Caracterização do biofilme formado por Cryptococcus gattii utilizando abordagens fenotípicas e moleculares
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Resumo: A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, pertencentes aos complexos C gattii sensu lato (sl) e C neoformans sensu lato (sl) Esta enfermidade constitui-se em uma das principais causas de morbidade e mortalidade de indivíduos imunocomprometidos, principalmente aqueles portadores de HIV/AIDS Entretanto, esses patógenos também são agentes oportunistas importantes em pacientes com câncer e naqueles que se submetem às terapias imunossupressoras, procedimentos médicos invasivos ou utilizam antibióticos de amplo espectro Além disso, relatos de criptococoses em indivíduos imunocompetentes têm emergido mundialmente Embora não seja um fator de virulência clássico, a capacidade de formar biofilme tem contribuído consideravelmente na virulência de muitas espécies de fungos, sendo relacionado com a persistência de infecções e diminuição da sensibilidade aos agentes antimicrobianos Apesar da importância de C gattii sl na perspectiva clínica, o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na formação de biofilme por este complexo é escasso Diante disso, este trabalho teve como objetivo determinar a capacidade de formação de biofilme por C gattii sl, a caracterização fenotípica e a identificação de possíveis genes envolvidos no seu desenvolvimento A capacidade de formação do biofilme foi avaliada em superfície de poliestireno a 37 ºC por 48 horas em isolados clínicos e ambientais de C gattii sl, e a biomassa foi determinada por coloração com cristal violeta A cinética do desenvolvimento do biofilme foi determinada em superfície de poliestireno e vidro nos tempos de 6, 12, 48, 72 e 96 horas por C gattii ATCC 2465, determinada pela quantificação da biomassa e da atividade metabólica, por cristal violeta e redução do XTT, respectivamente A estrutura do biofilme foi determinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de varredura confocal a laser (MVCL) Para a identificação de genes envolvidos na formação do biofilme, C gattii ATCC 2465 foi incubado a 37 ºC por 48 horas, e utilizado para obtenção do RNA para determinar o perfil transcricional durante o desenvolvimento do biofilme por sequenciamento de RNA (RNA-seq) Nossos resultados mostraram que C gattii sl apresenta a capacidade de formar biofilme em diferentes superfícies; além disso, a cinética da formação apresentou um aumento exponencial da biomassa entre os tempos de incubação de 24 e 96 horas, enquanto que a atividade metabólica teve o seu aumento entre 24 e 72 horas Os resultados de MEV mostraram que entre e 12 horas as células leveduriformes encontraram-se aderidas à superfície, com aumento gradativo de densidade celular; em 24 horas houve o início da formação de matriz exopolissacarídica (EPS); e em 96 horas o biofilme apresentou-se como agregado celular embebidos na EPS Imagens de MCLV, em 72 horas de incubação, mostraram o biofilme como uma monocamada de 8 micrômetros de espessura, composto por células metabolicamente ativas envoltas pela EPS A avaliação do perfil transcricional, após o tratamento estatístico, mostrou um total de 321 genes diferencialmente expressos durante a formação do biofilme Destes, 98 genes apresentaram-se como hiperexpressos, enquanto 223 estavam subexpresso Dos 98 genes, com expressão aumentada, após análise das possíveis funções, 38 corresponderam a proteínas não caracterizadas, 35 corresponderam a proteínas ribossomais e proteínas componentes da estrutura do ribossomo e 25 corresponderam a proteínas caracterizadas Sendo assim, nossos resultados mostraram que, além da capacidade de formar biofilme, o complexo C gattii sl apresenta um aparato de regulação consistente, indicando centenas de genes envolvidos no desenvolvimento desta estrutura
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Palavras-chave
Leveduras (Fungos), Engenharia genética, Biofilme, Criptococose, Fungos, Yeast fungi - Genetic engineering, Biofilms, Criptococcosis