01 - Doutorado - Microbiologia
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Item Resistência a nanopartícula de prata : análise fenotípica e genotípica em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae(2020-09-28) Figueiredo, Érica Pelegrin; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nishio, Erick Kenji; Cyoia, Paula Signolfi; Gazal, Luís Eduardo de SouzaAs infecções causadas por microrganismos resistentes aos antimicrobianos, uma preocupação mundial, são responsáveis por aumentar o tempo de internação dos pacientes afetados, elevando o custo dos tratamentos e aumentando a taxa de morbimortalidade. Os metais têm sido usados desde a antiguidade como agentes antibacterianos e apresentam diferentes propriedades e espectros de ação. Dentre os metais, a prata é um dos mais utilizados devido à sua eficiência como antimicrobiano e sua baixa toxicidade. Com o advento da nanotecnologia na área médica, as nanopartículas de prata (AgNP) passaram a ser amplamente estudadas por sua ação antimicrobiana, inclusive contra bactérias multirresistentes. Em nosso estudo, avaliamos a alteração fenotípica e genotípica em cepas de bactérias Gram-negativas contra a exposição prolongada a subdoses de nanopartículas de prata sintetizadas biologicamente (AgNPbio). AgNPbio foi sintetizada biologicamente por utilizando extrato de Fusarium oxysporum. Após exposição prolongada, foi possível observar alteração na Concentração Inibitória Mínima (CIM) em 7 cepas bacterianas. Após o ensaio de indução, 3 cepas bacterianas apresentaram alteração na sensibilidade colateral e resistência cruzada frente a antimicrobianos convencionais. Nossos resultados mostraram uma atenção necessária na exposição prolongada de AgNPbio contra cepas bacterianas.Item Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas(2021-03-31) Souza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Pavanelli, Wander Rogério; Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson JoséO ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.Item Efeito das nanopartículas de prata biogënicas sobre os fatores de virulência e sistema quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa(2021-06-07) Saeki, Erika Kushikawa; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Garcia, Doroti de Oliveira; Eller, Lizziane Kretli WinkelströterO estudo dos compostos com atividade antivirulência para o controle da patogenicidade bacteriana estão em destaque na literatura atual. Dentre estes compostos, as nanopartículas de prata são cada vez mais pesquisadas para o controle da disseminação das infecções por P. aeruginosa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das nanopartículas de prata biogênicas (bio-AgNP) nos fatores de virulência e Sistema Quorum Sensing (QS) em Pseudomonas aeruginosa. As bio AgNPs foram sintetizadas pelo método de redução da prata iônica pelo fungo Fusarium oxysporum e os ensaios foram realizados com isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa e com as cepas de referência PAO1 e PA14. A identificação dos isolados foi realizada por métodos bioquímicos e moleculares e foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM). Os ensaios para avaliar a produção de fatores de virulência (motilidade, ramnolipídeos, protease alcalina, elastase e piocianina) e capacidade de formação de biofilmes foram realizados. O ensaio de RT-qPCR foi realizado para determinar o efeito da bio-AgNP nos genes reguladores de QS (lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsA e mvfR). As CIM variaram de 15,62-62,50 µM, e a CBM foi de 125 µM para PAO1 e PA14. Os resultados mostraram que as concentrações subinibitórias (1/2 CIM) de bio-AgNP (7,81 a 31,25 µM) aumentaram significativamente (p < 0,050) as motilidades swarming, swimming e twitching, em 40,0%, 40,0% e 46,7% nos isolados clínicos e ambientais, respectivamente. Observou-se que a bio-AgNP aumentou significativamente (p < 0,050) a capacidade de formação de biofilmes em um isolado de paciente com fibrose cística. O tratamento com as concentrações subinibitórias de bio-AgNPs em PAO1 não afetou a produção de protease e biofilme. Entretanto, houve redução significativa (p < 0,05) na motilidade e na produção de ramnolipídeos e elastase. Na cepa PA14 houve estímulo na motilidade swarming e twitching, além da produção de elastase, piocianina e formação de biofilme. Os tratamentos com bio-AgNPs também aumentaram a expressão (p < 0,05) dos genes controladores do sistema QS em P. aeruginosa PAO1 e PA14. Conclui-se que o tratamento com concentrações subinibitórias de bio-AgNPs favoreceu o aumento fenotípico na maioria dos fatores de virulência testados. As cepas PAO1 e PA14 apresentaram diferentes respostas ao tratamento com as bio-AgNPs. A exposição bacteriana as baixas concentrações de bio-AgNPs pode promover o aumento na expressão dos genes reguladores do Sistema QS em P. aeruginosa. Por isso, a aplicação das bio-AgNP na terapia antibiofilme e antivirulência precisa ser avaliada com cautela, para que os compostos sejam utilizados na concentração adequada, o sistema QS seja definitivamente interrompido e os fatores de virulência sejam controlados.Item Switching fenotípico em Candida tropicalis : alterações na resposta celular e fagocitose frente a estresses oxidativo e osmótico(2021-12-20) Perini, Hugo Felix; Furlaneto, Márcia Cristina; Furlaneto-Maia, Luciana; França, Emanuele Júlio Galvão de; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Grasi, Melyssa Fernanda NegriSwitching fenotípico em Candida tropicalis promove alterações na manifestação de virulência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Uma vez que o evento pode estar relacionado com alterações na resposta adaptativa, o objetivo do presente trabalho foi availiar o papel do Switching fenotípico na resposta ao estresse osmótico e oxidativo. Para tal, dois sistemas de Switching fenotípico de C. tropicalis (49.07 e 100.10) compostos de cinco morfotipos cada (Parental, Crepe, Rugoso, Revertente de Rugoso e Revertente de Crepe) foram expostos à 1 M de NaCl e 5 mM de H2O2 por 10 e 60 min. Análises de resitência ao estresse foram realizadas por contagem de UFC após exposição e o dano em membrana com ensaio de iodeto de propídio. Análises de expressão dos genes HOG1, EFG1 e WOR1 foram realizadas por qPCR e a quantidade de componentes de parede por ensaio fluorimétrico. Análizou-se também, o efeito do Switching sobre a fagocitose e perfil de filamentação no contato com hemócitos e macrófagos e o efeito da pré-exposição ao H2O2 nessas variáveis. Respostas de alterações na parede celular, expressão dos genes testados e resistência ao estresse foram sistemas-dependente, não apresentando relação direta com o padrão morfológico do morfotipo. Variantes morfológicos (Crepe e Rugoso - 100.10) apresentaram menor e complexidade celular que o Parental, assim como alterações na quantidade de manana e na