01 - Doutorado - Ciência Animal

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Análise dos genes VP6 e VP7 de cepas de rotavírus identificadas em frangos de corte com síndrome da má absorção
(2023-02-28) Gallego, Jéssica Cristhine; Alfieri, Amauri Alcindo; Dall Agnol, Alais Maria; Lorenzetti, Elis; Lunardi, Michele; Takiuchi, Elisabete
Rotavírus (RV) é uma das mais importantes etiologias de infecções entéricas em diferentes espécies de mamíferos e aves. RV é um vírus não envelopado, composto por 11 segmentos de RNA fita dupla que codificam seis proteínas estruturais (VP) e cinco a seis proteínas não estruturais. A VP mais abundante é a VP6 que define a espécie viral. VP4 e VP7 induzem anticorpos neutralizantes e, por isso, utilizadas para a classificação das cepas virais em genotipos P e G, respectivamente. Características antigênicas e moleculares de cepas de campo podem ser utilizadas para o conhecimento da evolução viral, rearranjos genômicos e a transmissão interespécies. RV identificados em aves são classificados em quatro espécies distintas, denominadas como RVA, RVD, RVF e RVG. Assim como em mamíferos, RVA também é a espécie mais descrita em aves. As espécies RVD, RVF e RVG, até o momento, foram identificadas exclusivamente em hospedeiros aviários. Estudos relacionados à caracterização molecular de cepas de RV identificados em espécies aviárias não são frequentes comparativamente às cepas provenientes de mamíferos. Este estudo teve por objetivo realizar a caracterização molecular em cepas de campo de RV aviário. Foram utilizadas 55 amostras individuais de conteúdo intestinal de frangos de corte com uma a duas semanas de idade que apresentavam quadro clínico de diarreia e síndrome da má absorção. Em estudo anterior, todas as amostras haviam sido previamente identificadas como positivas para RV por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida. O objetivo do primeiro estudo foi determinar as espécies de RV aviário.Foi realizado por meio da amplificação parcial do gene VP6 com primers específicos para as espécies RVA, RVD, RVF e RVG. Posteriormente, foi realizado o sequenciamento dos amplicons com o objetivo de determinar a caracterização molecular e filogenética do gene VP6 (genotipo I) das cepas virais incluídas no estudo. Adicionalmente, no segundo estudo o objetivo foi determinar o gene VP7 (genotipo G) de 10 cepas de campo pertencentes ao RVA e de nove cepas ao RVD. Das 55 amostras positivas para RV incluídas no estudo em 10, 18 e 28 amostras foi possível à amplificação parcial do gene VP6 de RVA, RVD e RVF, respectivamente. Análises filogenéticas realizadas nos produtos do gene VP6 amplificados por RT-PCR possibilitaram classificar as 10 cepas de RVA no genotipo I11. Já as cepas de RVD e RVF apresentaram 89% e 93 a 98% de identidade de nucleotídeos (nt), respectivamente, com outras cepas disponíveis no GenBank descritas no Brasil e no mundo. Com relação às análises realizadas no produto da amplificação parcial do gene VP7 as cepas de RVA apresentaram 95 a 97% de identidade de nt com cepas que pertencem ao genotipo G19. A identidade de nt das nove cepas de RVD incluídas nas análises do gene VP7 apresentaram de 89 a 91% de identidade de nt com cepas de RV aviário descritas no Brasil e disponíveis no GenBank e 85% com a cepa protótipo 05V0049. Considerando as diversidades moleculares e antigênicas já descritas em cepas de RV, o monitoramento dos genotipos mais prevalentes em cepas de RV aviários é essencial para o desenvolvimento de ações em saúde animal e de biosseguridade para a avicultura nacional
