente no setor agrícola, impulsionada pela crescente demanda por práticas produtivas mais seguras, com menor impacto ambiental e que contribuam para a regeneração dos ecossistemas. Essa transição reflete não apenas uma tendência de mercado, mas também uma necessidade estratégica para garantir a sustentabilidade e a competitividade da agricultura moderna. Neste contexto, métodos de avaliação in vitro do potencial biotecnológico de bactérias foram validados e descritos quanto à tolerância à baixa atividade de água (Aw 0,919 e 0,897) e alta temperatura (40 ± 2 °C), síntese de protease, celulase, ACC-desaminase, exopolissacarídeos, ácido indol-3-acético, biofilme, sideróforos e solubilização de fosfato de cálcio. Essas propriedades foram avaliadas para a triagem in vitro de 100 estirpes da “Coleção de Culturas de Bactérias Diazotróficas e Promotoras do Crescimento de Plantas da Embrapa Soja”, visando identificar propriedades agronomicamente relevantes. Os ensaios em casa de vegetação, com milho inoculado com essas estirpes e submetido à restrição hídrica confirmaram a correlação entre o desempenho in vivo e a tolerância à baixa atividade de água e alta temperatura in vitro, validando o uso dessa abordagem como ferramenta eficaz para acelerar a seleção de estirpes promissoras para essas propriedades. Dentre as estirpes, destacaram-se as estirpes dos gêneros Bacillus e Pseudomonas, sendo o primeiro notável por sua multifuncionalidade. Três estirpes, Bacillus velezensis CNPSo 2384, Bacillus subtilis CNPSo 2606 e Bacillus sp. CNPSo 2723, foram eficientes na mitigação da restrição hídrica em milho. O potencial multifuncional presente em Bacillus spp., levou a uma revisão sobre suas propriedades relacionadas aos mecanismos de promoção do crescimento vegetal, controle biológico de pragas e doenças, além da contribuição para práticas de agricultura regenerativa. As bactérias promotoras do crescimento de plantas têm potencial para revolucionar a agricultura pelo aumento da produtividade das culturas e por meio de soluções biológicas para o controle de pragas e doenças, nutrição e atenuação de estresses abióticos, representando uma ferramenta essencial para uma agricultura ambientalmente responsável
Ação inibitória de enterocina e de nanopartículas de prata biogênica conjugadas com enterocina contra patógenos bacterianos
(2025-10-22) Souza, Nathália Aparecida Andrade de; Furlaneto, Marcia Cristina; Pozza, Magali Soares dos Santos; Sartori, Daniele; Perini, Hugo Felix; Panagio, Luciano Aparecido; Maia, Luciana Furlaneto
A resistência antimicrobiana representa um desafio crescente para a saúde pública e a segurança alimentar, exigindo novas estratégias de controle. Espécies do gênero Enterococcus destacam-se pelo potencial biotecnológico e clínico. Nesse contexto, este trabalho investigou o potencial antimicrobiano de enterocinas de Enterococcus durans, avaliando seu uso isolado e associado à nisina, ácido lactobiônico (LBA) e nanopartículas de prata biogênicas (bio-AgNP), visando o controle de patógenos bacterianos de importância clínica e alimentar. E. durans MF5 foi caracterizado quanto a presença de genes codificadores de enterocinas. Assim, foi possível identificar a presença de quatro genes codificadores de enterocina (entA, entB, entP e entX), revelando que esta cepa pode ser considerada produtora de múltiplas enterocinas. A natureza proteica da enterocina obtida de E. durans MF5 foi confirmada pela perda da atividade antibacteriana após tratamento com tripsina, quimotripsina, protease e proteinase K. Além disso, apresentou estabilidade térmica durante o tratamento a altas temperaturas. Ao avaliar a ação antibacteriana de Ent-MF5, houve efeito bactericida contra L. monocytogenes, com redução significativa de células viáveis, em concentrações iguais ou superiores a 0,13 μg/mL. Adicionalmente, Ent-MF5, LBA e nisina apresentam atividade antibacteriana contra S. aureus ATCC-25923, tanto testadas isoladamente e em combinação com ent-MF5, em células planctônicas. As nanopartículas obtidas por sintese verde (Bio-AgNP) conjugadas com enterocina (nanoconjugados), apresentaram ação antibacteriana contra