porosidade da parede. Revertentes morfológicos também apresentam maior quantidade de quitina, β-glucana e porosidade que o Parental. Em resposta ao estresse, 62,5% dos morfotipos derivados de Switching foram mais resistentes ao choque osmótico (10 min) e 25% à osmoadaptação (60 min). Sob estresse oxidativo 37,5% apresentaram maior viabilidade que o parental após 10 min, e 25% sob estresse prolongado (60 min). O morfotipo Crepe destacou-se como morfotipo com maior capacidade de resposta aos estresses testados. Esse morfotipo apresentou menor decréscimo no volume celular sob estresse osmótico e aumento de quitina e manana na parede celular. Sob estresse prolongado HOG1 manteve alta expressão nesse morfotipo (49.07). Sob estresse oxidativo Crepe teve alta expressão de todos os genes testados. Hemócitos e macrófagos apresentaram mesmo perfil de fagocitose. Crepe foi mais fagocitado que Parental, no entanto, houve redução no número de células do morfotipo fagocitadas após pré-exposição ao H2O2. Crepe apresentou alta capacidade de formação de hifas verdadeiras em co-cultivo com os fagócitos. A pré-exposição ao H2O2 promoveu regulação positiva de WOR1 e HOG1 em Crepe (49.07). Células de Crepe pré expostas apresentaram maior quantidade de quitina (100.10) e maior porosidade (ambos os sistemas) que o parental. O presente trabalho pode concluir que switching fenotípico promove alteração do fitness celular e consequentemente resposta alterada aos estresses osmótico e oxidativo em C. tropicalis, refletidas na regulação gênica, alterações da parede celular e na capacidade de morfogênese.Item Candida não-albicans : avaliação de fatores de virulência e perfil no estudo epidemiológico de candidúriaOliveira, Marcelo Tempesta de; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Furlaneto-Maia, Luciana; Venâncio, Emerson José; Andrade, Célia Guadalupe Tardeli de JesusResumo: Leveduras do gênero Candida estão entre os principais patógenos causadores de infecções nosocomiais em todo o mundo Desta forma, este trabalho teve como objetivo estabelecer o perfil epidemiológico da candidúria no HU de Londrina/PR entre os anos de 26 e 27, classificar a extensão da candidúria em diferentes níveis e identificar fatores de risco específicos para o isolamento de espécies de Candida não-albicans Foram incluídos no estudo isolados clínicos de Candida spp obtidos de indivíduos urocultura positivos cuja detecção foi = 12 UFC mL-1 Também foi realizada a análise comparativa ultraestrutural da interação de diferentes morfotipos de C parapsilosis com a superficie de unha e cabelo humanos pelo emprego da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a avaliação da expressão dos genes SAPs de 15 isolados clínicos de C tropicalis em resposta aos substratos BSA e hemoglobina pela técnica de PCR em tempo real Um total de 157 isolados de Candida foi obtido, incluindo C albicans (n=72), C tropicalis (n=54), C glabrata (n=2), C parapsilosis (n=8), C krusei (n=2) e C dubliniensis (n=1) A extensão da candidúria foi classificada em tres diferentes níveis: nível 1 (candidúria leve), nível 2 (candidúria de risco) e nível 3 (candidúria pesada) Houve diferença significativa entre a freqüência de isolamento de C albicans e espécies não-albicans em relação aos diferentes níveis de candidúria estabelecidos neste estudo, evidenciando a candidúria nível 3 (candidúria pesada) como um fator de risco independente para o isolamento de espécies não-albicans A MEV revelou que as células do fenótipo -smooth? de C parapsilosis aderem em maior número em ambas as superfícies em relação aos observados para o fenótipo -crepe? Diferentes perfis na qualidade e quantidade de produção de matriz extracelular entre os dois morfotipos de C parapsilosis também foram observados A avaliação da expressão dos genes SAPs de C tropicalis mostrou que as condições de cultivo testadas proporcionaram a indução significativa dos genes SAPT1, SAPT2 e SAPT3 em relação à situação controle (ausência de substrato), cujo perfil de expressão variou qualitativa e quantitativamente de acordo com o substrato utilizado e os diferentes isolados Pode-se concluir que a contagem de UFC mL-1 de urina e subseqüente classificação da extensão da candidúria em diferentes níveis pode ser utilizada como marcador de isolamento de espécies de Candida não-albicans Conclui-se também que diferentes substratos influenciam a expressão diferencial de genes relacionados à morfologia, adesão e produção de matriz extracelular de C parapsilosis, assim como genes de virulência (SAPs) de C tropicalis, respostas estas que também se mostraram linhagem-dependente, não relacionadas ao sítio de isolamentoItem Dosagem de imunoglobulinas IgG e IgE totais e específicas, proteínas séricas, HDL colesterol e imunocomplexos na paracoccidioidomicose aguda e crônicaMarquez, Audrey de Souza; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Mendes, Nelson Figueiredo; Furlaneto, Márcia Cristina; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson JoséResumo: A Paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccodioides brasiliensis, apresenta duas formas clínicas distintas: forma aguda (AF) e forma crônica (CF) A AF ocorre principalmente em indivíduos jovens e é mais grave e rara enquanto que a CF acomete, sobretudo, homens adultos e em geral de forma menos grave Os casos de maior gravidade relacionam-se com a depressão da resposta imune celular, a ativação policlonal de células B e o desvio da resposta imune para Th2 Diversos componentes solúveis liberados pelo fungo, como a gp-43, assim como a presença de imuno complexos circulantes tem sido associados ao desvio de resposta e maior gravidade da PCM O objetivo do presente trabalho foi determinar marcadores moleculares de diferenciação entre as duas formas da doença Considerando as dificuldades em se estabelecer rotinas sorológicas simples, rápidas e com antígenos padronizados para o diagnóstico laboratorial ambulatorial da PCM e acompanhamento de tratamento, realizou-se inicialmente a correlação das alterações observadas nas frações de eletroforese de proteínas com a dosagem de IgG e IgE totais e HDL colesterol Foram analisadas 3 amostras de soros de pacientes com CF PCM, 12 de AF PCM e 44 de doadores normais (NHS) por eletroforese e por ensaio imunoenzimático (ELISA) Na segunda etapa foram investigados os níveis séricos de IgG e IgE total e específicas, IC IgG-IgE e IC IgG-gp43 através de ELISA em soro de pacientes com CF PCM (22), AF PCM (12) e NHS (29) Os resultados demonstraram alterações nas frações de proteínas e que existem correlações positivas entre a fração beta e gama-globulinas ou alfa-1 globulinas, gama e alfa-1 globulinas e entre gama-globulinas e níveis de IgE total Concluímos pelo trabalho que existem diferenças entre as duas formas por alterações nas frações alfa-1 e gama globulinas e que existe diferença na interpretação dos resultados