Análise dos genes VP6 e VP7 de cepas de rotavírus identificadas em frangos de corte com síndrome da má absorção
(2023-02-28) Gallego, Jéssica Cristhine; Alfieri, Amauri Alcindo; Dall Agnol, Alaís Maria; Lorenzetti, Elis; Lunardi, Michele; Takiuchi, Elisabete
Rotavírus (RV) é uma das mais importantes etiologias de infecções entéricas em diferentes espécies de mamíferos e aves. RV é um vírus não envelopado, composto por 11 segmentos de RNA fita dupla que codificam seis proteínas estruturais (VP) e cinco a seis proteínas não estruturais. A VP mais abundante é a VP6 que define a espécie viral. VP4 e VP7 induzem anticorpos neutralizantes e, por isso, utilizadas para a classificação das cepas virais em genotipos P e G, respectivamente. Características antigênicas e moleculares de cepas de campo podem ser utilizadas para o conhecimento da evolução viral, rearranjos genômicos e a transmissão interespécies. RV identificados em aves são classificados em quatro espécies distintas, denominadas como RVA, RVD, RVF e RVG. Assim como em mamíferos, RVA também é a espécie mais descrita em aves. As espécies RVD, RVF e RVG, até o momento, foram identificadas exclusivamente em hospedeiros aviários. Estudos relacionados à caracterização molecular de cepas de RV identificados em espécies aviárias não são frequentes comparativamente às cepas provenientes de mamíferos. Este estudo teve por objetivo realizar a caracterização molecular em cepas de campo de RV aviário. Foram utilizadas 55 amostras individuais de conteúdo intestinal de frangos de corte com uma a duas semanas de idade que apresentavam quadro clínico de diarreia e síndrome da má absorção. Em estudo anterior, todas as amostras haviam sido previamente identificadas como positivas para RV por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida. O objetivo do primeiro estudo foi determinar as espécies de RV aviário.Foi realizado por meio da amplificação parcial do gene VP6 com primers específicos para as espécies RVA, RVD, RVF e RVG. Posteriormente, foi realizado o sequenciamento dos amplicons com o objetivo de determinar a caracterização molecular e filogenética do gene VP6 (genotipo I) das cepas virais incluídas no estudo. Adicionalmente, no segundo estudo o objetivo foi determinar o gene VP7 (genotipo G) de 10 cepas de campo pertencentes ao RVA e de nove cepas ao RVD. Das 55 amostras positivas para RV incluídas no estudo em 10, 18 e 28 amostras foi possível à amplificação parcial do gene VP6 de RVA, RVD e RVF, respectivamente. Análises filogenéticas realizadas nos produtos do gene VP6 amplificados por RT-PCR possibilitaram classificar as 10 cepas de RVA no genotipo I11. Já as cepas de RVD e RVF apresentaram 89% e 93 a 98% de identidade de nucleotídeos (nt), respectivamente, com outras cepas disponíveis no GenBank descritas no Brasil e no mundo. Com relação às análises realizadas no produto da amplificação parcial do gene VP7 as cepas de RVA apresentaram 95 a 97% de identidade de nt com cepas que pertencem ao genotipo G19. A identidade de nt das nove cepas de RVD incluídas nas análises do gene VP7 apresentaram de 89 a 91% de identidade de nt com cepas de RV aviário descritas no Brasil e disponíveis no GenBank e 85% com a cepa protótipo 05V0049. Considerando as diversidades moleculares e antigênicas já descritas em cepas de RV, o monitoramento dos genotipos mais prevalentes em cepas de RV aviários é essencial para o desenvolvimento de ações em saúde animal e de biosseguridade para a avicultura nacional.