todos as linhagens bacterianas testadas, sensíveis e resistentes (Enterococcus faecium ATCC 6569, EF29 e EF34; Staphylococcus aureus ATCC 25923, N315 e BEC-939). A concentração inibitória mínima (MIC) das bio-AgNPs para as bactérias testadas foi de 1,5 μg/mL (E. faecium) e 3,1 μg/mL (S. aureus). Além disso, a ação de bio-AgNP sobre biofilmes formados em superfícies de poliestireno pelas cepas de E. faecium e S. aureus foi investigada. No ensaio com cristal violeta, observou-se uma redução de até 20% na biomassa total de E. faecium e até 51% para S. aureus na concentração de 0,5×MIC. A atividade metabólica das células sésseis, avaliada por XTT, revelaram diminuição de até 91% na atividade de E. faecium e 23% para S. aureus na concentração de 0,5×MIC. As nanopartículas afetaram principalmente as células persistentes nos biofilmes de E. faecium ATCC-6569 (98,51 ± 0,09%), E. faecium EF29 (96,68 ± 0,3%), S. aureus ATCC-25923 (97,65 ± 0,36%) e S. aureus N315 (99,52 ± 0,02%). Em conclusão, as enterocinas apresentaram importante ação antibacteriana, principalmente quando avaliadas em associação às nanopartículas de prata, importante para as cepas resistentes e ação antibiofilme. Além disso, ao avaliar as enterocinas combinadas à nisina ou LBA, houve redução do crescimento bacteriano e redução da concentração de uso dos compostos.
Candida não-albicans : avaliação de fatores de virulência e perfil no estudo epidemiológico de candidúria
Oliveira, Marcelo Tempesta de; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Furlaneto-Maia, Luciana; Venâncio, Emerson José; Andrade, Célia Guadalupe Tardeli de Jesus
Resumo: Leveduras do gênero Candida estão entre os principais patógenos causadores de infecções nosocomiais em todo o mundo Desta forma, este trabalho teve como objetivo estabelecer o perfil epidemiológico da candidúria no HU de Londrina/PR entre os anos de 26 e 27, classificar a extensão da candidúria em diferentes níveis e identificar fatores de risco específicos para o isolamento de espécies de Candida não-albicans Foram incluídos no estudo isolados clínicos de Candida spp obtidos de indivíduos urocultura positivos cuja detecção foi = 12 UFC mL-1 Também foi realizada a análise comparativa ultraestrutural da interação de diferentes morfotipos de C parapsilosis com a superficie de unha e cabelo humanos pelo emprego da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a avaliação da expressão dos genes SAPs de 15 isolados clínicos de C tropicalis em resposta aos substratos BSA e hemoglobina pela técnica de PCR em tempo real Um total de 157 isolados de Candida foi obtido, incluindo C albicans (n=72), C tropicalis (n=54), C glabrata (n=2), C parapsilosis (n=8), C krusei (n=2) e C dubliniensis (n=1) A extensão da candidúria foi classificada em tres diferentes níveis: nível 1 (candidúria leve), nível 2 (candidúria de risco) e nível 3 (candidúria pesada) Houve diferença significativa entre a freqüência de isolamento de C albicans e espécies não-albicans em relação aos diferentes níveis de candidúria estabelecidos neste estudo, evidenciando a candidúria nível 3 (candidúria pesada) como um fator de risco independente para o isolamento de espécies não-albicans A MEV revelou que as células do fenótipo -smooth? de C parapsilosis aderem em maior número em ambas as superfícies em relação aos observados para o fenótipo -crepe? Diferentes perfis na qualidade e quantidade de produção de matriz extracelular entre os dois morfotipos de C parapsilosis também foram observados A avaliação da expressão dos genes SAPs de C tropicalis mostrou que as condições de cultivo testadas proporcionaram a indução significativa dos genes SAPT1, SAPT2 e SAPT3 em relação à situação controle (ausência de substrato), cujo perfil de expressão variou qualitativa e quantitativamente de acordo com o substrato utilizado e os diferentes isolados Pode-se concluir que a contagem de UFC mL-1 de urina e subseqüente classificação da extensão da candidúria em diferentes níveis pode ser utilizada como marcador de isolamento de espécies de Candida não-albicans Conclui-se também que diferentes substratos influenciam a expressão diferencial de genes relacionados à morfologia, adesão e produção de matriz extracelular de C parapsilosis, assim como genes de virulência (SAPs) de C tropicalis, respostas estas que também se mostraram linhagem-dependente, não relacionadas ao sítio de isolamento