de albumina quando analisados em porcentagem ou níveis absolutos e que o HDL colesterol não contribui para as elevações observadas na fração alfa-1 globulinas na PCM Os resultados também confirmam que os níveis séricos elevados de IgG e IgE total e IgG e IgE específicas e IC IgG-gp43 estão associados com a forma mais grave da doença e este trabalho introduz pela primeira vez a presença de IgG-IgE IC diferenciando a forma aguda da PCM da crônicaItem Genômica e diversidade de Rhizobium Tropici, uma espécie tropical microssimbionte do feijoeiro Phaseolus Vulgaris LPinto, Fabiana Gisele da Silva; Hungria, Mariangela [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Furlaneto, Márcia Cristina; Andrade, Diva de Souza; Nicolás, Marisa FabianaResumo: O Brasil é o maior produtor e consumidor mundial de feijão (Phaseolus vulgaris L) O rendimento médio nacional é bastante baixo, devido, principalmente, ao baixo nível de tecnologia empregado na cultura, ao cultivo em solos de baixa fertilidade, especialmente pobres em N Conseqüentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose com bactérias diazotróficas, representa uma alternativa para aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, contudo, problemas relacionados à nodulação e fixação do N2 com as estirpes nativas dos solos são relatados com freqüência Neste trabalho foram conduzidos dois estudos, sendo que no primeiro foi realizada à caracterização de diversidade genética, pela avaliação de genes simbióticos e não simbióticos, de estirpes de Rhizobium tropici, com alta capacidade de fixação do N2 em condições tropicais e isoladas de quatro regiões brasileiras A técnica de PCR-RFLP dos genes ribossomais 16S e 23S e a análise do seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiram a identificação de dois grupos, um relacionado às estirpes de R tropici tipo A e outro às de R tropici tipo B A diversidade dos genes ribossomais foi elevada, indicando que as estirpes do tipo A podem representar uma nova espécie Além disso, foi constatada diversidade genética intraespecífica elevada, pela análise por rep-PCR com os -primers" BOX, ERIC e REP Contudo, na análise de PCR-RFLP dos genes simbióticos, nifH e nodC, todas as estirpes de R tropici apresentaram uma única combinação de perfis, o que pode refletir uma estratégia evolucionária dessas estirpes para a maximização da fixação de N2 No segundo estudo foi realizado o seqüenciamento e a bioprospecção parcial de genes da estirpe PRF 81 (=SEMIA 48) de R tropici, altamente eficiente no processo de fixação do N2 e recomendada para o uso de inoculantes comerciais no Brasil O genoma dessa estirpe foi estimado em 7,85 Mb, pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) Foram obtidas 2192 CDSs, sendo classificadas como válidas (1255), hipotéticas conservadas (668) ou hipotéticas (269) A estratégia de panorama genômico, para a obtenção de genoma parcial, mostrou-se viável e eficiente, uma vez que foram identificados genes putativos na maioria das classes funcionais dos bancos de dados KEGG e COG Foram identificados genes do metabolismo de aminoácidos, carboidratos e lipídeos, bem como relacionados à biodegradação, quimiotaxia e, provavelmente, a mecanismos de infecção, com ênfase em genes relacionados aos sistemas de secreção dos tipos II e III Além disso, foram identificados genes relacionados à capacidade competitiva, saprofítica e ao processo de fixação biológica do N2 A estratégia de panorama genômico utilizada na estirpe PRF 81 indicou um mosaico de similaridade com diversos outros rizóbios Além disso, foram identificados alguns genes promissores para manipulações futuras visando obter incrementos no processo de fixação biológica do N2, não só com o feijoeiro, como em outras leguminosasItem Avaliação da atividade hemolítica e expressão de possíveis genes relacionados à aquisição de ferro em Candida tropicalisFrança, Emanuele Julio Galvão de; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Furlaneto-Maia, Luciana; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Panagio, Luciano AparecidoResumo: No Brasil e em outras regiões de clima tropical, Candida tropicalis é uma das principais espécies relacionadas a episódios de candidemia, provocando elevados índices de morbi-mortalidade A produção de fator hemolítico é reconhecida como um possível atributo de patogenicidade dessa espécie, no entanto, tem sido alvo de poucos estudos Neste trabalho foi avaliado o efeito de diferentes condições de cultivo na produção de fator hemolítico e na expressão de dois genes possivelmente relacionados à aquisição de ferro do grupo heme de C tropicalis - CtHMX1, que possivelmente codifica uma heme-oxigenase e HLPt, que apresenta um papel na determinação da atividade hemolítica dessa espécie Foi verificado que o potencial hemolítico de C tropicalis é influenciado pelas condições ambientais Hemoglobina ou eritrócitos, que representam potenciais fontes de ferro, determinaram o aumento da hemólise promovida pela maioria dos isolados de C tropicalis (p<,5) Por outro lado, para a maioria dos isolados, a privação de ferro não determinou diferença significativa no potencial hemolítico em comparação à condição controle (meio RPMI 164, que também é escasso em ferro) No entanto, os índices de hemólise verificados na condição de privação foram inferiores aos constatados nos cultivos controle A presença de plasma na concentração 7% foi associada à diminuição do potencial hemolítico de todos os isolados (p<,5), porém em concentração inferior (3,8%), o plasma não interferiu no potencial hemolítico de C tropicalis A presença de eritrócitos, independentemente de sua concentração (7 ou 3,1%), determinou aumento da promoção de hemólise pela maioria dos isolados (p<,5) Por outro lado, em 7% de sangue total não foram verificadas diferenças no potencial hemolítico da maioria dos isolados Foi constatada filamentação diferencial de C tropicalis em presença de sangue total, eritrócitos ou plasma, porém não foi verificada correlação entre a diferenciação em formas filamentosas e a atividade hemolítica dessa espécie Os açúcares glicose, sacarose ou manose também determinaram aumento da hemólise promovida por C tropicalis (p<,5), de maneira dependente da concentração A síntese de transcritos de CtHMX1 foi influenciada pela privação de ferro e presença de hemoglobina; as duas situações determinaram indução da expressão do referido gene (p<,1) A presença de plasma das duas concentrações testadas (7 e 3,8%) não interferiu na expressão de HLPt, sendo o mesmo verificado em 7% de sangue para a maioria dos isolados Embora em presença de manose a maioria dos isolados tenha apresentado indução de HLPt (p<,1), o mesmo não foi verificado em presença de glicose e sacarose Os dados deste trabalho indicam que diferentes condições de cultivo influenciam de maneiras distintas a produção de fator hemolítico por C tropicalis e que CtHMX1 