Análise espacial dos casos humanos de leptospirose e leishmaniose, uma abordagem ambiental
Marchi, Melca Niceia Altoé de; Freire, Roberta Lemos [Orientador]; Navarro, Italmar Teodorico; Garcia, João Luis; Galhardo, Juliana Arena; Vasconcelos, Vitor Vieira; Sevá, Anaiá da Paixão [Coorientadora]
Resumo: A leptospirose e a leishmaniose são doenças zoonóticas negligenciadas, distribuídas mundialmente e endêmicas em diversos estados do Brasil Possuem como reservatório diversas espécies animais e o meio ambiente, sendo fundamental a análise dos fatores de risco em uma abordagem multidisciplinar como na saúde única O objetivo da tese foi analisar a distribuição de casos humanos de leptospirose nos municípios do estado do Paraná, de acordo com as variáveis ambientais e de produção animal, por meio da análise espacial e realizar uma revisão sistemática de análise espacial dos casos humanos de leishmaniose tegumentar americana e leishmaniose visceral no Brasil Foram gerados dois artigos, no primeiro, foram pesquisados os casos de leptospirose em humanos de 28 a 218, a produção animal e variáveis ambientais no estado do Paraná Os dados foram coletados de fontes abertas à consulta pública como SINAN, IBGE, ITC e Mapbiomas Foi criado um banco de dados geo-codificado com todas as variáveis Calculou-se então, proporções das variáveis de tipos de solo, bacias hidrográficas, cobertura vegetal e produção agrícola por município A densidade animal foi determinada pela área de pastagem A correlação espacial foi avaliada pelo teste global e local uni e bivariado de Moran Um modelo de regressão linear múltipla foi utilizado para avaliar a correlação entre as incidências e as variáveis ambientais e de produção animal Dos 399 municípios do estado, 278 (69,7%) apresentaram casos de leptospirose nos 1 anos do estudo e 121 (3,3%) não apresentaram nenhum caso no mesmo período As incidências médias das populações urbanas e rurais tiveram autocorrelação espacial positiva em 27,6% dos municípios (índice de Moran 196) nos anos do estudo, evidenciando no mapa municípios com altas incidências (13,3%) e os municípios com baixa incidência e alto risco para a doença (5,76%) As incidências dos casos de leptospirose tiveram correlação espacial significativa tanto positiva quanto negativa com fatores ambientais, como: tipos de solo, produção de trigo e soja, área de infraestrutura urbana por município, altitude, temperatura média anual e precipitação média anual A análise de regressão evidenciou que as incidências das populações urbanas sofrem influência negativa de tipos de solos como argissolo vermelho (P<,1) e de área de floresta plantada (p=,2) e influência positiva da área de infraestrutura urbana (p=,34) Já as incidências das populações rurais sofrem influência positiva de nitossolo vermelho (p=,3) e de áreas com produções semiperenes (p=,34) Conclui-se que a leptospirose tem autocorrelação espacial no estado do Paraná e correlação espacial com fatores ambientais como solos argilosos que acumulam água e produção de grãos como soja e trigo Este trabalho também evidenciou uma particularidade do estado, que é a maior ocorrência da doença em municípios de temperatura mais fria e altitude mais elevada No segundo estudo, a busca pelos artigos foi realizada nas bases de dados Pubmed, Scielo, Scopus e Web of Science As palavras-chaves utilizadas na identificação dos artigos foram Thematic map AND Leishmanisis, Spatial analysis AND Leishmanisis e Geoprocessing AND Leishmaniasis, na língua inglesa Foram encontrados 36 artigos e após a triagem de títulos, resumo e leitura dos trabalhos completos, foram analisados onze artigos Os estados estudados foram São Paulo, Acre, Maranhão, Piauí, Minas Gerais, Paraná e Tocantins A leishmaniose tegumentar americana ocorreu predominantemente em áreas rurais, com formação de clusters em regiões de reserva florestal ou áreas florestais modificadas Já a leishmaniose visceral ocorreu em seu maior número em áreas urbanas periféricas e centrais, associada a ambientes mais pobres e com menos infraestrutura urbana, incluindo pior saneamento Conclui-se que a distribuição espacial das leishmanioses está intimamente relacionada ao ambiente em que vive a população exposta ao risco Os artigos analisados associam os dados geoespaciais a alguns fatores de risco para a doença, apontando os locais onde ocorre a maioria dos casos, criando uma fonte relevante para a definição de estratégias de controle