Dosagem de imunoglobulinas IgG e IgE totais e específicas, proteínas séricas, HDL colesterol e imunocomplexos na paracoccidioidomicose aguda e crônica
Marquez, Audrey de Souza; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Mendes, Nelson Figueiredo; Furlaneto, Márcia Cristina; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson José
Resumo: A Paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccodioides brasiliensis, apresenta duas formas clínicas distintas: forma aguda (AF) e forma crônica (CF) A AF ocorre principalmente em indivíduos jovens e é mais grave e rara enquanto que a CF acomete, sobretudo, homens adultos e em geral de forma menos grave Os casos de maior gravidade relacionam-se com a depressão da resposta imune celular, a ativação policlonal de células B e o desvio da resposta imune para Th2 Diversos componentes solúveis liberados pelo fungo, como a gp-43, assim como a presença de imuno complexos circulantes tem sido associados ao desvio de resposta e maior gravidade da PCM O objetivo do presente trabalho foi determinar marcadores moleculares de diferenciação entre as duas formas da doença Considerando as dificuldades em se estabelecer rotinas sorológicas simples, rápidas e com antígenos padronizados para o diagnóstico laboratorial ambulatorial da PCM e acompanhamento de tratamento, realizou-se inicialmente a correlação das alterações observadas nas frações de eletroforese de proteínas com a dosagem de IgG e IgE totais e HDL colesterol Foram analisadas 3 amostras de soros de pacientes com CF PCM, 12 de AF PCM e 44 de doadores normais (NHS) por eletroforese e por ensaio imunoenzimático (ELISA) Na segunda etapa foram investigados os níveis séricos de IgG e IgE total e específicas, IC IgG-IgE e IC IgG-gp43 através de ELISA em soro de pacientes com CF PCM (22), AF PCM (12) e NHS (29) Os resultados demonstraram alterações nas frações de proteínas e que existem correlações positivas entre a fração beta e gama-globulinas ou alfa-1 globulinas, gama e alfa-1 globulinas e entre gama-globulinas e níveis de IgE total Concluímos pelo trabalho que existem diferenças entre as duas formas por alterações nas frações alfa-1 e gama globulinas e que existe diferença na interpretação dos resultados de albumina quando analisados em porcentagem ou níveis absolutos e que o HDL colesterol não contribui para as elevações observadas na fração alfa-1 globulinas na PCM Os resultados também confirmam que os níveis séricos elevados de IgG e IgE total e IgG e IgE específicas e IC IgG-gp43 estão associados com a forma mais grave da doença e este trabalho introduz pela primeira vez a presença de IgG-IgE IC diferenciando a forma aguda da PCM da crônica
Genômica e diversidade de Rhizobium Tropici, uma espécie tropical microssimbionte do feijoeiro Phaseolus Vulgaris L
Pinto, Fabiana Gisele da Silva; Hungria, Mariangela [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Furlaneto, Márcia Cristina; Andrade, Diva de Souza; Nicolás, Marisa Fabiana
Resumo: O Brasil é o maior produtor e consumidor mundial de feijão (Phaseolus vulgaris L) O rendimento médio nacional é bastante baixo, devido, principalmente, ao baixo nível de tecnologia empregado na cultura, ao cultivo em solos de baixa fertilidade, especialmente pobres em N Conseqüentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose com bactérias diazotróficas, representa uma alternativa para aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, contudo, problemas relacionados à nodulação e fixação do N2 com as estirpes nativas dos solos são relatados com freqüência Neste trabalho foram conduzidos dois estudos, sendo que no primeiro foi realizada à caracterização de diversidade genética, pela avaliação de genes simbióticos e não simbióticos, de estirpes de Rhizobium tropici, com alta capacidade de fixação do N2 em condições tropicais e isoladas de quatro regiões brasileiras A técnica de