Taxonomia e diversidade genética de rizóbios microssimbiontes de distintas leguminosas com base na análise polifásica (Box-PCR e 16 S RNAr) e na metodologia de MLSA
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Resumo: O termo genérico “rizóbio” se aplica às bactérias capazes de fixar nitrogênio atmosférico (N2) e convertê-lo a uma forma assimilável pela planta, quando estas se encontram em simbiose com determinadas plantas da família Leguminosae Contudo, apesar da importância ecológica e econômica, os rizóbios têm sido relativamente pouco estudados Baseado nos dados de seqüenciamento do gene ribossomal 16S, existem, atualmente, cinco gêneros de rizóbios descritos, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium (=Ensifer) e Mesorhizobium, todos pertencentes à subclasse alfa das Proteobacterias Além disso, existem outras bactérias recentemente descritas e também denominadas como rizóbios, por serem microssimbiontes de leguminosas, e que pertencem a gêneros bastante distintos, tanto na subclasse alfa (Devosia, Methylobacterium), como na subclasse beta (Ralstonia, Burkholderia) Embora o gene ribossomal 16S seja hoje a molécula mais utilizada para estimar relações filogenéticas em procariotos, a elevada conservação na seqüência nucleotídica deste gene observada entre diferentes grupos bacterianos é uma limitação para a determinação das espécies Assim, vários estudos vêm sendo conduzidos, a fim de determinar metodologias alternativas para estudos de diversidade, bem como filogenia e taxonomia rizobiana Uma metodologia amplamente utilizada em estudos de diversidade tem sido a técnica de BOX-PCR Com base nessa técnica, é possível obter, através de reações de PCR, perfis genômicos de bactérias Por outro lado, recentemente foi proposta a metodologia de MLSA (“multi locus sequencing analysis”), como uma nova estratégia para os estudos de filogenia e taxonomia em procariontes Tendo em vista a elevada diversidade genética de rizóbios tropicais ainda pouco estudada, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a diversidade genética de estirpes de rizóbios simbiontes de distintas leguminosas de importância agrícola e ambiental, e avaliar o potencial das metodologias de BOX-PCR e MLSA em estudos de diversidade, filogenia e taxonomia Em um primeiro estudo, o dendrograma resultante do BOX-PCR de 68 SEMIAs isoladas de 47 distintas leguminosas apresentou uma baixa correlação (7,6%) com à árvore filogenética construída com o gene ribossomal 16S Todavia, quando uma análise polifásica utilizando BOX-PCR e as seqüências do gene ribossomal 16S foi analisada em uma proporção de 2:8 (proporção para o peso relativo de cada análise, 16SrRNA:BOX-PCR), foi possível observar agrupamentos com elevada similaridade (9%) aos grupos taxonômicos propostos pela arvore filogenética do gene ribossomal 16S Em um segundo estudo utilizando a metodologia de MLSA com os genes 16S RNAr, atpD, dnaK, glnII, recA e a região ITS, em uma coleção de estirpes de 169 Bradyrhizobium isoladas de 43 distintas leguminosas, foi possível observar a divisão de doisgrupos bem definidos, sendo que o primeiro incluiu as estirpes tipo de B japonicum, B betae, B liaoningense, B canariense, B yuanmingense e B japonicum USDA 11, já o segundo grupo incluiu estirpes relacionadas à B elkanii USDA 76T Uma elevada variabilidade foi observada no gene atpD, sendo que cinco estirpes relacionadas à B elkanii apresentaram uma variabilidade ainda não constatada para esse gene Outra importante observação foi que o grupo composto pelas estirpes USDA 11, SEMIAs 58 e 659 de B japonicum, todas isoladas de soja, foram sempre reunidas em todas as seis árvores construídas e formaram um grupo distinto do agrupamento formado pela estirpe tipo de B japonicum USDA 6T Desse modo, foi observado que tanto a análise polifásica, utilizando BOX-PCR e as seqüências do gene ribossomal 16S, quanto a técnica de MLSA possibilitaram acessar a diversidade genética em rizóbios bem como determinar relações filogenéticas e identificar possíveis novas espécies de rizóbios
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Palavras-chave
Rizóbio, Genética vegetal, Taxonomia vegetal, Rhizobium, Plant genetics