Análise integrada da carne DFD em bovinos Nelore: termografia infravermelha e avaliação sensorial
(2023-05-30) Ferreira, Guilherme Agostinis; Bridi, Ana Maria; Soares, Adriana Lourenço; Prado, Ivanor Nunes do; Pedrão, Mayka Reghiany; Carvalho, Rafael Humberto de
Esta tese discute o fenômeno da carne de corte escuro, também conhecida como DFD na espécie bovina em condições tropicais e está dividida em três estudos acerca do tema. O primeiro estudo teve como objetivo investigar as diferenças entre carne bovina com valores intermediários e altos de pHu e de características físico-químicas, além de avaliar a correlação entre biomarcadores sanguíneos ligados ao estresse e o pH final (pHu) de carcaças. O estudo constatou que os bifes do grupo de pH intermediário e alto apresentaram valores de a* e b* mais baixos do que os bifes do grupo normal, com diferença apenas na luminosidade entre eles. Os grupos de pH intermediário e alto apresentaram maior conteúdo de Metamioglobina do que o normal. O grupo de pH alto foi o mais macio entre todos os grupos. Com relação aos biomarcadores sanguíneos, houve correlação moderada entre os biomarcadores sanguíneos e o pHu, indicando que a mensuração dos parâmetros sanguíneos no momento do abate pode ser uma ferramenta útil para identificar carcaças com diferentes pHu. O segundo estudo avaliou a percepção do consumidor brasileiro sobre carne bovina com diferentes valores de pHu por meio de uma análise sensorial. O estudo constatou que os consumidores gostaram mais dos bifes de pH mais elevado em termos de maciez, e houve uma tendência para o mesmo comportamento em termos de suculência. Não houve diferença nos demais parâmetros avaliados. Os modelos de regressão indicaram uma forte influência da cor e aparência de frescor, além de maciez e suculência nas pontuações gerais de preferência dos consumidores. O terceiro estudo explorou o uso da termografia infravermelha (IRT) para identificar o fenômeno DFD na carne bovina brasileira. Os resultados indicaram correlações significativas entre a termografia infravermelha (TRI) e vários preditores. O IRT max sozinho apresentou um valor notável de R-quadrado (R²) de 0,75, indicando uma forte relação com a variável desfecho. A combinação da TRI máx com diferentes variáveis, como Glicose e Lactato, resultou em melhora dos valores de R², chegando até 0,80. Essas descobertas ressaltam o potencial da TRI como uma ferramenta valiosa para modelagem preditiva em nosso estudo. De forma geral, os estudos destacam a importância de entender o fenômeno DFD e desenvolver ferramentas eficazes para identificar carcaças com alto pHu para melhorar a qualidade da carne.
Análise molecular de cepas incomuns de rotavírus suíno grupo A
Lorenzetti, Elis; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Vilas-Bôas, Laurival Antônio; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Lunardi, Michele; Headley, Selwyn Arlington
Resumo: A diarreia neonatal é um dos principais problemas sanitários que acomete leitões em todo o mundo Em sistemas intensivos de produção o rotavírus suíno grupo A (RVA) é uma das principais etiologias de diarreia em leitões lactentes e recém-desmamados A caracterização dos genotipos das cepas de RVA detectadas em surtos de diarreia é de grande importância para a identificação de novos genotipos virais, para a análise da diversidade genética, identificação de eventos de ressortimento e transmissão interespécies O objetivo deste estudo foi realizar análises filogenéticas em três cepas de RVA identificadas em fezes diarreicas de leitões As duas cepas virais do primeiro estudo (BRA381 e BRA382) foram selecionadas durante um estudo retrospectivo de genotipagem realizado em amostras fecais diarreicas positivas para o RVA pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida, por apresentarem resultados negativos em testes de genotipagem utilizando primers genotipo-específico para os principais protótipos de RVA de origem humana e animal (bovino e suíno) A cepa viral do segundo estudo (BRA843) foi selecionada