02 - Mestrado - Patologia Experimental
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Item Implicações das variantes genéticas (rs822335 e rs4143815) do gene de PD-L1 na suscetibilidade e prognóstico do câncer de mama(2025-09-04) Silva, Mariane Ricciardi da; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi; Vitiello, Glauco Akelinghton FreireO câncer de mama (CM) é a neoplasia maligna mais frequente em mulheres no mundo e pode ser classificado em ao menos quatro diferentes subtipos moleculares, sendo eles: luminal A (LA), luminal B (LB), HER2 superexpresso (HER2+) e triplo negativo (TN), com os subtipos LA e TN considerados de prognósticos opostos, sendo LA o CM de prognóstico mais favorável, e TN classificado entre os mais agressivos. Apesar dos mecanismos do sistema imune para a eliminação de tumores, as células tumorais possuem como característica evolutiva o desenvolvimento de mecanismos de evasão imunológica. Os principais alvos de modulação pelos tumores incluem as moléculas de checkpoint imunológico, como o ligante de morte programada 1 (PD-L1) e seu receptor, a proteína de morte programada 1 (PD-1). O eixo PD-L1/PD-1 é essencial para suprimir a atividade de células T, atuando na manutenção da tolerância imunológica e no controle da inflamação. A expressão e função de PD-L1 pode ser influenciada pela presença de variantes genéticas, como as variantes de nucleotídeo único (SNVs). O gene que codifica PD-L1 é chamado CD274, e possui cerca de 20 SNVs indexadas na literatura, incluindo rs4143815G>C e rs822335T>C. A SNV rs4143815G>C localiza-se na região 3’UTR de CD274, enquanto rs822335T>C se encontra na região promotora do gene. Ambas já se correlacionaram com maior expressão de PD-L1, tornando-se alvos promissores de estudo para a melhor compreensão dos mecanismos de modulação de expressão de PD-L1, e de sua possível correlação com a suscetibilidade e o prognóstico do CM. Por isso, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência dos polimorfismos rs4143815G>C e rs822335T>C de CD274, e seus haplótipos, em pacientes com CM, e entre os subtipos moleculares de prognósticos opostos mais frequentes dentro do grupo de amostras selecionado, LA e TN. Participaram do estudo 490 mulheres, divididas em dois grandes grupos: controle (n=198) e câncer (n=292), com o grupo câncer sendo subdividido em LA (n=182) LB (n=36), HER2+ (n=16) e TN (n=58). Foram utilizadas amostras de DNA armazenadas em biorrepositório e a genotipagem das SNVs foi realizada por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR). Apenas o polimorfismo rs822335T>C demonstrou associações significativas com os grupos estudados, sendo seu genótipo TT associado à maior suscetibilidade ao CMLA (OR: 2.091; IC 95%: 1.086-4.023; p=0.027) e seu genótipo CT associado à proteção para o CMTN (OR: 0.439; IC 95%: 0.231-0.832; p=0.012), quando comparadas ao grupo controle. Além disso, ao avaliar os modelos genéticos, o modelo dominante indicou que a presença do alelo T confere proteção para o desenvolvimento do CMTN (OR: 0.465; IC 95%: 0.254-0.851; p=0.013), e o modelo recessivo confirma o genótipo TT como fator de suscetibilidade para CMLA (OR: 2.319; IC 95%: 1.285-4.187; p=0.005). Na análise haplotípica, os resultados foram semelhantes: a presença do haplótipo C-G demonstra-se como fator protetor para CMLA (OR: 0.592; IC 95%: 0.361-0.971; p=0.038), e aumenta a suscetibilidade ao CMTN em aproximadamente 2,2 vezes (OR: 2.170; IC 95%: 1.151-4.092; p=0.017), enquanto a presença do haplótipo T-G diminui em 2,6 vezes a suscetibilidade ao CMTN (OR: 0.379; IC 95%: 0.185-0.778; p=0.008). Este é o primeiro trabalho a avaliar estas SNVs em conjunto no contexto do CM, e demonstra a relação entre o alelo C e o genótipo CC de rs822335T>C, correlacionados com a maior expressão de PD-L1 em células tumorais, com a suscetibilidade ao CMTN - tumores que possuem prognóstico desfavorável e são muito imunogênicos, podendo ser favorecidos pelo aumento desta molécula no microambiente tumoral. Em adição, demonstramos a associação do alelo T e do genótipo TT, com o CMLA. Estes resultados podem contribuir para o melhor entendimento do papel de PD-L1 no CM.Item Perfil temporal de ativação de neurônios do gânglio da raiz dorsal e células da glia espinais na artrite séptica causada por Staphylococcus aureus em camundongos(2025-02-24) Barbosa-Costa, Fernanda; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Zaninelli, Tiago HenriqueStaphylococcus aureus é o principal agente causal da artrite séptica, uma infecção grave caracterizada presença de um agente infeccioso na cavidade articular, gerando dor, inflamação e destruição da articulação. No entanto, ainda não se sabe qual o papel das células da glia nessa infecção. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a participação de células da glia em um modelo de dor e inflamação induzido pela infecção articular causada por S. aureus em camundongos. Para isso, foram utilizados camundongos Swiss machos (20-25g, n=7 por grupo). A artrite foi induzida pela injeção intra-articular (i.a.) de S. aureus (1×107, 10µL) na articulação traseira direita dos camundongos. Hiperalgesia mecânica (Von Frey eletrônico) e térmica (placa quente [52°C]), escore clínico, edema articular e teste de distribuição de peso corporal nas patas traseiras (Static Weight Bearing) foram avaliados nos tempos 0 (basal), 3, 7, 14, 21 e 28 dias após o estímulo. Amostras de medula espinal e DRG foram coletadas para análise de tempo-resposta da ativação de células da glia (astrócitos, micróglia e oligodendrócitos) e neurônios sensoriais (TRPV1+) através da técnica de imunofluorescência para pNFκB e marcadores específicos para cada tipo celular. Ainda, animais foram tratados com α-aminoadipate (100 nmol/animal, intratecal [i.t.]) um inibidor de astrócitos, minociclina (150 µg/animal, i.t.) um inibidor de micróglia e AMG 9810 (100 nmol/animal, i.t.) um antagonista de TRPV1, 7 dias após a indução da artrite. Foi realizada medidas de hiperalgesia mecânica e térmica, e edema nos tempos 0, 3 e 7 dias após o estímulo, e 1, 3 e 5 horas após o tratamento. A infecção por S. aureus induziu hiperalgesia mecânica e térmica, edema articular, aumento no score clínico, desbalanço na distribuição de peso corporal e ativação significativa de astrócitos, micróglia e neurônios TRPV1+. Com a administração dos inibidores seletivos, observou-se redução na hiperalgesia mecânica e térmica em diferentes momentos. Posto isto, este estudo demonstrou pela primeira vez a participação de células da glia da medula espinal no modelo de artrite séptica, mas também o envolvimento de um subconjunto de neurônios do DRG, fornecendo novas perspectivas para o manejo da dor e inflamaçãoItem Efeito de terapias isoladas e combinadas com benzoiltiouréias, benznidazol e aspirina sobre o plexo mioentérico do esôfago de camundongos infectados cronicamente por Trypanosoma cruzi(2024-10-31) Silva, Emanuel Perez Floro da; Araújo, Eduardo José de Almeida; Uchôa, Ernane Torres; Pavanelli, Wander RogérioA doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é atualmente uma das doenças de maior impacto global. O curso clínico bifásico da DC (fase aguda e fase crônica) pode levar ao desenvolvimento da forma indeterminada, cardiodigestiva, cardíaca e digestiva. Esta última se caracteriza por dismotilidade do tubo digestivo devido à denervação do plexo mioentérico. O tratamento convencional utilizado é com Benzonidazol (BZ), o qual possui limitações e pode causar muitos efeitos adversos na fase crônica da doença, o que compromete a adesão ao tratamento. Assim, o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da DC se faz necessário. Recentemente, demonstrou-se em testes in vitro o efeito tripanocida de benzoiltioureias (BTU) sobre o T. cruzi. Outro fármaco que tem demonstrado ser promissor para tratar DC é o ácido acetilsalicílico (ASA), o qual em doses controladas reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias, atenuando a