PCR-RFLP dos genes ribossomais 16S e 23S e a análise do seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiram a identificação de dois grupos, um relacionado às estirpes de R tropici tipo A e outro às de R tropici tipo B A diversidade dos genes ribossomais foi elevada, indicando que as estirpes do tipo A podem representar uma nova espécie Além disso, foi constatada diversidade genética intraespecífica elevada, pela análise por rep-PCR com os -primers" BOX, ERIC e REP Contudo, na análise de PCR-RFLP dos genes simbióticos, nifH e nodC, todas as estirpes de R tropici apresentaram uma única combinação de perfis, o que pode refletir uma estratégia evolucionária dessas estirpes para a maximização da fixação de N2 No segundo estudo foi realizado o seqüenciamento e a bioprospecção parcial de genes da estirpe PRF 81 (=SEMIA 48) de R tropici, altamente eficiente no processo de fixação do N2 e recomendada para o uso de inoculantes comerciais no Brasil O genoma dessa estirpe foi estimado em 7,85 Mb, pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) Foram obtidas 2192 CDSs, sendo classificadas como válidas (1255), hipotéticas conservadas (668) ou hipotéticas (269) A estratégia de panorama genômico, para a obtenção de genoma parcial, mostrou-se viável e eficiente, uma vez que foram identificados genes putativos na maioria das classes funcionais dos bancos de dados KEGG e COG Foram identificados genes do metabolismo de aminoácidos, carboidratos e lipídeos, bem como relacionados à biodegradação, quimiotaxia e, provavelmente, a mecanismos de infecção, com ênfase em genes relacionados aos sistemas de secreção dos tipos II e III Além disso, foram identificados genes relacionados à capacidade competitiva, saprofítica e ao processo de fixação biológica do N2 A estratégia de panorama genômico utilizada na estirpe PRF 81 indicou um mosaico de similaridade com diversos outros rizóbios Além disso, foram identificados alguns genes promissores para manipulações futuras visando obter incrementos no processo de fixação biológica do N2, não só com o feijoeiro, como em outras leguminosas
Avaliação da atividade hemolítica e expressão de possíveis genes relacionados à aquisição de ferro em Candida tropicalis
França, Emanuele Julio Galvão de; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Furlaneto-Maia, Luciana; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Panagio, Luciano Aparecido
Resumo: No Brasil e em outras regiões de clima tropical, Candida tropicalis é uma das principais espécies relacionadas a episódios de candidemia, provocando elevados índices de morbi-mortalidade A produção de fator hemolítico é reconhecida como um possível atributo de patogenicidade dessa espécie, no entanto, tem sido alvo de poucos estudos Neste trabalho foi avaliado o efeito de diferentes condições de cultivo na produção de fator hemolítico e na expressão de dois genes possivelmente relacionados à aquisição de ferro do grupo heme de C tropicalis - CtHMX1, que possivelmente codifica uma heme-oxigenase e HLPt, que apresenta um papel na determinação da atividade hemolítica dessa espécie Foi verificado que o potencial hemolítico de C tropicalis é influenciado pelas condições ambientais Hemoglobina ou eritrócitos, que representam potenciais fontes de ferro, determinaram o aumento da hemólise promovida pela maioria dos isolados de C tropicalis (p<,5) Por outro lado, para a maioria dos isolados, a privação de ferro não determinou diferença significativa no potencial hemolítico em comparação à condição controle (meio RPMI 164, que também é escasso em ferro) No entanto, os índices de hemólise verificados na condição de privação foram inferiores aos constatados nos cultivos controle A presença de plasma na concentração 7% foi associada à diminuição do potencial hemolítico de todos os isolados (p<,5), porém em concentração inferior (3,8%), o plasma não interferiu no potencial hemolítico de C tropicalis A presença de eritrócitos, independentemente de sua concentração (7 ou 3,1%), determinou aumento da promoção de hemólise pela maioria dos isolados (p<,5) Por outro lado, em 7% de sangue total não foram verificadas diferenças