para a análise de todos os genes por ser uma cepa G4P[6] diferente do protótipo suíno, a cepa Gottfried No primeiro estudo os produtos da RT-PCR dos genes VP7 (G) e VP4 (P) foram sequenciados e a análise filogenética possibilitou a identificação do genotipo G26P[13] e G26P[X] nas cepas BRA381 e BRA382, respectivamente G26 é um genotipo raro que, até então, somente havia sido identificado em cepas de RVA suíno da Ásia (Japão e China) e, possivelmente, em uma cepa de origem humana da Tailândia O genotipo P[13] é o terceiro genotipo mais comum em RVA suíno, porém a associação G26P[13] ainda não havia sido descrita em cepas de RVA em todo o mundo No segundo estudo, a análise dos 11 genes de uma cepa (BRA843) de RVA suíno G4-IX P[6]-If, anteriormente caracterizada como distinta do protótipo G4P[6] (Gottfried) de origem suína, revelou estreita relação com cepas de RVA detectadas em suínos e também com cepas detectadas em humanos e animais provenientes de ressortimento com cepas suínas Estas características sugerem que a cepa BRA843 seja de origem suína A constelação de genotipos (G4-P[6]-I5-R1-C1-M1-A8-C1-T7-E1-H1) identificada nesta cepa brasileira de RVA suíno tem estrutura Wa-like com genotipos comumente detectados em cepas de RVA de origem suína O genotipo T7 é um genotipo raro que foi primeiramente descrito na cepa de RVA UK (protótipo) de origem bovina Posteriormente, o genotipo T7 foi relatado em cepas de RVA de humanos provenientes de ressortimento com cepas suínas e bovinas Recentemente, o genotipo T7 foi também identificado em cepas de RVA suíno reforçando a origem suína deste genotipo No Brasil, este é o primeiro estudo com análise de todos os genes de uma cepa suína de RVA G4P[6], bem como a primeira descrição de uma cepa G4P[6] suína detectada em um hospedeiro suíno carreando o genotipo T7 Os dois estudos revelaram a complexidade de genotipos de RVA circulantes em rebanhos suínos brasileiros, bem como a importância da análise de todos os genes para a compreensão dos mecanismos de evolução das cepas de rotavírus e o papel dos suínos como reservatórios de uma constelação de genotipos de RVA passíveis de infectar tanto animais quanto humanos
Análise quantitativa de senecavirus A em fragmentos de 2 tecidos de leitões recém-nascidos naturalmente infectados
Dall Agnol, Alais Maria; Alfieri, Alice Fernandes [Orientador]; Silva, Caio Abércio da; Araújo Junior, João Pessoa; Heinemann, Marcos Bryan; Headley, Selwyn Arlington
Resumo: Senecavirus A (SVA) é a única espécie do gênero Senecavirus, família Picornaviridae SVA é um vírus RNA fita simples, de polaridade positiva, não envelopado e genoma com aproximadamente 7,2 kb Desde 27, SVA tem sido associado à doença vesicular em suínos nos Estados Unidos da América, Brasil, Colômbia, China e Tailândia A partir de 215, uma nova síndrome multissistêmica associada à infecção por SVA tem sido relatada em leitões recém-nascidos nesses países SVA foi identificado por técnicas moleculares (RT-PCR, qRT-PCR e nested-RT-PCR), imuno-histoquímica e/ou hibridização in situ em diferentes órgãos de leitões recém-nascidos Embora a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) tenha sido utilizada para detectar RNA de SVA a partir de amostras biológicas de suínos, não há relatos da determinação da carga viral nos diferentes tecidos de leitões recém-nascidos com sinais clínicos consistentes com a infecção pelo vírus O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição tecidual e a carga viral de SVA em diferentes amostras biológicas de leitões sintomáticos, naturalmente infectados, provenientes de rebanhos suínos com histórico de doença vesicular No primeiro estudo foi validado um teste de qRT-PCR utilizando TaqMan como ferramenta para a detecção e quantificação de RNA de SVA em amostras biológicas de suínos Um conjunto de primers e probe específicos para amplificar um produto de 118 pb da região VP1 do genoma do vírus foi desenhado para ser utilizado na técnica de qRT-PCR A avaliação da eficiência da qRT-PCR TaqMan foi realizada em 45 amostras de tecidos de 15 leitões sintomáticos (n = 38) e quatro (n = 7) assintomáticos previamente caracterizados como positivos ou negativos para SVA por RT-PCR convencional Entre amostras biológicas