denervação mioentérica observada na DC. Assim, este estudo objetivou avaliar o efeito do tratamento isolado e combinado de BZ, BTU e ASA sobre o plexo mioentérico de camundongos BALB/c infectados cronicamente com T. cruzi. Para tanto, dois grupos de animais machos, de 8 a 12 semanas de idade, foram formados: um que foi infectado com 5 × 10² formas tripomastigotas de T. cruzi (cepa Y) e o outro que permaneceu não infectado. Imediatamente após a infecção, os animais de cada grupo inicial foram separados em 16 grupos (n=5/grupo), sendo que um não recebeu nenhum tratamento (controle) e os demais foram tratados, via gavagem, com 25 mg/Kg de BZ, 25 mg/Kg de ASA, e/ou 12,5 de mg/Kg BTU de forma isolada ou combinada. Cada camundongo recebeu 0,1 mL de cada droga diluída em água potável. O grupo controle recebeu água potável autoclavada. Os tratamentos foram realizados durante as quatro primeiras semanas (fase aguda) após a infecção, e depois de 90 dias (fase crônica), foi feita a eutanásia, quando foram coletados os esôfagos, em sequência foram fixados em paraformoldeído (PFA) e divididos para a realização das análises histopatológicas de cortes transversais do esôfago corados em Hematoxilina e Eosina (H.E.) e imunofluorescência para visualização de neurônios que compõem o plexo mioentérico do esôfago. Ao total, 1600 fotos dos cortes em H.E., e 8000 dos preparados totais da camada muscular submetidos à técnica de imunofluorescência foram analisadas manualmente no software ImageJ e a análise estatística foi realizada utilizando o software R. As análises dos diferentes parâmetros avaliados, utilizando ferramentas do ImageJ, evidenciou que a infecção causou hipertrofia das camadas musculares, com aumento da espessura deste estrato e número de núcleos de células musculares por área, assim como causou denervação do plexo mioentérico, com hipertrofia das subpopulações neuronais (nitrérgicas e estimadamente colinérgicas). Os tratamentos em animais não infectados também demonstraram capacidade para alterar características das camadas musculares, como por exemplo os tratamentos que combinavam os fármacos que causaram hipertrofia da camada muscular longitudinal e, além disso, o tratamento com ASA, que chamou atenção por sua capacidade de aumentar o número de núcleos de células musculares do esôfago e hipertrofiar neurônios nitrérgicos. Em animais infectados, os tratamentos utilizando BZ isoladamente ou combinado com BTU demonstraram maior eficiência no controle das alterações das camadas musculares causadas pela infecção. E somando-se a isso, a terapia isolada BZ inibiu a hipertrofia dos neurônios nitrérgicos, o que não foi observado quando BTU foi combinada ao BZ. Conclui-se que, dentre os tratamentos avaliados, nenhum apresentou efeito completo de proteção a todas as alterações estruturais ocasionadas pela infecção crônica por T.cruzi no esôfago de camundongos, contudo os tratamentos isolados utilizando BZ ou utilizando ASA reduziram significativamente a hipertrofia neuronal colinérgica. A associação de BTU ao BZ demonstrou ser o tratamento mais eficiente para minimizar as alterações causadas pela infecção, preservando mais neurônios e reduzindo a hipertrofia muscular de ambas as camadas musculares do esôfago. Dessa maneira, há evidências que indicam que o estudo da associação de BTUs ao tratamento medicamentoso padrão da DC pode se tornar um protocolo com efeito desejado mais efetivo e com menores efeitos adversosItem A Resolvina D5 reduz a dor induzida pelo doador de ânion superóxido(2025-02-26) Martelossi-Cebinelli, Geovana; Junior, Waldiceu Aparecido Verri; Pereira, Maria Isabel Lovo Martins Busch; Zaninelli, Tiago HenriqueA inflamação é um mecanismo protetor que, ao produzir espécies reativas de oxigênio (ERO), regula funções fisiológicas, enquanto o excesso causa estresse oxidativo e intensifica a inflamação. A dor inflamatória resulta da interação entre tecidos lesionados e neurônios nociceptivos. As ERO, como o ânion superóxido (O2•-), possuem papel crucial na dor inflamatória, como evidenciado pelo superóxido de potássio (KO2), que libera O2•-, induzindo dor e inflamação. A resolução do processo inflamatório é essencial para limitar a dor e pode ser promovida por mediadores lipídicos pró-resolução, como a Resolvina D5 (RvD5), que possui efeitos anti-inflamatórios e analgésicos significativos. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos analgésicos da RvD5 em modelo de dor inflamatória induzida pelo doador de O2•-, o KO2, em camundongos. Para isso, foram utilizados camundongos Swiss machos e fêmeas e camundongos transgênicos LysM-eGFP machos (CEUA-UEL: 003.2021). Os animais foram pré-tratados com a RvD5 (1, 3 e 10 ng/100 µL/animal) ou com veículo (composto de salina isotônica e álcool) via intraperitoneal (i.p) ou intratecal, 30 min antes do estímulo com o KO2 ou veículo via intraplantar (30 µg/20 µL/animal) ou i.p. (1 mg/100 µL/animal). A hiperalgesia e alodinia mecânica foram avaliadas pela versão eletrônica dos Filamentos de von Frey e pelo método dos Filamentos de von Frey, respectivamente, nos tempos de 0, 0.5, 1, 3, 5 e 7 h após o estímulo. A hiperalgesia térmica foi avaliada em uma placa quente (± 52ºC) nos mesmos tempos que os experimentos anteriores (0, 0.5, 1, 3, 5 e 7 h) e através do método de Hargreaves, nos tempos de 0, 1, 3, 5 e 7 h após o estímulo. O teste de distribuição de peso entre as patas traseiras foi avaliado por meio do Static Weight Bearing em tempos igual ao método de Hargreaves (0, 1, 3, 5 e 7 h). O comportamento de dor manifesta foi avaliado através da contagem total das contorções abdominais (20 min após o estímulo), sacudidas e lambidas de pata (30 min após o estímulo). A produção de antioxidantes (ABTS), redução do O2•- (NBT) e da peroxidação lipídica (TBARS) foram avaliadas 3 h após o estímulo, com exceção do ensaio de catalase, avaliado 1 h após o estímulo. A produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-1ß e IL-6; ELISA) foi avaliado 3h e 30 min após o estímulo. A toxicidade do tratamento foi avaliado pelos ensaios de ALT, AST, ureia, creatinina e atividade da mieloperoxidase estomacal, 7 h após estímulo. O recrutamento de leucócitos (coloração hematoxilina & eosina e intensidade de fluorescência LysM-eGFP) e a presença de mastócitos (coloração azul de toluidina) foram avaliados 7 h após o estímulo. A expressão de astrócitos, de receptores GPR101 e de neurônios na medula espinal (intensidade de fluorescência) foi avaliada 5 h após o estímulo. Como resultados, a RvD5 reduz os comportamentos de dor (hiperalgesia, alodinia, desbalanço na distribuição de peso corporal e dor manifesta). Em conjunto, ela aumenta a capacidade antioxidante e reduz a produção de O2•-, a peroxidação lipídica, a produção de citocinas pró-inflamatórias, a migração de leucócitos e a presença de mastócitos, a expressão de astrócitos e de receptores GPR101. Tudo isso, sem causar danos gástricos, hepáticos ou renais. Dessa forma, este estudo evidenciou que a RvD5 demonstra uma ação analgésica segura em modelo de dor e inflamação desencadeada por EROItem Efeitos da melatonina sobre o perfil lipídico, estresse oxidativo e metabolismo energético hepático de ratos wistar pré-diabéticos(2024-11-01) Souza, Milena Cremer de; Seiva, Fábio Rodrigues Ferreira; Guarnier, Flávia Alessandra; Comar, Jurandir FernandoO quadro pré-diabético é associado com alterações no metabolismo glicolítico, lipídico e com o aumento do estresse oxidativo. A melatonina é uma indolamina lipofílica e pleiotrópica sintetizada na glândula pineal e em diferentes órgãos, como o fígado. Sua capacidade de modular o metabolismo energético em modelos diabéticos já é explorado. Considerando esse contexto, o intuito deste trabalho foi avaliar os efeitos da melatonina sobre o metabolismo energético hepático em um modelo de pré-diabetes induzido por dieta rica em sacarose associada à estreptozotocina (STZ). Para este fim foram utilizados 30 ratos Wistar machos de 30 dias de