no potencial hemolítico da maioria dos isolados Foi constatada filamentação diferencial de C tropicalis em presença de sangue total, eritrócitos ou plasma, porém não foi verificada correlação entre a diferenciação em formas filamentosas e a atividade hemolítica dessa espécie Os açúcares glicose, sacarose ou manose também determinaram aumento da hemólise promovida por C tropicalis (p<,5), de maneira dependente da concentração A síntese de transcritos de CtHMX1 foi influenciada pela privação de ferro e presença de hemoglobina; as duas situações determinaram indução da expressão do referido gene (p<,1) A presença de plasma das duas concentrações testadas (7 e 3,8%) não interferiu na expressão de HLPt, sendo o mesmo verificado em 7% de sangue para a maioria dos isolados Embora em presença de manose a maioria dos isolados tenha apresentado indução de HLPt (p<,1), o mesmo não foi verificado em presença de glicose e sacarose Os dados deste trabalho indicam que diferentes condições de cultivo influenciam de maneiras distintas a produção de fator hemolítico por C tropicalis e que CtHMX1 possivelmente tem um papel na aquisição de ferro do grupo heme por esta espécie; no entanto a expressão desse gene e a produção de fator hemolítico por C tropicalis parecem ser reguladas de maneira independente
Desenvolvimento e avaliação da ação de formulações contendo polissacarídeo deAdenanthera pavonina e mangiferina contra herpesvírus, in vivo
Rechenchoski, Daniele Zendrini; Linhares, Rosa Elisa Carvalho [Orientador]; Nozawa, Carlos; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Vespero, Eliana Carolina; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Galhardi, Ligia Carla Faccin [Coorientadora]
Resumo: A alta prevalência de infecções pelo vírus herpes simplex (HSV) e a emergência de cepas resistentes ao aciclovir têm estimulado a pesquisa e o desenvolvimento de novos agentes antivirais Neste contexto, os produtos naturais representam uma excelente fonte de descoberta de compostos bioativos com grande diversidade estrutural e química, capazes de apresentar múltiplos mecanismos de ação e, em geral, com baixa toxicidade A mangiferina é uma xantona glicosilada encontrada em muitas espécies de plantas, entre elas a mangueira (Mangifera indica) Adenanthera pavonina é uma árvore nativa da África e da Ásia, introduzida no Brasil para reflorestamento e indústria madeireira Ambas são tradicionalmente utilizadas para o tratamento de muitas doenças e possuem diversas atividades farmacológicas descritas cientificamente, inclusive atividade antiviral O objetivo deste estudo foi investigar a atividade anti-HSV-1 da mangiferina e do polissacarídeo sulfatado de A pavonina (SPAp), bem como, desenvolver formulações tópicas contendo estes compostos Duas cepas virais foram utilizadas, uma resistente (AR-29) e outra sensível (KOS) ao aciclovir A citotoxicidade dos compostos foi avaliada pelo método colorimétrico de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-difeniltetrazólio, em células Vero A atividade antiviral, in vitro, foi previamente realizada por ensaio de redução de plaque, utilizando diferentes protocolos de tratamento, tais como, tempo h, virucida e inibição da adsorção para mangiferina e simultâneo para SPAp A inibição da síntese da proteína ICP4 pela mangiferina também foi avaliada pelo ensaio de imunofluorescência As formulações tópicas foram desenvolvidas, contendo ,7% (p/p) de mangiferina e ,5% (p/p) de SPAp A atividade antiviral, in vivo, foi realizada em camundongos Balb/c infectados por escarificação da pele e tratados com estas formulações, quatro horas após a infecção, em intervalos de aproximadamente três horas, exceto a noite, durante oito a dez dias A análise histológica da pele dos animais também foi realizada As concentrações citotóxicas de 5% (CC5) foram acima de 5 µg/mL para mangiferina e de 47,81 µg/mL para SPAp As concentrações inibitórias 5% (CI5) para mangiferina foram de 2,9 µg/mL (Índice de seletividade - IS > 172,4) e 3,5 µg/mL (IS > 142,8), para as cepas AR-29 e KOS, respectivamente A mangiferina inibiu principalmente a cepa AR-29, por contato direto com o vírus, mas também foi capaz de interferir nos processos de adsorção e síntese de proteínas As CI5 encontradas para SPAp foram de ,54 µg/mL (IS = 88,5) e ,49 µg/mL (IS = 97,5), para as cepas AR-29 e KOS, respectivamente No ensaio antiviral, in vivo, os animais tratados com as formulações contendo mangiferina e SPAp apresentaram um atraso no desenvolvimento e na progressão das lesões de pele em comparação ao grupo controle Portanto, estas formulações exibiram atividade anti-herpética promissora, com ênfase na potencialidade da mangiferina no controle da infecção pela cepa AR-29, resistente ao aciclovir