provenientes de leitões sintomáticos, 18 (47,4%) e 3 (78,9%) foram positivas por RT-PCR convencional e qRT-PCR, respectivamente Todas as amostras obtidas de leitões assintomáticos foram negativas para o vírus em ambas as técnicas utilizado Os resultados demonstram que a técnica de qRT-PCR utilizando TaqMan padronizada neste estudo é rápida e apresenta alta sensibilidade, especificidade e repetibilidade, sendo capaz de gerar resultados confiáveis na detecção e quantificação de RNA de SVA em amostras biológicas de suínos O segundo estudo avaliou a distribuição e a carga viral de SVA em diferentes amostras de órgãos/tecidos provenientes de leitões recém-nascidos sintomáticos Por meio da técnica qRT-PCR previamente padronizada no primeiro estudo, foram analisados fragmentos de tronco encefálico, cerebelo, cérebro, coração, rim, fígado, pulmões, intestino delgado, baço, bexiga e tonsila provenientes de sete leitões recém-nascidos O RNA de SVA foi detectado em 81,4% (57/7) das amostras avaliadas A carga viral variou de 4,7 a 1,38 log1 cópias genômicas/g de tecido Os resultados demonstram que o SVA tem tropismo por diferentes órgãos em leitões recém-nascidos naturalmente infectados, principalmente tonsilas, baço, pulmão e fígado Órgãos linfoides apresentam altas cargas virais e podem ser importantes sítios de replicação de SVA A ampla distribuição de RNA de SVA em órgãos/tecidos dos sistemas cardiovascular, respiratório, digestório, urinário, neurológico e linfático demonstra a capacidade do vírus em causar infecção multissistêmica em leitões recém-nascidos e a sua participação nas manifestações clínicas observadas
Anaplasma marginale : análise da variabilidade do gene msp1 a e avaliação imunogênica da vacina de DNA contendo genes para MSP1a, MSP1b e MSP5 em camundongos BALB/c
Kano, Flora Satiko; Vidotto, Marilda Carlos [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Garcia, João Luis; Vidotto, Odilon [Coorientador]
Resumo: O Anaplasma marginale é um importante patógeno riquetsial de bovinos transmitido por carrapato que invade e se multiplica dentro de eritrócitos, causando anemia hemolítica durante a infecção aguda A imunização com proteínas de membrana externa (OMP) purificadas induz proteção contra doença aguda Das 21 OMPs descritas, seis MSPs (1a, 1b, 2-5) já foram bem caracterizadas O complexo MSP1 (MSP1a e 1b) é adesinas de eritrócitos de bovinos A MSP1a varia em tamanho pelo número de repetições in tandem de 28-29 aminoácidos Vacina de DNA contra a anaplasmose tem sido investigada usando os genes msp1a e msp1ß, e os resultados evidenciaram resposta celular e humoral em camundongos e bovinos A imunização com DNA plasmidial que codifica genes de interesse é uma tecnologia nova e promissora no desenvolvimento de vacinas Vacinas de DNA que visam múltiplos epitopos têm se mostrado mais eficientes aumentando a imunogenicidade e a proteção de animais vacinados quando comparadas com as de epitopo único Os objetivos deste trabalho foram analisar a variabilidade do gene msp1a de amostras paranaenses de A marginale, testar a capacidade dos plasmídios recombinantes expressarem MSP1a, MSP1b e MSP5 em células eucarióticas e avaliar a imunogenicidade destas vacinas administradas individualmente ou em associação, em camundongos BALB/c A análise da região repetitiva do gene msp1a identificou a presença de seis, cinco e três repetições nas amostras PR1, PR2 e PR3, respectivamente, e seis padrões de repetições inéditas Contudo, a região da MSP1a responsável pela imunogenicidade foi conservada Os plasmídios pcDNA/ msp1a, pcDNA/ msp1 ß e pcDNA/ msp5, os quais codificam os genes das MSPs sob o controle do promotor do citomegalovirus e intron A, foram construídos, multiplicados em E coli TOPO1 e purificados A expressão das proteínas MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro foi realizada em células Vero usando lipofectamina 2 e Imunofluorescência Indireta (IFA), utilizando anticorpos monoclonais Sete grupos de camundongos foram imunizados para avaliar a produção de IgG total e determinar os isotipos IgG1 e IgG2a: G1-1 mL PBS; G2-1 mg de vetor; G3- 1 mg de corpúsculos iniciais de A marginale + adjuvante de Freund; G4- 1 mg pcDNA-msp1a; G5-1 mg pcDNA-msp1b; G6-1 mg of pcDNA-msp5 