idade, inicialmente divididos nos grupos controle (C; n=10) e pré-diabético (PD; n=20). Ambos os grupos receberam ração comercial ad libitum e o grupo PD solução de sacarose 40% no lugar da água de beber. Após 4 semanas os animais do grupo PD receberam injeção i.p de STZ (50 mg/kg) para indução do quadro pré-diabético e foram divididos, aleatoriamente nos grupos PD e pré-diabético tratado com melatonina (PD-Mel). Este recebeu injeções i.p de melatonina (25 mg/kg) 3 vezes por semana durante 4 semanas. O tratamento com melatonina diminuiu a glicemia de jejum, mas a intolerância à glicose não foi diminuída e os parâmetros morfométricos corpóreos foram semelhantes nos 3 grupos experimentais. O consumo de ração nos grupos PD e PD-Mel foi cerca de 40% menor em comparação a C. No grupo PD os depósitos de gordura foram aumentados em 109,79% e a taxa de adiposidade em 100,28%. Após o tratamento com melatonina esses parâmetros foram diminuídos, respectivamente em 61,07% e 53,41%. O perfil lipídico dos animais foi modulado parcialmente pelo tratamento com melatonina. No soro os níveis de triglicérides (TG), aumentados em 42,85% no grupo PD foram normalizados no grupo PD-Mel. Os níveis de colesterol total (CT), aumentados em 21,83% em PD foram diminuídos em 12,8% em PD-Mel. No fígado a melatonina modulou o metabolismo energético. O grupo PD-Mel apresentou aumento de 187,27% na expressão de Glut2. A expressão de Ldha e atividade LDH, aumentadas em 99,7% e 62,67% em PD foram diminuídas em 45,98% e 26,11% no grupo PD-Mel, sugerindo diminuição da glicólise anaeróbica. A expressão de Hadh e atividade de ß-OHADH foram aumentadas, respectivamente, em 31,84% e 79,45% no grupo PD-Mel, inferindo aumento da ß-oxidação de ácidos graxos. O estresse oxidativo hepático foi evidenciado pela diminuição da atividade enzimática de SOD (23,55%), CAT (29,39%) e aumento da peroxidação lipídica (135,44%). O tratamento com melatonina aumentou a atividade de SOD em 16,42%, de CAT em 65,96% e diminuiu a peroxidação lipídica em 22,64%. Dessa forma é evidenciada a capacidade da melatonina em melhorar o perfil lipídico e modular o metabolismo energético e o estresse oxidativo em um quadro pré-diabéticoItem Estresse oxidativo sistêmico em pacientes com insuficiência venosa crônica(2023-12-07) Farias, Alanna Silva Huk; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Cecchini, Rubens; Lopes, Natália Medeiros DiasInsuficiência Venosa Crônica (IVC) é definida como conjunto de manifestações clínicas causadas pela anormalidade do sistema venoso periférico. O "aprisionamento de leucócitos" é o mecanismo responsável pela elevada permeabilidade da parede venosa e estresse oxidativo nas veias doentes. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil da resposta oxidativa de pacientes com IVC em estágios iniciais e em estágios avançados. Um total de 101 pacientes foram recrutados no ambulatório de Cirurgia Vascular do Hospital Municipal Santa Alice – cidade de Santa Mariana - para participar da pesquisa entre setembro de 2022 e abril de 2023. Os pacientes responderam a um questionário sobre idade, hábitos e doenças crônicas e amostras de sangue foram coletadas para análise dos parâmetros de estresse oxidativo. Os pacientes foram estratificados em 2 grupos de acordo com a classificação da insuficiência venosa crônica CEAP (Clínica, Etiológica, Anatômica e Fisiopatológica). O grupo 1 (n=73) inclui pacientes classificados como CEAP1, CEAP2 e CEAP3, enquanto o grupo 2 (n=28) inclui pacientes classificados como CEAP4, CEAP5 e CEAP6. Os eritrócitos foram utilizados para quantificar hidroperóxidos de membrana, glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD) e atividade da catalase (CAT). Os resultados da análise dos dados sociodemográficos mostraram a prevalência do sexo feminino nos dois grupos (p= 0,001) e o número de gestações (p= 0.002) teve uma relação significativa entre os dois grupos. Quanto aos parâmetros de estresse oxidativo, os pacientes do grupo 2 apresentaram níveis maiores (p= 0,002) de hidroperóxidos de membrana em relação ao grupo 1. A quantificação de GSH e SOD, e a atividade da CAT não se mostrou diferente entre os grupos. Baseado nos resultados pode-se inferir que há um desequilíbrio redox nos pacientes com IVC em estágios mais avançados pela presença importante de elevados níveis de hidroperóxidos de membranaItem Melatonina modula a atividade de lactato desidrogenase e reduz viabilidade e potencial migratório de células tumorais HuH7.5(2022-09-23) Cruz, Ellen Mayara Souza; Seiva, Fabio Rodrigues Ferreira; Mantovani, Mário Sergio; Venâncio, Emerson José; Pavanelli, Wander RogerioO Carcinoma Hepatocelular (CHC), uma neoplasia primária derivada dos hepatócitos, é um tipo agressivo de câncer, apresentando apenas 18% de sobrevida em 5 anos, baixa responsividade e recorrente quimiorresistência. Diversos estudos têm buscado por compostos alternativos capazes de diminuir o potencial proliferativo e que sejam efetivos no tratamento do CHC. A melatonina é uma indolamina secretada principalmente pela glândula pineal, contudo outros órgãos são capazes de produzir melatonina para seu próprio uso e em menor concentração, dentre eles o fígado. Estudos já demonstraram efeitos potenciais da melatonina em inibir a proliferação celular, antiangiogênese, imunomodulador e antimetastático. O presente estudo teve por objetivo explorar a atividade antitumoral da melatonina contra a linhagem celular de carcinoma hepatocelular HuH7.5. Inicialmente, foi avaliada a viabilidade celular da linhagem tratada com a melatonina (0,50 – 4 mM) nos tempos de 24 e 48h por ensaio de 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT). Após este ensaio, foram escolhidas as concentrações de 2 e 4 mM para os demais experimentos. Foram avaliadas alterações morfológicas e capacidade de migração celular por microscopia eletrônica de varredura e ensaio de cicatrização de ferida. Também foram feitas imunomarcações para N-caderina e TGF. Para avaliar as alterações no metabolismo energético foram dosadas as concentrações de glicose e lactato, bem como a atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH). Realizou-se também o ensaio de clonogenicidade, para análise de formação de colônias. As células tratadas com 2 e 4 mM apresentaram migração comprometida, além de alterações morfológicas como redução na microvilosidade, rompimentos nas junções aderentes e dano a membrana celular. Houve redução acentuada de N-caderina e TGF após os tratamentos. A melatonina reduziu os níveis de glicose, lactato e LDH intracelular, bem como o número de colônias formadas. Desse modo, foi possível verificar a ação citotóxica e antiproliferativa direta da melatonina sobre a linhagem tumoral, sugerindo a melatonina como uma candidata promissora para ser avaliada como coadjuvante no tratamento do CHCItem Metformina no câncer de tireoide em cultura celular: ação citotóxica da droga através da geração de estresse oxidativo(2025-03-07) Carrijo, Michelle Sanchez; Cecchini, Rubens; Luiz, Rodrigo Cabral; Kwasniewski, Fábio HenriqueO câncer de tireoide tem se tornado cada vez mais incidente na população, sendo o carcinoma papilífero de tireoide (CPT) o subtipo mais comum. A metformina é um fármaco antidiabético amplamente utilizado não só no tratamento de diabetes mellitus tipo 2 mas também tem demonstrado potenciais efeitos antitumorais em diversos modelos experimentais Este estudo teve como objetivo investigar o impacto da metformina sobre a viabilidade, proliferação, ciclo celular, morte celular e estresse oxidativo em células da linhagem K1 de CPT tratadas com o fármaco por 24 horas em concentrações de 40 e 60 µM. Os experimentos foram realizados in vitro, as células foram tratadas com diferentes concentrações de metformina (40 µM e 60 µM) e a avaliação de seus efeitos foram utilizando ensaios de viabilidade celular (MTT), clonogenicidade, ciclo celular, apoptose por anexina V/PI em citometria de fluxo, além da análise de parâmetros