possivelmente tem um papel na aquisição de ferro do grupo heme por esta espécie; no entanto a expressão desse gene e a produção de fator hemolítico por C tropicalis parecem ser reguladas de maneira independenteItem Desenvolvimento e avaliação da ação de formulações contendo polissacarídeo deAdenanthera pavonina e mangiferina contra herpesvírus, in vivoRechenchoski, Daniele Zendrini; Linhares, Rosa Elisa Carvalho [Orientador]; Nozawa, Carlos; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Vespero, Eliana Carolina; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Galhardi, Ligia Carla Faccin [Coorientadora]Resumo: A alta prevalência de infecções pelo vírus herpes simplex (HSV) e a emergência de cepas resistentes ao aciclovir têm estimulado a pesquisa e o desenvolvimento de novos agentes antivirais Neste contexto, os produtos naturais representam uma excelente fonte de descoberta de compostos bioativos com grande diversidade estrutural e química, capazes de apresentar múltiplos mecanismos de ação e, em geral, com baixa toxicidade A mangiferina é uma xantona glicosilada encontrada em muitas espécies de plantas, entre elas a mangueira (Mangifera indica) Adenanthera pavonina é uma árvore nativa da África e da Ásia, introduzida no Brasil para reflorestamento e indústria madeireira Ambas são tradicionalmente utilizadas para o tratamento de muitas doenças e possuem diversas atividades farmacológicas descritas cientificamente, inclusive atividade antiviral O objetivo deste estudo foi investigar a atividade anti-HSV-1 da mangiferina e do polissacarídeo sulfatado de A pavonina (SPAp), bem como, desenvolver formulações tópicas contendo estes compostos Duas cepas virais foram utilizadas, uma resistente (AR-29) e outra sensível (KOS) ao aciclovir A citotoxicidade dos compostos foi avaliada pelo método colorimétrico de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-difeniltetrazólio, em células Vero A atividade antiviral, in vitro, foi previamente realizada por ensaio de redução de plaque, utilizando diferentes protocolos de tratamento, tais como, tempo h, virucida e inibição da adsorção para mangiferina e simultâneo para SPAp A inibição da síntese da proteína ICP4 pela mangiferina também foi avaliada pelo ensaio de imunofluorescência As formulações tópicas foram desenvolvidas, contendo ,7% (p/p) de mangiferina e ,5% (p/p) de SPAp A atividade antiviral, in vivo, foi realizada em camundongos Balb/c infectados por escarificação da pele e tratados com estas formulações, quatro horas após a infecção, em intervalos de aproximadamente três horas, exceto a noite, durante oito a dez dias A análise histológica da pele dos animais também foi realizada As concentrações citotóxicas de 5% (CC5) foram acima de 5 µg/mL para mangiferina e de 47,81 µg/mL para SPAp As concentrações inibitórias 5% (CI5) para mangiferina foram de 2,9 µg/mL (Índice de seletividade - IS > 172,4) e 3,5 µg/mL (IS > 142,8), para as cepas AR-29 e KOS, respectivamente A mangiferina inibiu principalmente a cepa AR-29, por contato direto com o vírus, mas também foi capaz de interferir nos processos de adsorção e síntese de proteínas As CI5 encontradas para SPAp foram de ,54 µg/mL (IS = 88,5) e ,49 µg/mL (IS = 97,5), para as cepas AR-29 e KOS, respectivamente No ensaio antiviral, in vivo, os animais tratados com as formulações contendo mangiferina e SPAp apresentaram um atraso no desenvolvimento e na progressão das lesões de pele em comparação ao grupo controle Portanto, estas formulações exibiram atividade anti-herpética promissora, com ênfase na potencialidade da mangiferina no controle da infecção pela cepa AR-29, resistente ao aciclovirItem Atividade antiviral de polissacarídeos isolados de Azadirachta indica na infecção por poliovírus e herpesvírus, in vitroGalhardi, Lígia Carla Faccin; Nozawa, Carlos [Orientador]; Kawai, Juliana Galera Castilho; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Linhares, Elisa Carvalho; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: O poliovírus (PV), agente etiológico da poliomielite, é um vírus não envelopado com genoma de RNA fita-simples, positiva Atualmente, a doença está controlada na maior parte dos países, mas, ainda é endêmica na África e Ásia Os herpesvírus são vírus envelopados, com DNA de fita-dupla e possuem uma ampla gama de hospedeiros, além de causarem infecções persistentes com possíveis reativações O herpesvírus bovino-1 (BoHV-1) produz diversas infecções, como, rinotraqueíte, vulvovaginite, balanopostite e infecções sistêmicas fatais O vírus herpes simplex-1 (HSV-1) ocasiona infecções em humanos, normalmente, benignas, porém, em indivíduos imunocomprometidos pode levar a infecção generalizada, encefalite e ceratoconjuntivite Além da importância médica e animal, esses agentes são modelos de vírus de RNA e DNA, para diversos estudos in vitro A Azadirachta indica (nim) tem sido amplamente utilizada etnofarmacologicamente para o tratamento de diversas doenças, entre elas as infecções virais, sendo algumas com base científica Neste trabalho avaliamos a atividade antiviral dos polissacarídeos (P1 e P2) e seus derivados químicos sulfatados (P1S e P2S), obtidos de A indica, na infecção por PV, BoHV-1 e HSV-1, em células HEp-2 A citotoxicidade foi avaliada pelo MTT, a atividade antiviral pelo ensaio de redução de plaques (PRA) e a inibição da síntese proteica viral pela reação de imunofluorescência (IF) A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi aplicada para estudar a inibição da síntese do DNA na replicação do HSV-1 Demonstramos que P1 e P1S inibiram a replicação do BoHV-1, com concentração inibitória 5% (CI5)/índice de seletividade (IS) de 15,2µg/ml/3,6 e 32,1µg/ml/>51,4, respectivamente, sendo P1S mais efetivo que P1 P1 e P1S demonstraram inibição dose-dependente na síntese proteica A maior inibição foi encontrada quando os compostos foram adicionados simultaneamente a infecção (tempo h) Os compostos testados exibiram efeito antiviral contra o PV, com CI5 de 8µg/ml (P1), 37,5µg/ml (P1S), 77,5µg/ml (P2) e 12,1µg/ml (P2S) e IS variando de 18-131,9, demonstrando também, melhor efeito inibitório no tempo h Quando testados contra HSV-1, P1S e P2S também exibiram melhor atividade antiviral no tempo h, com CI5/IS de 31,1µg/ml/> 51,4 e 8,5µg/ml/>19,8, respectivamente Os compostos apresentaram pequeno efeito profilático, cerca de 2% O P1S demonstrou melhor efeito inibitório de 91,8% em comparação com P1 (5%), P2 (71,1%) e P2S (7%) em 2µg/ml A inibição da síntese proteica foi dose-dependente, em concordância com os resultados de PRA Os polissacarídeos inibiram a síntese de DNA do HSV-1 em todas as concentrações testadas no PRA, para P1 e P1S, e até 5µg/ml, para P2 e P2S Neste caso, os grupos sulfatos de P1S e P2S não alteraram o efeito inibitório dos polissacarídeos originais Portanto, os nossos resultados demonstraram a atividade antiviral dos polissacarídeos de A