Atividade antiviral de polissacarídeos isolados de Azadirachta indica na infecção por poliovírus e herpesvírus, in vitro
Galhardi, Lígia Carla Faccin; Nozawa, Carlos [Orientador]; Kawai, Juliana Galera Castilho; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Linhares, Elisa Carvalho; Rocha, Sérgio Paulo Dejato da
Resumo: O poliovírus (PV), agente etiológico da poliomielite, é um vírus não envelopado com genoma de RNA fita-simples, positiva Atualmente, a doença está controlada na maior parte dos países, mas, ainda é endêmica na África e Ásia Os herpesvírus são vírus envelopados, com DNA de fita-dupla e possuem uma ampla gama de hospedeiros, além de causarem infecções persistentes com possíveis reativações O herpesvírus bovino-1 (BoHV-1) produz diversas infecções, como, rinotraqueíte, vulvovaginite, balanopostite e infecções sistêmicas fatais O vírus herpes simplex-1 (HSV-1) ocasiona infecções em humanos, normalmente, benignas, porém, em indivíduos imunocomprometidos pode levar a infecção generalizada, encefalite e ceratoconjuntivite Além da importância médica e animal, esses agentes são modelos de vírus de RNA e DNA, para diversos estudos in vitro A Azadirachta indica (nim) tem sido amplamente utilizada etnofarmacologicamente para o tratamento de diversas doenças, entre elas as infecções virais, sendo algumas com base científica Neste trabalho avaliamos a atividade antiviral dos polissacarídeos (P1 e P2) e seus derivados químicos sulfatados (P1S e P2S), obtidos de A indica, na infecção por PV, BoHV-1 e HSV-1, em células HEp-2 A citotoxicidade foi avaliada pelo MTT, a atividade antiviral pelo ensaio de redução de plaques (PRA) e a inibição da síntese proteica viral pela reação de imunofluorescência (IF) A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi aplicada para estudar a inibição da síntese do DNA na replicação do HSV-1 Demonstramos que P1 e P1S inibiram a replicação do BoHV-1, com concentração inibitória 5% (CI5)/índice de seletividade (IS) de 15,2µg/ml/3,6 e 32,1µg/ml/>51,4, respectivamente, sendo P1S mais efetivo que P1 P1 e P1S demonstraram inibição dose-dependente na síntese proteica A maior inibição foi encontrada quando os compostos foram adicionados simultaneamente a infecção (tempo h) Os compostos testados exibiram efeito antiviral contra o PV, com CI5 de 8µg/ml (P1), 37,5µg/ml (P1S), 77,5µg/ml (P2) e 12,1µg/ml (P2S) e IS variando de 18-131,9, demonstrando também, melhor efeito inibitório no tempo h Quando testados contra HSV-1, P1S e P2S também exibiram melhor atividade antiviral no tempo h, com CI5/IS de 31,1µg/ml/> 51,4 e 8,5µg/ml/>19,8, respectivamente Os compostos apresentaram pequeno efeito profilático, cerca de 2% O P1S demonstrou melhor efeito inibitório de 91,8% em comparação com P1 (5%), P2 (71,1%) e P2S (7%) em 2µg/ml A inibição da síntese proteica foi dose-dependente, em concordância com os resultados de PRA Os polissacarídeos inibiram a síntese de DNA do HSV-1 em todas as concentrações testadas no PRA, para P1 e P1S, e até 5µg/ml, para P2 e P2S Neste caso, os grupos sulfatos de P1S e P2S não alteraram o efeito inibitório dos polissacarídeos originais Portanto, os nossos resultados demonstraram a atividade antiviral dos polissacarídeos de A indica contra PV, BoHV-1 e HSV-1 com ação nas fases iniciais da replicação, além da inibição da síntese proteica viral e ação virucida A inibição em etapas diferentes da infecção viral representa uma vantagem em relação aos antivirais convencionais que, normalmente, atuam em uma única etapa, com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes, além da inocuidade e de outros benefícios relatados