oxidativos por detecção de espécies reativas de oxigênio (ERO), lipoperoxidação de membrana (QL), níveis de peróxido de hidrogênio e atividade de antioxidante da GSH. Os resultados indicaram que a metformina reduziu a viabilidade celular da linhagem K1 em ambas as concentrações testadas. O tratamento induziu apoptose, promovendo um aumento expressivo na população de células em fase sub-G1. A capacidade clonogênica das células tumorais foi significativamente reduzida, indicando um efeito antiproliferativo do fármaco. Além disso, a metformina elevou a produção de ERO e lipoperoxidação, sugerindo que o estresse oxidativo pode estar envolvido no mecanismo de morte celular.Item Avaliação da atividade antitumoral e imunomoduladora da Trans-Chalcona e efeitos do tratamento sobre parâmetros de caquexia em modelo murino de câncer cervical(2025-02-21) Silva, João Manoel De Sousa; Pavanelli, Wander Rogério; Venâncio, Emerson José; Rodrigues, Ana Carolina JacobO câncer do colo do útero ocorre pela infecção genital persistente por tipos oncogênicos do HPV. No Brasil, excluindo-se os casos de câncer de pele não melanoma, o câncer do colo do útero ocupa a 6ª posição dentre todos os tipos de câncer e, entre a população feminina, este ocupa a 3ª posição, tendo sido previstos 17.010 novos casos por ano, para o triênio 2023-2025. Existem, atualmente, alguns quimioterápicos que são utilizados no tratamento do câncer cervical. Entretanto, estes fármacos causam, com frequência, alta toxicidade às pacientes. Dessa forma, faz-se necessária a busca de novos fármacos que apresentem maior seletividade para as células tumorais, e que causem menos efeitos tóxicos. A Trans-Chalcona é um composto natural presente em diversas famílias de plantas. Ela é uma precursora da biossíntese de flavonóides, grupo de metabólitos secundários envolvidos em mecanismos de adaptação e defesa de plantas. Possui amplo espectro de ação biológica, tendo sua atividade anticâncer já sido bem discutida na literatura, frente à diferentes tipos de linhagens de células tumorais. Contudo, a atividade antitumoral da Trans- Chalcona em modelos in vivo é escassa. No presente estudo, investigamos a atividade antitumoral e imunomoduladora da Trans-Chalcona, bem como seu efeito sobre a caquexia associada ao câncer, em modelo animal de câncer cervical. Foram utilizados camundongos C57BL/6 isogênicos, fêmeas, com idade de 6 a 8 semanas, obtidas do biotério do Departamento de Ciências Patológicas. Nestas, foram inoculadas, na região dorsolateral, células TC-1 na concentração de 2x105 células/100 μl de meio RPMI. Quando o tumor se tornou palpável, os animais foram divididos, de forma aleatória, entre os diferentes grupos, sendo estes o Grupo Histopatologia e Imunomarcações (GHI), Grupo Homogenato do Tumor (GHT). Cada grupo possui 3 subgrupos, sendo estes o subgrupo Controle Veículo (CV), o qual foi tratado com tween 80 10% + salina (n=8); o subgrupo Trans-Chalcona (TCh), o qual foi tratado com a mesma, na dose de 30 mg/kg (n=8), e o subgrupo Controle Positivo (Cis), o qual foi tratado com a Cisplatina, na dose de 2 mg/kg (n=8). Ambos os grupos CV e TCh foram tratados durante 14 dias consecutivos, por via intraperitoneal. O grupo Cis foi tratado uma vez por semana, durante duas semanas. Ao final do tratamento, os animais foram anestesiados, em seguida foi realizada a eutanásia destes por deslocamento cervical, e os tumores, sangue e músculos gastrocnêmio esquerdo e direito destes foram coletados. Foram avaliados os parâmetros de volume tumoral e peso corporal ao longo do período de tratamento. Os tumores dos animais do grupo GHI foram direcionados para cortes histológicos, com os quais foi realizada coloração com hematoxilina e eosina para avaliação de scor patológico. Os tumores dos animais do grupo GHT foram direcionados para dosagem de citocinas dos perfis Th1, Th2 e Th17 por citometria de fluxo, dosagem de Óxido Nítrico, Ânion Superóxido, Malondialdeído, FRAP e ABTS para avaliar o estresse oxidativo no tumor. O sangue dos animais foi direcionado para dosagem de IL-6 e IFN-γ plasmáticos. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Londrina, protocolo CEUA nº 015.2024. Ao fim dos experimentos, foi observado que o tratamento com a Trans-Chalcona promoveu inibição do crescimento tumoral de forma semelhante a cisplatina. Em elação à análise histopatológica, observou-se redução na vascularização no tecido tumoral. Quanto ao estresse oxidativo no microambiente tumoral, foi elucidado que o tratamento promoveu aumento dos níveis de ânion superóxido, de metabólitos do óxido nítrico e de malondialdeído, e diminuição do parâmetro de FRAP e uma tendência à diminuição do parâmetro de ABTS. Na avaliação da imunomodulação no microambiente tumoral, elucidou-se que o tratamento tanto com a TCh quanto com a Cis aumentou os níveis das citocinas IFN-γ e IL-17A, e reduziu os níveis das citocinas IL-4 e IL-6. Quanto aos efeitos sobre os parâmetros de caquexia, foi observado que ambos os tratamentos com a Trans-Chalcona e com a Cisplatina impediram a perda de peso e da massa muscular, promoveram redução dos níveis plasmáticos de IFN- γ e IL-6, reverteram a perda da força de preensão manual e a Trans-Chalcona atenuou a diminuição do consumo alimentar. De acordo com esses resultados, conclui-se que a Trans-Chalcona se mostra como um candidato promissor de fármaco antineoplásico para o tratamento de câncer do colo do útero associado ao HPV câncer cervicalItem Maresina 2 reduz dor e inflamação induzidas pela peçonha de Bothrops jararaca em camundongos(2023-11-24) Dantas, Kassyo Lenno Sousa; Verri Júnior, Waldiceu Aparecido; Kwasniewski, Fábio Henrique; Bertozzi, Mariana MarquesAs picadas de serpentes podem induzir inflamação e dor. A peçonha de Bothrops jararaca (BjV) causa dor intensa e prolongada que não é revertida pelo antiveneno, além de hemorragia, infiltrado de células inflamatórias e edema. A Maresina 2 (MaR2) é um Mediador Lipídico Pro-Resolução Especializado (SPM's) com propriedades anti-inflamatórias, pró-resolutivas e analgésicas. Neste estudo, investigamos a eficácia da MaR2 na redução da dor e inflamação induzidas por BjV em camundongos. Para isso, foi utilizado a avaliação da hiperalgesia mecânica (versão eletrônica dos filamentos de von Frey), a hiperalgesia térmica (teste de placa quente) e a distribuição de peso (suporte de peso estático), bem como a atividade da mieloperoxidase (ensaio MPO), a produção de ânion superóxido (O2- ) (ensaio NBT), níveis totais de antioxidantes (ensaio ABTS) e os níveis de citocinas TNF-a, IL-1ß e IL-6 no tecido plantar de camundongos após injeção intraplantar de BjV em diferentes doses (0.01, 0.1 e 1 µg). O pré-tratamento intraperitoneal com MaR2 (0.3, 1 e 3 ng) reduziu de maneira dose-dependente a hiperalgesia mecânica e térmica, normalizou a distribuição do peso, inibiu a atividade da MPO, a produção de O2- e promoveu o aumento dos níveis totais de antioxidantes no tecido, bem como a redução dos níveis de TNF-a, IL-1ß e IL-6. Em modelo de peritonite induzida pela injeção intraperitoneal de BjV em diferentes doses (1, 3 e 5 µg), avaliamos o recrutamento de leucócitos (contagem de leucócitos totais), a hemorragia (contagem total de eritrócitos), os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico intracelular (NO) (ensaio DCF e DAF, respectivamente), produção de O2- (ensaio NBT e células NBT-positivas) e a expressão de mRNA de gp91phox e óxido nítrico sintase induzível (iNOS) (RT-qPCR). O pré-tratamento intraperitoneal com MaR2 (0.1, 1 e 10 ng) reduziu de maneira dose-dependente o recrutamento de leucócitos, a hemorragia, os níveis de ROS, NO e O2-, bem como a expressão de mRNA de gp91phox e iNOS. Portanto, usando modelos de dor inflamatória na pata e a peritonite, demonstramos que a MaR2 é um mediador promissor para o tratamento da dor e inflamação induzidas por BjV.Item Associação das variantes genéticas rs5742909, rs231775 e rs3087243 de CTLA4 com a infecção pelo Papilomavírus Humano, no desenvolvimento de lesões intraepiteliais e no câncer cervical(2024-06-18) Oliveira, Maylla Cardoso de; Oliveira, Karen Brajão de; Guembarovski, Roberta Losi; Reiche, Edna Maria VissociResumo: O antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico (CTLA-4) é um receptor expresso na superfície de células T regulatórias (Tregs), T CD4+ e CD8+, sendo altamente expresso em Tregs e, quando ativo, regula negativamente a proliferação e ativação da própria célula T. Variantes de nucleotídeo único (SNVs) no gene que codifica o CTLA-4 podem levar à substituição de aminoácidos, alterar o splicing do mRNA e influenciar a expressão deste gene, afetando a resposta imunológica contra o Papilomavírus Humano (HPV) e o processo de malignização cervical. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho consistiu em avaliar a associação dos alelos, genótipos e haplótipos das SNVs rs5742909 (-318 C>T), rs231775 (+49 A>G) e rs3087243 (+6230 G>A) de CTLA4 com a infecção pelo HPV, no desenvolvimento de lesões intraepiteliais escamosas e no câncer cervical em uma amostra de mulheres atendidas pelo serviço público de saúde do Paraná, Brasil. Foram coletadas amostras de sangue periférico e de secreção cervical para extração de DNA genômico, utilizado para genotipagem das variantes genéticas (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real) e caracterização da presença de HPV (PCR convencional). As combinações haplotípicas das SNVs de CLTA4 foram inferidas pelo software PHASE e as análises estatísticas foram realizadas no software SPSS Statistics, adotando-se nível de significância de p<0,05. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Universidade Estadual de Londrina (CAAE 38937520.2.0000.5231). Foram incluídas 445 mulheres no estudo, agrupadas inicialmente de acordo com a presença (n=264) ou ausência (n=181) de infecção pelo HPV. O grupo com infecção pelo HPV foi subdividido de acordo com o grau de lesão: sem lesão (n=84), lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LIEBG) (n=19), lesão intraepitelial escamosa de alto grau (LIEAG) (n=56) e câncer cervical (n=105). Ao analisar a SNV rs5742909 (-318 C>T), pôde-se observar que mulheres com genótipo CT tiveram maior probabilidade de ter HPV do que aquelas com genótipo CC e mulheres portadoras do alelo T estavam mais suscetíveis ao desenvolvimento de HSIL e câncer cervical do que mulheres com o genótipo CC. Em relação a SNV rs3087243 (+6230 G>A), observou-se as mulheres portadores do alelo A tinham menor probabilidade de desenvolver LSIL do que mulheres com o genótipo GG. Não foi encontrada associação significativa relacionada a SNV rs231775 (+49 A>G). Na análise de haplótipos observou-se que mulheres heterozigotas para TAG tinham maior probabilidade de terem a infecção pelo HPV do que aquelas que possuíam outro haplótipo analisado. Além disso, as mulheres que eram homozigotas para TAG estavam mais suscetíveis a desenvolver LIEAG e malignização cervical do que aquelas que não eram portadoras do haplótipo TAG. Esse é o primeiro trabalho que avalia a associação das SNVs rs5742909 (-318 C>T), rs231775 (+49 A>G) e rs3087243 (+6230 G>A) de CTLA4 com a infecção pelo HPV, no desenvolvimento de lesões intraepiteliais e no câncer cervical em mulheres brasileiras, sendo importante para a caracterização genética dessas pacientes. Uma maior compreensão do papel das variantes genéticas de CTLA4 pode contribuir para o estabelecimento de novos biomarcadores e o desenho de tratamentos com alto nível de especificidade.Item Desenvolvimento de doença periodontal na síndrome metabólica murina: efeito do tratamento com aspirina(2023-12-18) Rossi, Lucas Sobral de; Pinge Filho, Phileno; Kwasniewski, Fábio Henrique; Ishiuchi, Giovana Gomes de Carvalho; Pinge, Marli Cardoso MartinsA doença periodontal (PD) é uma condição inflamatória crônica multifatorial associada à formação de biofilmes bacterianos na superfície dos dentes, afetando os tecidos de suporte. Essa doença está relacionada a condições sistêmicas como diabetes tipo 2, hipertensão e obesidade abdominal, características clássicas da síndrome metabólica (MetS). Embora os usos e efeitos da aspirina (ASA) sejam bem conhecidos, seus efeitos no contexto da PD e MetS ainda não estão totalmente esclarecidos. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o impacto da ASA em um modelo de camundongo com MetS e PD simultâneas. Para isso, camundongos Swiss fêmeas recém-nascidos receberam glutamato monossódico (MSG) (4 mg kg-1 dia, s.c.) nos primeiros 5 dias de vida para induzir a MetS, enquanto o grupo de controle (SAL) recebeu uma solução salina equimolar. No 60º dia, a PD foi induzida em ambos os grupos MSG e SAL. A MetS foi caracterizada usando o índice de Lee, níveis de glicose no sangue e parâmetros cardiovasculares. As maxilas foram avaliadas por microtomografia e análise histopatológica, revelando perda significativa de osso após a indução da PD. Os animais MSG apresentaram índices de Lee elevados, maior massa de tecido adiposo, hipertensão e níveis elevados de glicose no sangue em comparação com o grupo SAL. Independentemente da MetS, os animais submetidos à indução da PD exibiram níveis reduzidos de osso em comparação com seus respectivos controles. A reabsorção óssea alveolar foi significativamente maior nos grupos MSG em relação aos seus controles. Os animais SAL tratados com ASA apresentaram menor perda óssea do que os equivalentes do grupo MSG. Os níveis de óxido nítrico (NO) gengival, determinados pela reação de Griess/Cádmio, foram mais elevados em animais com PD. Uma correlação robusta de Pearson foi estabelecida, associando a perda óssea aos níveis de NO gengival. Esses resultados sugerem um mecanismo protetor da ASA contra a perda óssea em animais não obesos com PD, um efeito ausente em animais MSG. Consequentemente, este estudo fornece novas perspectivas sobre a intricada relação entre obesidade e PD em camundongos.Item Estudo da síndrome metabólica em camundongos Swiss fêmeas submetidos a sepse severa: avaliação dos parâmetros cardiovasculares, inflamatórios e hematológicos(2024-05-07) Berto-Pereira, Leonardo; Pinge, Marli Cardoso Martins; Guarnier, Flávia Alessandra; Uchoa, Ernane Torres; Pinge Filho, PhilenoA obesidade é considerada uma doença complexa que ocorre mediante interação entre uma predisposição genética e fatores ambientais, definida como um excesso de gordura corporal resultante de um balanço energético inadequado por um longo período. O quadro de obesidade está também associado ao desenvolvimento de diversas outras complicações, como hiperglicemia, hipertrigliceridemia, dislipidemia e hipertensão. Quando indivíduos apresentam pelo menos três dessas complicações, clinicamente são diagnosticados com síndrome metabólica (Smet). Outro problema de saúde pública é a sepse, definida como uma disfunção orgânica com risco de vida causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. A sepse é considerada uma das causas mais comuns de morte em unidades de terapia intensiva (UTI), apresentando um diagnóstico difícil devido às múltiplas comorbidades e doenças subjacentes que os indivíduos desenvolvem. Dados recentes mostraram que camundongos machos com síndrome metabólica apresentam melhor prognóstico e sobrevida quando submetidos a uma condição séptica moderada, corroborando com a teoria do paradoxo da obesidade. Nesse estudo, animais com Smet apresentam hipertensão e quando estes são submetidos à condição séptica por ligadura e punção do ceco (CLP) que, em animais controle promove hipotensão, estes não apresentam alterações significativas na pressão arterial. No entanto, essa associação não foi avaliada ainda em fêmeas, inclusive se as mesmas apresentam um perfil dentro do paradoxo da obesidade. Dessa maneira, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da Smet em camundongos Swiss fêmeas submetidos à sepse polimicrobiana severa induzida por CLP. A Smet foi induzida em camundongos Swiss neonatos através de injeção