indica contra PV, BoHV-1 e HSV-1 com ação nas fases iniciais da replicação, além da inibição da síntese proteica viral e ação virucida A inibição em etapas diferentes da infecção viral representa uma vantagem em relação aos antivirais convencionais que, normalmente, atuam em uma única etapa, com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes, além da inocuidade e de outros benefícios relatadosItem Taxonomia e diversidade genética de rizóbios microssimbiontes de distintas leguminosas com base na análise polifásica (Box-PCR e 16 S RNAr) e na metodologia de MLSAPereira, Pâmela Menna; Barcellos, Fernando Gomes [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes [Coorientador]Resumo: O termo genérico “rizóbio” se aplica às bactérias capazes de fixar nitrogênio atmosférico (N2) e convertê-lo a uma forma assimilável pela planta, quando estas se encontram em simbiose com determinadas plantas da família Leguminosae Contudo, apesar da importância ecológica e econômica, os rizóbios têm sido relativamente pouco estudados Baseado nos dados de seqüenciamento do gene ribossomal 16S, existem, atualmente, cinco gêneros de rizóbios descritos, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium (=Ensifer) e Mesorhizobium, todos pertencentes à subclasse alfa das Proteobacterias Além disso, existem outras bactérias recentemente descritas e também denominadas como rizóbios, por serem microssimbiontes de leguminosas, e que pertencem a gêneros bastante distintos, tanto na subclasse alfa (Devosia, Methylobacterium), como na subclasse beta (Ralstonia, Burkholderia) Embora o gene ribossomal 16S seja hoje a molécula mais utilizada para estimar relações filogenéticas em procariotos, a elevada conservação na seqüência nucleotídica deste gene observada entre diferentes grupos bacterianos é uma limitação para a determinação das espécies Assim, vários estudos vêm sendo conduzidos, a fim de determinar metodologias alternativas para estudos de diversidade, bem como filogenia e taxonomia rizobiana Uma metodologia amplamente utilizada em estudos de diversidade tem sido a técnica de BOX-PCR Com base nessa técnica, é possível obter, através de reações de PCR, perfis genômicos de bactérias Por outro lado, recentemente foi proposta a metodologia de MLSA (“multi locus sequencing analysis”), como uma nova estratégia para os estudos de filogenia e taxonomia em procariontes Tendo em vista a elevada diversidade genética de rizóbios tropicais ainda pouco estudada, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a diversidade genética de estirpes de rizóbios simbiontes de distintas leguminosas de importância agrícola e ambiental, e avaliar o potencial das metodologias de BOX-PCR e MLSA em estudos de diversidade, filogenia e taxonomia Em um primeiro estudo, o dendrograma resultante do BOX-PCR de 68 SEMIAs isoladas de 47 distintas leguminosas apresentou uma baixa correlação (7,6%) com à árvore filogenética construída com o gene ribossomal 16S Todavia, quando uma análise polifásica utilizando BOX-PCR e as seqüências do gene ribossomal 16S foi analisada em uma proporção de 2:8 (proporção para o peso relativo de cada análise, 16SrRNA:BOX-PCR), foi possível observar agrupamentos com elevada similaridade (9%) aos grupos taxonômicos propostos pela arvore filogenética do gene ribossomal 16S Em um segundo estudo utilizando a metodologia de MLSA com os genes 16S RNAr, atpD, dnaK, glnII, recA e a região ITS, em uma coleção de estirpes de 169 Bradyrhizobium isoladas de 43 distintas leguminosas, foi possível observar a divisão de doisgrupos bem definidos, sendo que o primeiro incluiu as estirpes tipo de B japonicum, B betae, B liaoningense, B canariense, B yuanmingense e B japonicum USDA 11, já o segundo grupo incluiu estirpes relacionadas à B elkanii USDA 76T Uma elevada variabilidade foi observada no gene atpD, sendo que cinco estirpes relacionadas à B elkanii apresentaram uma variabilidade ainda não constatada para esse gene Outra importante observação foi que o grupo composto pelas estirpes USDA 11, SEMIAs 58 e 659 de B japonicum, todas isoladas de soja, foram sempre reunidas em todas as seis árvores construídas e formaram um grupo distinto do agrupamento formado pela estirpe tipo de B japonicum USDA 6T Desse modo, foi observado que tanto a análise polifásica, utilizando BOX-PCR e as seqüências do gene ribossomal 16S, quanto a técnica de MLSA possibilitaram acessar a diversidade genética em rizóbios bem como determinar relações filogenéticas e identificar possíveis novas espécies de rizóbiosItem Avaliação citológica e da atividade antimicrobiana em camundongos do composto produzido por Pseudomonas aeruginosa cepa LV sobre isolados clínicos multirresistentesNavarro, Miguel Octavio Pérez; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Celligoi, Maria Antonia Pedrine Colabone; Crhyssafidis, Andréas Lázaros; Medeiros, Daniela Cristina de; Araújo, Welington Luiz de; Oliveira Júnior, Admilton Gonçalves de [Coorientador]Resumo: O surgimento de organismos multirresistentes (MR) aumenta mais rápido que o desenvolvimento de novos compostos antimicrobianos, causando uma crise na saúde pública mundial Neste estudo o desenvolvimento de um composto antimicrobiano foi realizado, avaliando o risco de resistência da molécula e o seu potencial de ser um novo fármaco Um composto organocúprico antibiótico (OAC) foi avaliado contra isolados clínicos MR, in vitro e in vivo OAC foi produzido em cultura submersa de Pseudomonas aeruginosa cepa LV, purificado por cromatografia liquida de absorção e identificado por analises espectrométricos A bioatividade, risco de resistência, toxicidade e eficácia foram determinadas OAC foi identificado como fluopsina C com MIC´s e MBC´s <2 µgmL-1e baixas frequências de resistência Os camundongos tratados com uma única dose de 2 mgKg-1 e duas doses de 1 mgKg-18h-1 de fluopsina C, apresentaram uma dose protetiva (DP5) em 72 horas após os tratamentos A substância fluopsina C produziu alterações moderadas no fígado, porém não apresentou nefrotoxicidade nos camundongos Este novo estudos fornecem resultados que possibilitam a ideia de continuar avaliando fluopsina C para o desenvolvimento de um novo fármaco com atividade antimicrobianaItem Sequenciamento e montagem de novo do genoma total de Pseudomonas aeruginosa cepa LV e análise da expressão gênica temporal e diferencial na presença de cobreSimionato, Ane Stéfano; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Souza, Rogério Fernandes de; Pileggi, Marcos; Araújo, Welington Luiz deResumo: Pseudomonas aeruginosa é amplamente dispersa na natureza, devido principalmente à sua alta capacidade adaptativa Dentre as diversas estratégias de adaptação está a produção de metabólitos bioativos que podem inibir o crescimento ou metabolismo de outros microrganismos P aeruginosa cepa LV produz diversos compostos bioativos, entre eles um composto organometálico, identificado