Taxonomia e diversidade genética de rizóbios microssimbiontes de distintas leguminosas com base na análise polifásica (Box-PCR e 16 S RNAr) e na metodologia de MLSA
Pereira, Pâmela Menna; Barcellos, Fernando Gomes [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes [Coorientador]
Resumo: O termo genérico “rizóbio” se aplica às bactérias capazes de fixar nitrogênio atmosférico (N2) e convertê-lo a uma forma assimilável pela planta, quando estas se encontram em simbiose com determinadas plantas da família Leguminosae Contudo, apesar da importância ecológica e econômica, os rizóbios têm sido relativamente pouco estudados Baseado nos dados de seqüenciamento do gene ribossomal 16S, existem, atualmente, cinco gêneros de rizóbios descritos, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium (=Ensifer) e Mesorhizobium, todos pertencentes à subclasse alfa das Proteobacterias Além disso, existem outras bactérias recentemente descritas e também denominadas como rizóbios, por serem microssimbiontes de leguminosas, e que pertencem a gêneros bastante distintos, tanto na subclasse alfa (Devosia, Methylobacterium), como na subclasse beta (Ralstonia, Burkholderia) Embora o gene ribossomal 16S seja hoje a molécula mais utilizada para estimar relações filogenéticas em procariotos, a elevada conservação na seqüência nucleotídica deste gene observada entre diferentes grupos bacterianos é uma limitação para a determinação das espécies Assim, vários estudos vêm sendo conduzidos, a fim de determinar metodologias alternativas para estudos de diversidade, bem como filogenia e taxonomia rizobiana Uma metodologia amplamente utilizada em estudos de diversidade tem sido a técnica de BOX-PCR Com base nessa técnica, é possível obter, através de reações de PCR, perfis genômicos de bactérias Por outro lado, recentemente foi proposta a metodologia de MLSA (“multi locus sequencing analysis”), como uma nova estratégia para os estudos de filogenia e taxonomia em procariontes Tendo em vista a elevada diversidade genética de rizóbios tropicais ainda pouco estudada, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a diversidade genética de estirpes de rizóbios simbiontes de distintas leguminosas de importância agrícola e ambiental, e avaliar o potencial das metodologias de BOX-PCR e MLSA em estudos de diversidade, filogenia e taxonomia Em um primeiro estudo, o dendrograma resultante do BOX-PCR de 68 SEMIAs isoladas de 47 distintas leguminosas apresentou uma baixa correlação (7,6%) com à árvore filogenética construída com o gene ribossomal 16S Todavia, quando uma análise polifásica utilizando BOX-PCR e as seqüências do gene ribossomal 16S foi analisada em uma proporção de 2:8 (proporção para o peso relativo de cada análise, 16SrRNA:BOX-PCR), foi possível observar agrupamentos com elevada similaridade (9%) aos grupos taxonômicos propostos pela arvore filogenética do gene ribossomal 16S Em um segundo estudo utilizando a metodologia de MLSA com os genes 16S RNAr, atpD, dnaK, glnII, recA e a região ITS, em uma coleção de estirpes de 169 Bradyrhizobium isoladas de 43 distintas leguminosas, foi possível observar a divisão de doisgrupos bem definidos, sendo que o primeiro incluiu as estirpes tipo de B japonicum, B betae, B liaoningense, B canariense, B yuanmingense e B japonicum USDA 11, já o segundo grupo incluiu estirpes relacionadas à B elkanii USDA 76T Uma elevada variabilidade foi observada no gene atpD, sendo que cinco estirpes relacionadas à B elkanii apresentaram uma variabilidade ainda não constatada para esse gene Outra importante observação foi que o grupo composto pelas estirpes USDA 11, SEMIAs 58 e 659 de B japonicum, todas isoladas de soja, foram sempre reunidas em todas as seis árvores construídas e formaram um grupo distinto do agrupamento formado pela estirpe tipo de B japonicum USDA 6T Desse modo, foi observado que tanto a análise polifásica, utilizando BOX-PCR e as seqüências do gene ribossomal 16S, quanto a técnica de MLSA possibilitaram acessar a diversidade genética em rizóbios bem como determinar relações filogenéticas e identificar possíveis novas espécies de rizóbios