subcutânea de glutamato monossódico (MSG) com 4mg/g de peso corporal do dia 1 ao dia 5 após o nascimento.Os animais do grupo controle (CTL) foram tratados com solução salina equimolar na mesma concentração e período. No 75° dia de vida, o modelo CLP foi utilizado para induzir sepse polimicrobiana severa. Para os parâmetros inflamatórios avaliamos o óxido nítrico (NO), determinado pela técnica de cádmio e Griess e a quantificação de IL-6 através da técnica de ELISA. A dosagem de glicose foi realizada 24 horas antes e 24 horas após CLP por monitor de glicose, e o perfil lipídico foi dosado a partir de kit comercial. Os parâmetros cardiovasculares foram mensurados utilizando a plataforma CODA e a avaliação hematológica foi determinada por contagem padrão. A Smet não alterou a sobrevida dos animais submetidos à sepse, visto que os grupos CTL e Smet CLP apresentaram quadro de hipotensão e hipoglicemia, acompanhado de leucopenia e aumento de citocina inflamatória IL-6. Com isso, podemos concluir que a teoria do paradoxo da obesidade não é observada nas fêmeas, embora tenha sido observado que a Smet atenue alguns parâmetros durante a sepse, como hematológicos e resistência ao aumento de NO. Esses achados fornecem novas informações para a literatura relacionando a Smet e sepseItem Genes diferencialmente expressos no carcinoma hepatocelular: abordagem in silico para o reposicionamento de fármacos(2024-03-01) Caputo, Wesley Ladeira; Seiva, Fábio Rodrigues Ferreira; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Garcia, Vitor Augusto dos SantosO reposicionamento de medicamentos é uma estratégia que complementa a abordagem convencional no desenvolvimento de novos fármacos. O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma doença prevalente e agressiva, necessitando de uma compreensão mais detalhada das alterações moleculares envolvidas para o tratamento adequado. Nesse estudo, buscamos em banco de dados experimentais de microarray e RNA-seq por genes diferencialmente expressos (DEGs) em células de CHC e saudáveis. Por meio de distintos processos de filtragem, identificamos e enriquecemos DEGs, bem como classes distintas de possíveis novos medicamentos capazes de atuar sobre esses genes. A análise de enriquecimento funcional revelou características biológicas distintas: Processos químicos associados a íons metálicos, incluindo zinco, cádmio e cobre, potencialmente implicando exposição crônica a íons metálicos na tumorigenese, foram eventos associados aos genes que estão regulados negativamente no CHC. Por outro lado, genes regulados positivamente foram associados com eventos mitóticos e atividades de quinase, alinhando-se com a relevância das quinases no CHC. Para investigar redes de interação entre os DEGs, empregamos métodos de análise topológica, identificando 25 genes centrais e seus fatores de transcrição. Na busca de potenciais opções terapêuticas, exploramos estratégias de reaproveitamento de medicamentos com base em abordagens computacionais, analisando seu potencial para reverter os padrões de expressão de genes-chave, incluindo AURKA, CCNB1, CDK1, RRM2 e TOP2A. Potenciais candidatos farmacológicos foram alvocidib, AT-7519, kenpaullone, PHA-34 793887, JNJ-7706621, danusertiba, doxorrubicina e análogos, mitoxantrona, podofilox, teniposide e amonafide. Este estudo in silico ofereceu uma visão abrangente dos DEGs no CHC, lançando luz sobre potenciais alvos terapêuticos como os genes CDK1, RRM2 e TOP2A e oportunidades para experimentações futuras com o reposicionamento de medicamentosItem Atividade antitumoral in vitro do 3,3’,5,5’-tetrametoxibifenil-4,4’-diol sobre as linhagens HuH7.5 e HepG2/C3A de carcinoma hepatocelular humano(2022-03-11) Inoue, Fabricio Seidy Ribeiro; Pavanelli, Wander Rogério; Bortoleti, Bruna Taciane da Silva; Sapla, Milena Menegazzo MirandaDentre os cânceres hepáticos primários, o carcinoma hepatocelular (CHC) é o mais incidente e agressivo, apresentando apenas 18% de sobrevida em 5 anos, baixa responsividade e recorrente resistência à quimioterapia devido a heterogeneidade molecular encontrada nos tumores. Neste contexto, a utilização de compostos fenólicos como alternativa terapêutica para o câncer tem sido o foco de muitos estudos devido às suas propriedades biológicas como antimutagenicidade, anti-inflamatória e antiproliferativa. O 3,3’,5,5’-tetrametoxibifenil-4,4’-diol (TMBP) é um composto biossintético obtido através da oxidação do 2,6-dimetoxifenol por meio da biotransformação enzimática. Em estudos prévios utilizando o TMBP, foi demonstrado sua capacidade antiproliferativa sobre a linhagem A549 (adenocarcinoma pulmonar). O presente trabalho propôs explorar a atividade antitumoral do TMPB sobre as linhagens HuH7.5 e HepG2/C3A (CHC), assim como os mecanismos de morte celular envolvidos. Inicialmente, foi avaliada a viabilidade celular das linhagens tratadas com o TMBP (12,5–150 µM) nos tempos de 24 e 48h por ensaio de MTT. Posteriormente foram calculadas as concentrações inibitórias mínimas de 50% (IC50), utilizadas para os experimentos seguintes. Para a confirmação do ensaio de viabilidade, foi realizado contagem através do método de exclusão azul de tripan. Para a análise dos efeitos celulares foram avaliadas as alterações morfológicas, ultraestruturais e capacidade de migração celular por microscopia eletrônica e ensaio de cicatrização de ferida. Como forma de avaliar as alterações metabólicas após tratamento com IC50 foram mensuradas espécies reativas de oxigênio (ERO) total for fluorescência, utilizando a sonda de diacetato de 2’,7’-diclorohidrofluoresceína (H2DCFDA), óxido nítrico (NO) pelo método de Griess, potencial de membrana mitocondrial, vacúolos autofágicos e gotículas lipídicas por métodos de fluorescência utilizando as marcações tetrametilrodamina (TMRE), monodansilcadaverina (MDC) e vermelho neutro (NR), respectivamente. A distribuição do ciclo celular também foi avaliada, juntamente com o ensaio de caracterização de morte celular por citometria de fluxo. O tratamento com TMBP reduziu a viabilidade celular em todas as concentrações testadas, chegando aos valores de IC50 de 68 e 50 µM em 24h para as linhagens HuH7.5 e HepG2/C3A, respectivamente, os quais foram utilizados para os seguintes experimentos. As células tratadas apresentaram migração comprometida, além de severas alterações morfológicas. O tratamento induziu aumento nos níveis de ERO e NO, despolarização da membrana mitocondrial e ativação de mecanismos de adaptação, como aumento da biosíntese de gotículas lipídicas e vacúolos autofágicos em ambas as linhagens, tais alterações foram validadas através das alterações ultraestuturais. Além disso o tratamento com TMBP promoveu similarmente nas duas linhagens a parada do ciclo celular na fase G2/M, e induziu a morte celular por apoptose. Desse modo, foi possível verificar a ação citotóxica e antiproliferativa direta do TMBP sobre as linhagens tumorais, indicando este composto como um candidato promissor ao desenvolvimento de uma droga antitumoralItem Nanopartícula biogênica de prata induz morte de esquistossômulos e vermes adultos de Schistosoma mansoni e reduz carga parasitária na esquistossomose mansônica experimental(2020-11-27) Detoni, Mariana Barbosa; Pavanelli, Wander Rogério; Bidoia, Danielle Lazarin; Pereira, Vanessa Carregaro; Sapla, Milena Menegazzo MirandaA esquistossomose constitui uma doença parasitária aguda e crônica causada por trematódeos do gênero Schistosoma, a qual está incluída na lista de Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Atualmente, a quimioterapia representa o principal recurso para minimizar a prevalência e incidência desta doença no mundo. O tratamento atual é baseado na administração do Praziquantel (PZQ), quimioterápico ineficaz contra formas imaturas do parasito, tampouco durante a formação dos granulomas, além de demonstrar que é capaz de induzir resistência do parasito ao medicamento em casos de uso constante. Desta forma, é necessário a busca