como Fluopsina C, produzido somente na presença de cobre, que apresenta alto potencial biotecnológico Entretanto, poucos são os relatos sobre esta molécula, não havendo informações relacionadas à sua biossíntese e rota metabólica O objetivo deste trabalho foi realizar o sequenciamento completo do genoma de P aeruginosa cepa LV e realizar a análise da expressão temporal dos genes diferencialmente expressos pela presença/ausência de cobre, afim de melhor compreender a biossíntese da Fluopsina C Para isso, a cepa foi cultivada em ágar nutriente overnight e após a extração do DNA total do microrganismo foi realizado o sequenciamento pela plataforma Illumina MiSeq e o genoma foi montado pela estratégia de novo, filtrado, trimado e anotado O genoma de P aeruginosa cepa LV é constituído por 6468334 pb e, possue 14 grupos de genes putativos responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, 7 genes de resistência e 3 arranjos CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Regularly Short Palindromic Repeats) A análise da expressão temporal foi realizada por PCR em tempo real e com pontos de análise em 24 horas, 4 e 7 dias Foram estudados nove genes hiperexpressos na presença de cobre, divididos em três classes: transportadores de metais, reguladores de expressão e biossíntese de fenazina e proteínas hipotéticas Os resultados obtidos validam as hipóteses geradas em trabalhos anteriores com relação a eliminação do cobre através de efluxo e transportadores ATPases Além disso, sugerimos uma nova hipótese com relação a via de biossíntese da Fluopsina C, relacionando a produção de compostos fenazínicos ao percursor da molécula, a tioforminaItem Caracterização polifásica de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) no Mato Grosso do SulCosta, Maira Rejane; Hungria, Mariangela [Orientador]; Andrade, Diva de Souza; Ribeiro, Renan Augusto; Delamuta, Jakeline Renata Marçon; Fagotti, Dáfila dos Santos Lima; Mercante, Fábio Martins [Coorientador]Resumo: O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) é uma leguminosa importante do ponto de vista social e econômico No entanto, um dos fatores que limita a produção reside no cultivo em solos deficientes em nitrogênio Neste contexto, uma estratégia importante consiste no suprimento de nitrogênio via fixação biológica de nitrogênio (FBN), pela simbiose da planta com variedade de rizóbios Nos solos brasileiros existe grande diversidade de rizóbios capazes de nodular o feijoeiro, mas que apresentam, com frequência, baixa capacidade de fixar nitrogênio Nesse contexto, estudos de taxonomia e filogenia de bactérias fixadoras de nitrogênio são de fundamental importância, não só para entender os processos evolutivos e obter avanços no conhecimento sobre ecologia de rizóbios, como também para a produção de inoculantes microbianos Através das análises de perfil de DNA por BOX-PCR, sequências de 16S rRNA e análise de genes conservados (housekeeping) por MLSA (Multilocus Sequencing Analysis), além das características fenotípicas, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de 73 bactérias capazes de nodular o feijoeiro, isoladas de 45 locais em 22 municípios do Mato Grosso do Sul, Brasil As relações evolutivas estabelecidas, tanto com base no sequenciamento do gene 16S, como na análise individual e concatenada de três genes conservados (glnII, gyrB and recA) indicaram elevada diversidade de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro Os resultados obtidos também revelaram isolados que podem representar novas espécies de rizóbios simbiontes de feijoeiroItem Atividade antibacteriana de nanopartículas de prata associadas ao eugenolBodnar, Giovana Carolina; Nakazato, Gerson [Orientador]; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Panagio, Luciano Aparecido; Perugini, Marcia Regina Eches; Campos, Anna Carolina Leonelli Pires deResumo: Bactérias multirresistentes representam um grande problema que desafiam a saúde pública em encontrar estratégias utilizando os antimicrobianos atuais disponíveis no mercado para combater estas infecções Por outro lado, o desenvolvimento de novos fármacos não ocorre no mesmo ritmo dos mecanismos de resistência desenvolvidos pelas bactérias A resistência aos antimicrobianos não é apenas um problema da área clínica No setor de alimentos diversos patógenos humanos vêm adquirindo resistência aos desinfetantes utilizados na indústria alimentícia Sendo assim, pesquisadores buscam por novas substâncias antimicrobianas que podem auxiliar no tratamento das infecções multirresistentes pelo desenvolvimento de alternativas aos antibióticos e aos desinfetantes disponíveis Os produtos naturais e a associação de compostos tornaram-se um importante campo de pesquisa para descoberta de novos antimicrobianos O objetivo desta pesquisa foi avaliar a atividade antibacteriana de nanopartículas de prata biologicamente sintetizada pelo fungo Fusarium oxysporum em associação ao eugenol Eugenol e bio-AgNP demonstraram efeito bactericida, com concentração inibitória mínima (MIC) entre 12 a 2% (v/v) e 394 a 63 µM, respectivamente; e todos os isolados clínicos de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) analisados foram sensíveis aos compostos Para a curva de crescimento e morte, eugenol agiu em menos de 2 h, enquanto as nanopartículas levaram de 5 a 1 h para eliminar totalmente as bactérias Gram-negativas e 24 h para as Gram-positivas O efeito sinérgico ou aditivo foi observado quando os compostos foram combinados, com redução dos valores de MIC, para ½ MIC, 1/3 MIC ou até mesmo ¼ MIC, o que melhorou o tempo de ação da bio-AgNP comparado ao uso em isolado A Microscopia Eletrônica de Varredura demonstrou alterações morfológicas celulares após os tratamentos com os compostos em isolado ou em combinação No ensaio de biofilme, a combinação dos compostos reduziu em 5-log o número de células As bio-AgNP associadas ao eugenol, composto derivado do óleo de cravo, são alternativas antimicrobianas que neste estudo demonstraram um importante papel contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo também cepas multirresistentes, além de atuar contra o biofilme formado por estas bactérias Sendo assim, podem ser uma estratégia alternativa para o controle de infecções, e apresentam um potencial não somente na área clínica/hospitalar, mas também aplicação na indústriaItem Estratégias para o controle de infecções causadas por Streptococcus agalactiaeOtaguiri, Eliane Saori; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Gionco, Bárbara; Tavares, Eliandro Reis; Kerbauy, Gilselena; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: Streptococcus agalactiae ou estreptococos do grupo B (EGB) de Lancefield continua sendo uma das principais causas de infecções invasivas e potencialmente fatais em recém-nascidos em todo o mundo, apesar da antibioticoterapia profilática intraparto (API) O objetivo principal