Avaliação citológica e da atividade antimicrobiana em camundongos do composto produzido por Pseudomonas aeruginosa cepa LV sobre isolados clínicos multirresistentes
Navarro, Miguel Octavio Pérez; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Celligoi, Maria Antonia Pedrine Colabone; Crhyssafidis, Andréas Lázaros; Medeiros, Daniela Cristina de; Araújo, Welington Luiz de; Oliveira Júnior, Admilton Gonçalves de [Coorientador]
Resumo: O surgimento de organismos multirresistentes (MR) aumenta mais rápido que o desenvolvimento de novos compostos antimicrobianos, causando uma crise na saúde pública mundial Neste estudo o desenvolvimento de um composto antimicrobiano foi realizado, avaliando o risco de resistência da molécula e o seu potencial de ser um novo fármaco Um composto organocúprico antibiótico (OAC) foi avaliado contra isolados clínicos MR, in vitro e in vivo OAC foi produzido em cultura submersa de Pseudomonas aeruginosa cepa LV, purificado por cromatografia liquida de absorção e identificado por analises espectrométricos A bioatividade, risco de resistência, toxicidade e eficácia foram determinadas OAC foi identificado como fluopsina C com MIC´s e MBC´s <2 µgmL-1e baixas frequências de resistência Os camundongos tratados com uma única dose de 2 mgKg-1 e duas doses de 1 mgKg-18h-1 de fluopsina C, apresentaram uma dose protetiva (DP5) em 72 horas após os tratamentos A substância fluopsina C produziu alterações moderadas no fígado, porém não apresentou nefrotoxicidade nos camundongos Este novo estudos fornecem resultados que possibilitam a ideia de continuar avaliando fluopsina C para o desenvolvimento de um novo fármaco com atividade antimicrobiana
Sequenciamento e montagem de novo do genoma total de Pseudomonas aeruginosa cepa LV e análise da expressão gênica temporal e diferencial na presença de cobre
Simionato, Ane Stéfano; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Souza, Rogério Fernandes de; Pileggi, Marcos; Araújo, Welington Luiz de
Resumo: Pseudomonas aeruginosa é amplamente dispersa na natureza, devido principalmente à sua alta capacidade adaptativa Dentre as diversas estratégias de adaptação está a produção de metabólitos bioativos que podem inibir o crescimento ou metabolismo de outros microrganismos P aeruginosa cepa LV produz diversos compostos bioativos, entre eles um composto organometálico, identificado como Fluopsina C, produzido somente na presença de cobre, que apresenta alto potencial biotecnológico Entretanto, poucos são os relatos sobre esta molécula, não havendo informações relacionadas à sua biossíntese e rota metabólica O objetivo deste trabalho foi realizar o sequenciamento completo do genoma de P aeruginosa cepa LV e realizar a análise da expressão temporal dos genes diferencialmente expressos pela presença/ausência de cobre, afim de melhor compreender a biossíntese da Fluopsina C Para isso, a cepa foi cultivada em ágar nutriente overnight e após a extração do DNA total do microrganismo foi realizado o sequenciamento pela plataforma Illumina MiSeq e o genoma foi montado pela estratégia de novo, filtrado, trimado e anotado O genoma de P aeruginosa cepa LV é constituído por 6468334 pb e, possue 14 grupos de genes putativos responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, 7 genes de resistência e 3 arranjos CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Regularly Short Palindromic Repeats) A análise da expressão temporal foi realizada por PCR em tempo real e com pontos de análise em 24 horas, 4 e 7 dias Foram estudados nove genes hiperexpressos na presença de cobre, divididos em três classes: transportadores de metais, reguladores de expressão e biossíntese de fenazina e proteínas hipotéticas Os resultados obtidos validam as hipóteses geradas em trabalhos anteriores com relação a eliminação do cobre através de efluxo e transportadores ATPases Além disso, sugerimos uma nova hipótese com relação a via de biossíntese da Fluopsina C, relacionando a produção de compostos fenazínicos ao percursor da molécula, a tioformina

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