por novas alternativas terapêuticas que atuem nas diferentes formas evolutivas do parasito bem como durante a patologia. Em vista disso, este estudo buscou avaliar a ação esquistossomicida in vitro e in vivo de nanopartículas biogênicas de prata (AgNp-Bio) produzidas extracelularmente utilizando fungo filamentoso Fusarium oxysporum. Inicialmente, esquistossômulos de S. mansoni foram expostos a diferentes concentrações de AgNp-Bio (0.2-10 µg/mL) e avaliados quanto à viabilidade, sendo determinada a concentração letal para 50% dos parasitos (LC50) de 0,84 µg/mL e avaliada alteração de integridade de membrana. Vermes adultos foram avaliados quanto à motilidade, viabilidade, metabolismo mitocondrial, alterações morfológicas, além de parâmetros de estresse oxidativo, como avaliação de espécies reativas de oxigênio (ERO), determinação dos níveis de óxido nítrico (NO), e malondialdeído (MDA). Em relação aos mecanismos envolvidos na morte de vermes adultos, o estudo também avaliou alteração do potencial de membrana mitocondrial e da membrana celular, formação de vacúolos autofágicos, além da produção de corpos lipídicos. Como resultado, foi determinada LC50 de 12,62 µg/mL, com perda de motilidade e indução de danos tegumentares. Quanto aos possíveis mecanismos envolvidos na morte do parasito AgNp-Bio foi capaz de promover estresse oxidativo nos vermes adultos tratados através do aumento da produção ERO, bem como aumento de NO e MDA. Também foi avaliado que o composto induziu despolarização da membrana mitocondrial, formação de vacúolos autofágicos e perda da integridade da membrana plasmática. Em relação a infecção experimental, camundongos BALB/c tratados por via oral com AgNp-Bio nas doses de 0,25; 0,5 e 1 mg/kg não apresentaram toxicidade significativa. Posteriormente, o tratamento com 0,5 mg/kg de AgNp-bio em camundongos infectados por S. mansoni demonstrou redução total de vermes perfundidos do sistema porta-hepático e da contagem de ovos retidos no fígado, bem como diminuição da hepatoesplenomegalia, com resultados semelhantes aos tratados com PZQ. Em vista disso, os resultados demonstraram que AgNp-Bio apresenta ação esquistossomicida, induzindo a morte de formas imaturas e de vermes adultos, e contribuindo para a redução da patologia associada à doençaItem Efeitos do tratamento isolado e combinado de aspirina e benznidazol sobre lesões neuronais mioentéricas observadas no modelo murino da doença de Chagas(2020-04-27) Dionisio, Joyce Hellen Ribeiro; Araújo, Eduardo José de Almeida; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Ceravolo, Graziela ScaliantiA Doença de Chagas (DC) é a manifestação clínica causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. As manifestações clínicas da DC são características da fase crônica. Dos indivíduos infectados pelo T.cruzi, de 30- 40% evoluem para a fase crônica, podendo apresentar manifestações cardíacas ou digestivas. O megaesôfago e o megacólon são as maiores causas de morbidade na forma clínica digestiva da DC crônica. A forma digestiva da DC é caracterizada por alterações na função motora, secretória e absortiva do trato gastrointestinal, resultante de lesões no plexo mioentérico, um dos principais componentes do Sistema Nervoso Entérico (SNE). Para que ocorram as lesões no plexo mioentérico e desenvolvimento das manifestações digestivas, estudos indicam a existência de mecanismos mistos, com participação direta do parasita e reações autoimunes. Existem no mercado dois fármacos para o tratamento da DC: Benznidazol (BZN) e Nifurtimox. O BZN é o fármaco de primeira escolha para o tratamento da DC. Esse medicamento apresenta eficácia limitada dependendo da fase da doença, além de apresentar efeitos adversos, que muito frequentemente, levam à interrupção do tratamento pelo paciente. A ação desse fármaco está relacionada a danos em macromoléculas do parasito, como o DNA. Durante a fase crônica da DC, os danos teciduais observados no hospedeiro são decorrentes da resposta inflamatória, e não da presença do parasito nas lesões, sendo a utilização de anti-inflamatórios uma estratégia para controle das alterações crônicas na DC. Neste sentido, estudos têm demonstrado que a utilização de baixas doses de anti-inflamatórios, como a aspirina (ASA), tem apresentado bons resultados no controle do parasito, além de neuropreservação. O objetivo desse estudo foi avaliar a eficácia do tratamento isolado e combinado do BZN e ASA sobre neurônios do plexo mioentérico de camundongos infectados com T. cruzi. Para isso, camundongos machos BALB/c foram distribuídos em cinco grupos (n=5): controle, infectado sem tratamento, infectado+ASA, infectado+BZN e infectado+ASA+BZN. Os camundongos foram infectados por via intraperitoneal, com 5x102 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y de T. cruzi (CEUA/UEL nº03/2019). Quarenta e oito horas após a infecção, os tratamentos foram iniciados e tiveram duração de trinta dias. A dose de ASA e BZN foi de 25mg/kg/dia via gavagem. A parasitemia foi avaliada em dias alternados a partir 2º dia pós infecção, por um período de 31 dias. Os animais foram submetidos a eutanásia 180 dias após a infecção e, durante esse período, a taxa de sobrevida foi avaliada. Foram avaliados o comprimento e largura do cólon dos camundongos, para posterior cálculo da área do órgão. As amostras de cólon foram submetidas a técnica de imunofluorescência para marcação da população neuronal mioentérica geral (PGP9.5+), colinérgica (ChAT+) e nitrérgica (nNOS+). Contou-se o número total de células presentes em 32 imagens microscópicas advindas de cada animal. A área do cólon de todos os animais infectados pelo T.cruzi encontrava-se maior quando comparada a de camundongos não infectados. A parasitemia comprova a infecção pelo T.cruzi. A ASA administrada de forma isolada não foi capaz de controlar de forma eficiente a parasitemia, pois apresentou comportamento semelhante aos animais infectados sem tratamento. O grupo infectado+BZN e infectado+ASA+BZN apresentaram parasitemia semelhante, com baixo pico parasitêmico ao 7º dia pós infecção. Os animais dos grupos infectados+BZN e infectados+ASA+BZN apresentaram taxa de sobrevida semelhantes ao grupo sem infecção. A densidade populacional de neurônios gerais e colinérgicos estava diminuída nos animais infectados sem tratamento, mesmo após aplicar fator de correção devido ao aumento da área colônica. Essa mesma redução foi observada nos grupos infectados+ASA e infectados+BZN, quando comparados ao grupo controle. Os animais infectados+ASA+BZN apresentaram preservação para população neuronal geral e subpopulação colinérgica. A subpopulação nitrérgica apresentou redução numérica nos animais infectados sem tratamento e infectados+BZN, quando consideradas as amostras avaliadas. Os grupos infectados+ASA e infectados+ASA+BZN se mostrou preservada nessas amostras. Porém quando aplicamos o fator de correção para a área do órgão, observou-se que a subpopulação nitrérgica não foi alterada em nenhum dos grupos avaliados. Durante a infecção ocorreu alteração morfológica nos corpos celulares dos neurônios. A subpopulação neuronal nitrérgica dos camundongos pertencentes aos grupos infectados sem tratamento, infectados+ASA e infectados+ASA+BZN encontrava-se hipertrofiada quando comparada a do grupo controle. Já nos camundongos infectados tratados com BZN, observou-se atrofia do corpo celular. Em relação aos neurônios colinérgicos, somente o grupo infectado+ASA apresentou alteração morfométrica (hipertrofia) do corpo celular. A neuropreservação promovida pela combinação ASA+BZN se mostrou superior aos tratamentos administrados de forma isolada, também sendo capaz de promover sobrevida dos camundongos BALB/c infectados com T. cruzi.Item Ação anti-toxoplasma do ácido cafeico em modelo de infecção congênita in vitro(2022-08-18) Santos, Yasmin Munhoz; Costa, Idessania Nazareth; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Sanfelice, Raquel Arruda da SilvaToxoplasmose é a infecção causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, que assume caráter grave em indivíduos imunocomprometidos, na toxoplasmose ocular e principalmente em casos de infecção congênita. O tratamento da toxoplasmose é dificultado pela toxicidade apresentada pelos fármacos convencionais, sulfadiazina e pirimetamina, e por isso, outros compostos vêm sendo avaliados como tratamento alternativo para esta infecção. O ácido cafeico é um composto fenólico, encontrado em abundância em muitas plantas e alimentos com comprovados efeitos antimicrobiano, antioxidante, anti-Leishmania e anti- tripanossomal. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito anti- proliferativo, imunológico, bem como os mecanismos envolvidos no processo de morte de formas taquizoítas de Toxoplasma gondii (cepa RH) e na infecção de células trofoblásticas extravilosas HTR8/Svneo utilizando ácido cafeico. Para isso, foi avaliada a citotoxicidade do tratamento com AC em células HTR8/SVneo pelo ensaio de resazurina. A viabilidade dos taquizoítas foi realizada utilizando método de exclusão por azul de tripan. A atividade antiproliferativa do tratamento com AC foi determinada pelos índices de infecção e proliferação intracelular do parasito e confirmados também pela microscopia ótica. Os mecanismos envolvidos na morte do parasito analisados foram, níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO), óxido nítrico (NO), potencial de membrana mitocondrial e gotículas lipídicas. Apoptose e permeabilização da membrana plasmática foram avaliados através da marcação com Anexina-V e iodeto de propídeo, além de autofagia por monodansilcadaverina. Por fim foi analisada a produção de citocinas pró e antiinflamatórias. Os resultados demonstram que AC não apresenta toxicidade para células HTR8/SVneo e diminui a viabilidade de taquizoítas de T.gondii. Houve redução da infecção e da proliferação intracelular, com aumento da produção das interleucinas IL-1ß, MIF e TGF-ß. Além disso no parasito foi observado aumento de NO e ERO, despolarização da membrana mitocondrial, formação de gotículas lipídicas e morte sugestiva de apoptose. Ácido cafeico portanto é um potencial candidato para novos estudos que visam o desenvolvimento de terapias para toxoplasmose congênitaItem Mulheres com COVID-19 internadas na UTI do Hospital Universitário de Londrina: um cohort de mulheres com desfecho de alta e óbito(2023-07-27) Melo, Jôse de; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Cecchini, Rubens; Souza Neto, Fernando Pinheiro deNos últimos dois anos, muitas publicações científicas foram divulgadas com o intuito de aprimorar o entendimento da fisiopatologia e das manifestações da COVID-19. Embora as pesquisas clínicas tenham fornecido importantes informações sobre a doença, a identificação de possíveis marcadores que possam influenciar a evolução do paciente internado é crucial para compreender não apenas a COVID-19, mas também a resposta oxidativa e sistêmica do organismo diante de doenças virais. Considerando que as mulheres apresentam uma resposta mais eficaz ao vírus, este estudo foi desenhado com pacientes do sexo feminino, identificando os fatores que podem influenciar o desfecho de alta ou óbito, chamado de sobreviventes e não sobreviventes, neste estudo. Utilizando marcadores hematológicos, bioquímicos e de estresse oxidativo para comparação, evidenciamos que pacientes não sobreviventes possuiam níveis maiores de marcadores oxidativos sistêmicos,um marcador secundário de lipoperoxidação de membrana. Além disso, as sobreviventes apresentam parâmetros hematológicos e bioquímicos mais próximos da normalidade. Esse estudo é importante para trazer o destaque da análise de moléculas oxidantes e antioxidantes como marcadores que possam ser utilizados para acompanhamento da COVD-19.Item Avaliação da neoglicogênese hepática e das citocinas circulantes na caquexia induzida por tumor Walker-256(2010-02-25) Moreira, Carolina Campos Lima; Souza, Helenir Medri de; Batista, Márcia Regina; Zaia, Cássia Thaïs Bussamra VieiraA caquexia neoplásica é caracterizada por um conjunto de desvios metabólicos provocados por diversos fatores denominados mediadores da caquexia. Poucos estudos têm investigado as alterações metabólicas hepáticas na caquexia associada ao câncer, não havendo consenso se a neoglicogênese está aumentada ou diminuída nesta patologia. Além disso, não há estudos sobre as concentrações circulantes de citocinas durante o processo de desenvolvimento do tumor Walker-256. O objetivo deste estudo foi avaliar a neoglicogênese hepática e parâmetros metabólicos relacionados, bem como as concentrações séricas de citocinas, em ratos portadores de caquexia induzida por tumor Walker-256, em diferentes estágios do desenvolvimento tumoral. Para a implantação do tumor, 8x107 células Walker-256 (grupo WK) foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito traseiro de ratos machos Wistar (220-230 g). Animais controles foram inoculados com PBS (salina tamponada com fosfato) no mesmo local. A neoglicogênese hepática e os parâmetros metabólicos relacionados foram avaliados em estudos de perfusão de fígado in situ, a partir dos precursores alanina, piruvato, lactato ou glicerol, no 5º (WK 5º) e 8º (WK 8º) dia após a inoculação das células tumorais. As citocinas séricas, fator de necrose tumoral a (TNFa) e as interleucinas 1ß (IL-1ß) e 6 (IL-6), foram avaliadas no 2º, 5º, 8º, 11º e 14º dia de desenvolvimento tumoral. Os resultados demonstraram redução (p<0,05) da produção hepática de glicose e do consumo de oxigênio a partir da alanina 2,5 mM nos grupos WK 5º e WK 8º. Nestes estudos de perfusão com alanina, houve aumento (p<0,05) da produção hepática de piruvato e lactato e tendência de aumento na produção hepática de uréia no grupo WK 5º, enquanto no grupo WK 8º houve tendência de redução na produção hepática de piruvato, lactato e uréia. A produção hepática de glicose e o consumo de oxigênio a partir do piruvato 5 mM ou lactato 2 mM foram também reduzidos (p<0,05) nos animais portadores de tumor (WK 5º e WK 8º), exceto para o grupo WK 5º que apresentou apenas tendência de redução no consumo de oxigênio a partir do piruvato. Entretanto, a produção de glicose e o consumo de oxigênio a partir do lactato 5,5 mM (grupo WK 8º) ou a partir do glicerol 2 mM (grupos WK 5º e WK 8º) não foram reduzidos nos animais portadores de tumor. As concentrações séricas de TNFa, IL-1ß e IL-6 foram indetectáveis nos ratos portadores de tumor (grupos WK 2º, WK 5º, WK 8º, WK 11º e WK 14º). Os resultados permitiram concluir que houve inibição da neoglicogênese hepática a partir dos precursores alanina, piruvato e lactato, mas não a partir do glicerol, no 5º e 8º dia de desenvolvimento tumoral. Estes achados, juntamente com os de produção hepática de lactato, piruvato e uréia a partir da alanina, permitem sugerir que houve inibição de enzimas regulatórias da neoglicogênese, como a piruvato carboxilase e/ou PEPCK (fosfoenolpiruvato carboxiquinase) e tendência de inibição da alanina aminotransferase (WK 8º), mas não houve inibição de enzimas que catalisam reações posteriores à entrada do glicerol (frutose 1,6-bifosfatase e glicose 6-fosfatase), nos ratos portadores de tumor. É possível que o TNFa, a IL-1ß e a IL-6, produzidos localmente no fígado e em outros tecidos, estejam atuando como mediadores autócrinos/parácrinos e inibindo a expressão e/ou atividade destas enzimas regulatórias da neoglicogênese. Os dados também indicam, como demonstrado pela inibição da produção hepática de glicose a partir do lactato 2 mM, mas não a partir do lactato 5,5 mM, que houve alteração da concentração saturante de lactato, nos fígados dos animais portadores de tumor. Assim, é possível que a produção hepática de glicose a partir de maiores concentrações circulantes de lactato, como as observadas nos ratos portadores de tumor, contribua para o impedimento de hipoglicemia acentuada e, portanto para o prolongamento da vida no estado portador de tumor