Caracterização fenotípica e molecular de mecanismos de resistência aos antimicrobianos e de fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa
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Resumo
Resumo: Objetivo: O presente estudo teve como objetivo caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, quinolonas, aminoglicosídeos e colistina mediados por plasmídeos e diversos fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa Artigo científico 1: Uma coleção de duzentos e dez isolados de P aeruginosa não sensíveis à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram incluídos no estudo Os isolados foram recuperados no Laboratório de Microbiologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina (HU) no período de junho de 212 a maio de 214 A identificação bacteriana foi realizada pelo Vitek-2® (bioMéurieux) e por testes bioquímicos convencionais, seguida pela confirmação por PCR O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de disco-difusão para treze antimicrobianos A concentração inibitória mínima (CIM) à ceftazidima, aos carbapenêmicos e às polimixinas foi determinada pelo método de microdiluição em caldo Os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos foram interpretados segundo o documento M1-S27 (CLSI,217) e a classificação da resistência foi determinada segundo os critérios de Magiorakos (212) A produção de carbapenemases foi avaliada pelo Blue Carba Test (BCT) e a produção de metalo-beta-lactamases (MBL) foi determinada pelo Teste de Sinergismo de Disco Triplo (TSDT) A presença de genes codificadores de beta-lactamases, carbapenemases, Qnr, 16S rRNA metiltransferases e integrases foi investigada por PCR convencional ou multiplex seguida por sequenciamento A produção de fatores de virulência produzidos por P aeruginosa foi detectada entre os isolados produtores de carbapenemases utilizando testes fenotípicos Além disso, a capacidade de formação de biofilme foi avaliada em microplacas de poliestireno e os genes codificadores de fatores de virulência foram pesquisados por PCR A clonalidade dos isolados produtores de carbapenemases foi avaliada por ERIC-PCR e o Sequence Type (ST), de cinco isolados escolhidos aleatoriamente produtores de diferentes genes de carbapenemases e de clones distintos, foi determinado por Multilocus Sequence Typing (MLST) Altas taxas de resistência aos carbapenêmicos foram verificadas (8,9% para o imipenem e 78,% para o meropenem) e somente as polimixinas apresentaram 1,% de atividade contra todos os isolados do estudo Cerca de 54,7% dos isolados foram classificados como multirresistentes (MR) e 31,9% como extensivamente resistentes (ER) A produção de carbapenemases e de MBL foi detectada em 33,3% e 31,9% dos isolados pelo BCT e pelo TSDT, respectivamente Uma diversidade de genes codificadores de carbapenemases foi verificada entre 7 isolados: blaSPM-1 (63/3,%), blaKPC-2 (3/1,4%), blaIMP-16 (2/,9%), blaVIM-1 (1/,4%) e blaVIM-7 (1/,4%) Foram detectados genes codificadores de beta-lactamases (blaGES-26, blaOXA-46 e blaCTX-M-15) e de resistência aos aminoglicosídeos (rmtD) O gene blaIMP-16 foi detectado como o único gene cassete de um integron da classe I nos dois isolados produtores de IMP-16 O contexto genético dos genes blaVIM-1 e blaVIM-7 foram semelhantes: o gene codificador da MBL como o primeiro cassete gênico, seguido por uma enzima modificadora de aminoglicosídeos (aadA1) e o gene blaOXA-46 anteriormente ao qac?E/sulI Todos os isolados produtores de carbapenemases formaram biofilme e apresentaram o gene lasI codificador de um dos componentes do quorum sensing Um total de 98,6% e 94,3% foram produtores de hemolisinas e proteases, respectivamente Os genes que codificam a fosfolipase hemolítica (plcH), elastase (lasB), exotoxina A (toxA) e exotoxina S foram detectados em 94,3% dos isolados produtores de carbapenemases Apenas um e quatro isolados apresentaram os genes que codificam neuraminidase (nanI) e a exotoxina U, respectivamente A tipagem molecular dos isolados produtores de carbapenemases evidenciou grande diversidade clonal com a presença de 18 genótipos distintos, dos quais os isolados portadores de blaSPM-1 foram agrupados em 14 genótipos e os isolados portadores de blaKPC-2, blaIMP-16, blaVIM-1 e blaVIM-7 foram agrupados em clones únicos Diferentes STs foram obtidos para os cinco isolados submetidos ao MLST e dentre estes dois foram relacionados à disseminação de determinantes de resistência: o portador de blaSPM-1 pertenceu ao ST277, relacionado à disseminação de SPM-1 no Brasil e o portador de blaKPC-2 ao ST235, um importante clone epidêmico mundial Artigo científico 2: Este estudo relatou a primeira descrição de um isolado de P aeruginosa produtor de VIM-7 no Brasil O isolado foi recuperado em maio de 213 da secreção traqueal (17 UFC/mL) de um paciente internado no HU que apresentou resistência a todos os antimicrobianos, com exceção das polimixinas A produção de carbapenemases foi avaliada pelo BCT e a de MBL pelo TDST O gene blaVIM-7 foi localizado num plasmídeo de 52 Kb como o primeiro gene cassete de um integron da classe I seguido por um gene aadA1 e o blaOXA-46 situado anteriormente ao qac?E/sulI O isolado pertenceu ao ST1284, foi um forte produtor de biofilme e apresentou os genes codificadores de fatores de virulência lasI, lasB, plcH, toxA e exoS Artigo científico 3: O artigo relata a presença de um isolado de P aeruginosa produtor de KPC-2 pertencente ao ST235 em 28, anteriormente à primeira detecção do gene blaKPC no Brasil e de um surto de Enterobactérias produtoras de blaKPC no HU Este isolado foi recuperado da urina de uma paciente internada no setor de queimados do HU, foi classificado como ER e apresentou sensibilidade apenas às polimixinas A produção de carbapenemases foi detectada pelo BCT e o resultado negativo no TSDT caracterizou uma carbapenemase não MBL O gene blaKPC-2 apresentou localização cromossomal, em um contexto genético idêntico a isolados recuperados no HU em 21 O gene blaKPC-2 foi flanqueado à montante pela sequência de inserção ISKpn6, entretanto à jusante não foram detectadas ISKpn7 e ISKpn8 O isolado foi considerado hipervirulento, um forte formador de biofilme, produziu hemolisina e protease e apresentou os genes lasI, lasB, plcH, toxA, exoY e exoU Conclusões: As altas taxas de resistência aos antimicrobianos, a diversidade de genes codificadores de carbapenemases, a produção de importantes fatores de virulência e a detecção de STs relacionados a clones epidêmicos nacional e mundial refletem o problema da resistência aos antimicrobianos em P aeruginosa no HU Desta forma o estudo enfatiza a necessidade de medidas estritas de controle de infecção e de programas efetivos para o uso racional dos antimicrobianos neste hospital
Descrição
Palavras-chave
Pseudomonas aeruginosa, Virulência (Microbiologia), Drogas, Resistência em microorganismos, Virulence (Microbiology), Drug resistance in micro-organisms