deste estudo foi analisar estratégias alternativas para o controle de infecções neonatais por EGB Inicialmente, um ensaio de multiplex PCR em tempo real baseado em curva de melting foi padronizado para detecção simultânea de EGB e marcadores de resistência a macrolídeos e lincosamidas diretamente de swab vaginal-retal Oligonucleotídeos iniciadores específicos e complementares aos genes cfb (codifica para fator CAMP), erm(A) e erm(B) (codificam para metilases) e mef(A) (codifica para bomba de efluxo) foram desenhados a partir de sequências nucleotídicas de EGB depositadas em bancos de dados públicos O ensaio de multiplex PCR apresentou 1% de especificidade e um limite de detecção de 14 unidades formadoras de colônias equivalentes por reação A prevalência de colonização de EGB entre a população estudada foi de 157% (16/12) com base nos resultados de cultura positiva e do multiplex PCR em tempo real Entre os isolados de EGB, somente dois apresentaram resistência aos antimicrobianos, tanto pelo método fenotípico quanto molecular Também foi avaliado pela primeira vez o efeito do oleoresina obtido de Copaifera multijuga Hayne (óleo de copaíba) isoladamente ou em combinação com nanopartículas de prata produzidas metabólitos de Fusarium oxysporum (AgNPbio) contra célula planctônica e séssil de isolados de EGB O óleo de copaíba apresentou atividade bactericida dose-dependente em células planctônicas de EGB, incluindo aqueles resistentes à eritromicina ou clindamicina Análises de microscopia eletrônica de transmissão e varredura de células planctônicas tratadas com o óleo de copaíba apresentaram ruptura de parede celular com extravazamento de conteúdo citoplasmático Este composto também apresentou atividade antibacteriana sobre biofilmes de EGB, inibindo sua formação, bem como a viabilidade de biofilmes maduros Além disso, a combinação do óleo de copaíba com AgNPbio resultou em efeito sinérgico em células planctônicas e na formação de biofilme, reduzindo significativamente os valores de concentração inibitória mínima de ambos os compostos Os resultados obtidos neste estudo mostram que a multiplex PCR em tempo real é um ensaio rápido, acessível e sensível, adequado para detecção direta de EGB e marcadores de resistência à eritromicina ou clindamicina diretamente em swabs vaginal-retal Adicionalmente, revelam o potencial do óleo de copaíba, sozinho ou em combinação com AgNPbio, para o desenvolvimento de novas formulações farmacêuticas para o controle de colonização e infecções por EGBItem Atividade antimicrobiana de compostos naturais aplicados em queijosCampos, Anna Carolina Leonelli Pires de; Nakazato, Gerson [Orientador]; Nogueira, Alessandro; Pelayo, Jacinta Sanchez; Ribeiro, Jéssica Caroline Bigasky; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Fagan, Eder Paulo [Coorientador]Resumo: O queijo artesanal é amplamente consumido no Brasil, no entanto por, em sua maioria, ser fabricado com leite cru, pode estar contaminado com bactérias patogênicas A presença de fungos e bactérias é um problema para o setor industrial, visto que pode ocasionar defeitos nos queijos, e levar a consideráveis perdas econômicas Neste estudo, avaliamos a presença de Escherichia coli e Staphylococcus aureus em queijos artesanais oriundos de diferentes estados do Brasil e, posteriormente, analisamos a atividade antimicrobiana do óleo essencial de orégano (OEO), e da associação de méis de Scaptotrigona bipunctata Lepeletier 1836 (HSB) e de Apis mellifera Latreille africanizada (HAM), no controle de microrganismos contaminantes de queijos durante o processo de maturação A partir de 147 amostras de queijos, foram identificados 25 isolados de S aureus (1 amostras de queijo) e 39 de E coli (29 amostras de queijos) Entre esses isolados, destacamos a presença de um isolado de E coli enteropatogênica atípica (aEPEC), e dois isolados de E coli patogênica extraintestinais (ExPEC) Um novo sorotipo (O64474:H8) de E coli foi detectado em um desses queijos, sendo o primeiro relato no Brasil Um dos isolados de E coli mostrou resistência a três importantes antimicrobianos (tetraciclina, ampicilina e ácido nalidíxico), e um isolado de S aureus apresentou resistência a cinco antimicrobianos (ampicilina, estreptomicina, cefoxitina, penicilina e ciprofloxacina Alguns desses isolados de E coli e S aureus foram utilizados como bactérias contaminantes dos queijos contendo antimicrobianos naturais (OEO ou méis) Fungos filamentos (Aspergillus sp, Fusarium sp e Penicillium sp) também foram utilizados para contaminar os queijos produzidos e maturados por 3 dias, seguindo diferentes tratamentos O OEO a ,2 % (v/v) demonstrou alta atividade antibacteriana e antifúngica, reduzindo as populações bacterianas à zero até o sexto dia de maturação, e inibindo a germinação dos esporos fúngicos Já a combinação dos méis (HSB 5% e HAM 25%, v/v) também apresentou atividade antibacteriana, reduzindo a população de E coli e S aureus a zero após 15 e 6 dias, respectivamente, bem como a germinação dos fungos A utilização desses antimicrobianos naturais foi muito eficiente para os microrganismos testados durante a maturação, e o OEO assim como a combinação de méis pode ser uma interessante alternativa para os antimicrobianos convencionais (nisina e natamicina) contra importantes patógenos, como o novo sorogrupo de E coli isolado nesses queijos artesanaisItem Atividade antibacteriana e mecanismos de ação de nanopartículas de ouroNishio, Erick Kenji; Nakazato, Gerson [Orientador]; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Nakamura, Celso Vataru; Bodnar, Giovana Carolina; Cyoia, Paula SignolfiResumo: Os metais nobres têm um histórico de uso na medicina bastante antigo Há relatos de uso desde 15 AC, no entanto deram lugar aos antibióticos após a grande descoberta da penicilina Porém com a emergência de microrganismos multirresistentes, a busca por “novos antimicrobianos” tem levado pesquisadores a “antigos medicamentos”, como o ouro Apesar de antigo, o ouro vem ganhando uma nova forma de destaque, a nanopartícula de ouro (AuNP) Neste estudo, foi avaliada a atividade antimicrobiana de AuNP quimicamente sintetizadas, bem como seus possíveis mecanismos de ação A atividade antibacteriana foi testada frente a cepas Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo multirresistentes utilizando técnicas de microdiluição em caldo para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e curva de tempo e morte Já as alterações na bactéria, internas e externas, foram avaliadas através de microscopia eletrônica de transmissão (MET) e varredura (MEV) respectivamente Com relação a avaliação dos mecanismos que a AuNP age sobre a bactéria, foram testados permeabilidade de membrana, produção total de espécies reativas de oxigênio (EROs), peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas, degradação de ácidos nucleicos e perfil de proteínas totais Além disso, foi avaliada a citotoxicidade em células primárias (hemácias) e de linhagem (HEp-2) Os valores de CIM5 foram de ,5 µg/ml e de 1,56 µg/ml, para Gram-positivos e Gram-negativos, respectivamente Para ambos os grupos, a AuNP apresentou efeito bactericida Nas imagens de MEV observamos extravasamento de material citoplasmático, e na MET observamos acúmulo de AuNP na membrana e citoplasma, lise de membrana e liberação de vesículas de membrana externa, que podem estar relacionadas ao quorum-sensing ocasionando aglomeração das células bacterianas Os ensaios de mecanismos mostraram desestabilização de membrana e permeabilidade, indução de EROs e consequente danos a proteínas, lipídeos e material genético Já os ensaios de citotoxicidade mostraram uma concentração citotóxica (CC5) de 2,12 µg/ml, e uma concentração hemolítica (HC5) de 5,97 µg/ml Esses resultados indicam um grande potencial bactericida das AuNP, agindo em vários alvos dentro da bactéria O valor de CC5 relativamente baixo, pode ser devido às propriedades antitumorais relatadas para as AuNP Portanto, as AuNPs exibem um grande potencial para aplicação como antimicrobiano e controle de microrganismos multirresistentesItem Caracterização de Escherichia coli produtora de ESBL e AmpC de amostras clínicas humanas e de carcaças de frangoKoga, Vanessa Lumi; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama [Orientador]; Nakazato, Gerson; Vespero, Eliana Carolina; Perugini, Marcia Regina Eches; Brito, Benito Guimarães deResumo: A emergência de bactérias produtoras de betalactamases de espectro estendido (ESBL) e/ ou AmpC em humanos e nas carnes de origem animal tem criado uma grande preocupação quanto à possibilidade de transmissão da resistência aos antimicrobianos por meio da cadeia alimentar O objetivo do nosso trabalho foi estudar amostras de Escherichia coli produtoras de ESBL e AmpC mediadas por plasmídios (pAmpC), isoladas da carcaça de frango e da clínica humana na cidade de Londrina, e estes foram analisados quanto ao perfil de resistência antimicrobiana, virulência e relação clonal O primeiro estudo refere-se às amostras de E coli produtoras de ESBL isoladas de infecção do trato urinário (ITU) e de carcaças de frango Entre as amostras isoladas de ITU, identificamos genes de ESBL, como blaCTX-M-2, blaCTX-M-3, blaCTX-M-8, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-27, enquanto que nas amostras de carcaças de frango identificamos blaCTX-M-1, blaCTX-M-2 e blaCTX-M-8 As amostras apresentaram fatores de virulência associados a E coli patogênica aviária (APEC) (931% em ITUs e 7143% em carcaças de frango) e ilhas de patogenicidade (524% em ITUs e 31% em carcaças de frango) Por meio do “Pulsed Field Gel Electrophoresis” (PFGE) e do “Multilocus Sequence Typing” (MLST), nossos resultados demonstraram uma alta diversidade de cepas entre ambos os grupos de amostras O segundo estudo refere-se às amostras produtoras de pAmpC isoladas de carcaças de frango e amostras clínicas humanas Nesse trabalho, todas as amostras apresentaram o gene blaCMY-2, e foram consideradas multirresistentes A maioria das amostras (7143%) estavam associadas a sequência de inserção ISEcp1 Por meio do MLST, 11 “Sequence types” foram identificados, sendo apenas o ST354 encontrado em ambos os grupos de amostras PFGE demonstrou uma alta diversidade entre as amostras clínicas com as amostras de frango Nossos trabalhos demonstraram uma alta diversidade bacteriana entre as amostras clínicas com as isoladas de carcaças de frango No entanto, a presença de fatores de virulência e genes de resistência, associados a infecções humanas, nas amostras isoladas de carne de frango representam um potencial zoonótico ao homemItem Caracterização fenotípica e molecular de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa produtores de metalo-beta-lactamasesCarrara-Marroni, Floristher Elaine; Pelayo, Jacinta Sanchez [Orientador]; Garcia, Lourdes Botelho; Venâncio, Emerson José; Nóbrega, Gisele Maria Andrade de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Tognim, Maria Cristina Bronharo [Coorientadora]Resumo: A produção de metalo-beta-lactamases (MßL) é um importante mecanismo de resistência aos carbapenêmicos detectado com aumentada freqüência entre isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa recuperados no Brasil Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, pesquisar a ocorrência de MßL e caracterizar fenotipicamente e genotipicamente isolados de Pseudomonas aeruginosa recuperados de pacientes internados ou atendidos no Hospital Universitário de Londrina e no Ambulatório do Hospital das Clínicas Um total de 24 isolados de P aeruginosa, coletados consecutivamente durante o período de março de 23 a março de 25, foram avaliados Destes, 141 isolados que não apresentaram sensibilidade à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram selecionados para a pesquisa de MßLs e detecção por PCR de genes codificadores destas enzimas Uma alta taxa de resistência aos antimicrobianos foi verificada entre as P aeruginosa estudadas sendo que somente as polimixinas mostraram atividade contra 1% dos isolados Quarenta e sete isolados foram produtores de MßL e os genes blaSPM-1 e blaIMP-16 foram encontrados em 45 e 2 isolados, respectivamente Os isolados produtores de SPM-1 foram agrupados em 11 clones com diferentes perfis de multirresistência aos antimicrobianos As cepas de P aeruginosa pertencentes ao clone A apresentaram relação genética com o clone epidêmico brasileiro produtor de SPM-1, denominado SP, e a disseminação deste clone foi verificada em diferentes setores do HU Os isolados produtores de SPM-1 foram recuperados com maior freqüência entre pacientes internados na Enfermaria Masculina e nas UTIs do HU, sugerindo um importante papel destes setores na disseminação e manutenção de cepas produtoras de MßLs neste hospital Os isolados Pa3 e Pa43, produtores de IMP-16, não apresentaram resistência aos carbapenêmicos e foram agrupados em um clone distinto O seqüenciamento dos isolados Pa3 e Pa43 mostrou a presença do gene blaIMP-16 como um único cassete gênico localizado em um novo integron da classe 1 O gene cassete blaIMP-16 foi precedido por um promotor Pc fraco e por um outro promotor P2 inativo Este gene está localizado num plasmídeo de 6Kb nos dois isolados produtores de IMP-16 Os isolados Pa3 e Pa43 apresentaram níveis transcricionais de oprD e de ampC similares aos da cepa de referência Pa1 indicando que, provavelmente, estes isolados apresentam uma expressão normal da porina OprD e produzem quantidades basais da enzima AmpC Uma hiperexpressão dos sistemas de efluxo MexAB-OprM, MexCD-OprJ e MexXY foi verificada em ambos isolados produtores de IMP-16 Este estudo relata a primeira detecção do gene blaIMP-16 na região Sul do Brasil e a primeira descrição de isolados clínicos de P aeruginosa produtores de IMP-16 não resistentes aos carbapenêmicos