e G7- pool de plasmídios (33 mg de cada plasmídio) Três semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados para avaliar a proliferação dos esplenócitos As células Vero transfectadas com plasmídios recombinantes reagiram com anticorpos monoclonais específicos, demonstrando a expressão dos genes msp IgG específica para a MSP1a e MSP5 foram detectadas tanto por ELISA quanto por Western blot Os grupos que receberam pcDNA-msp1a and pcDNA-msp5 mostraram predomínio do isotipo IgG2a, e proliferação de esplenócitos, sugerindo que estes plasmídios são bons candidatos para estimular reposta imune Th1 A associação dos três plasmídios recombinantes (pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1b and pcDNA-msp5) empregados na imunização de camundongos induziram altos títulos de anticorpos por ELISA e reagiram com todas proteínas recombinantes (rMSP1a, rMSP1b e rMSP5) de A marginale por Western blot Adicionalmente, a combinação dos plasmídios levou a uma forte proliferação de linfócitos (SI = 12, 2), enquanto o gene msp1a determinou significante proliferação significativa (SI = 2,6) e os genes msp1b e msp5 não promoveram proliferação (SI<2) Os resultados demonstraram que a associação dos plasmídios induziu a expressão das MSPs e estimulou significante produção de linfócitos T, podendo ser uma estratégia eficiente para a imunoprofilaxia da anaplasmose
Aplicabilidade do método de Western Blot para diagnóstico da toxoplasmose congênita
Monica, Thaís Cabral; Navarro, Italmar Teodorico [Orientador]; Capobiango, Jaqueline Dario; Breganó, Regina Mitsuka; Reiche, Edna Maria Vissoci; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti
Resumo: A infecção por Toxoplasma gondii em mulheres grávidas pode levar à toxoplasmose congênita Quanto mais cedo o diagnóstico da infecção durante a gestação e precoce o tratamento, menores as manifestações da infecção na criança e a doença não é aparente ao nascimento Em 26, implantou-se o Programa de Vigilância em Saúde da Toxoplasmose Gestacional e Congênita na atenção primária de Londrina, com a investigação sorológica, diagnóstico e tratamento para toxoplasmose durante o atendimento pré-natal, foi iniciada a notificação da toxoplasmose na gestação e da toxoplasmose congênita, mediante a utilização de uma ficha específica, aplicada, inicialmente, pelas unidades sentinelas, e posteriormente, pelos diversos serviços de saúde, contribuindo para a coleta de dados, produção de informações epidemiológicas regionais e ampliação do conhecimento sobre a doença no país Porém um dos problemas observados foi a dificuldade em fechar o diagnóstico da toxoplasmose congênita (TC), o método de Western Blot (WB) é uma ferramenta para identificação do diagnóstico de TC dessa criança, auxiliando no tratamento precoce Com essa necessidade o objetivo deste trabalho é apresentar o uso do Western Blot (WB) como método para diagnóstico precoce das crianças atendidas na rotina ambulatorial No período de junho de 214 a junho de 218, 92 crianças foram acompanhadas no ambulatório de Moléstias Infecciosas Para a confirmação da toxoplasmose congênita a criança tinha que apresentar IgM reagente ou lesão ocular característica da toxoplasmose (coriorretinite/lesão macular) ou lesão do SNC (calcificações, microcefalia, hidrocefalia) ou IgG anti – T gondii reagente por quimiluminescencia após 12 meses de vida ou WB positivo O exame de Western Blot foi utilizado como metodologia de auxílio no diagnóstico precoce da doença e considerado positivo quando a criança apresentava bandas diferentes ou de maior intensidade em relação as bandas maternas Entre as crianças atendidas, em 25/92 (27,1%) foi confirmado o diagnóstico, 4% (1/25) apresentou lesão ocular (turvação vítrea), 12% (3/25) alguma alteração do SNC (calcificações, hidrocefalia, microcefalia) e 2% (5/25) apresentaram lesões associadas de SNC e ocular, os títulos de IgM foram reagentes em apenas 5/33 (2%) crianças e 14 (56%) apresentaram IgG reagente após 12 meses Em 18/25 (72%) foram encontradas alterações no WB e entre elas, 8 (32%) o diagnóstico foi feito com a ajuda do WB, pois elas não apresentavam IgG/IgM anti-Tgondii reagente e eram assintomáticas Em relação ao início do tratamento das mães, 5/21 (23,8 %) foram no 1º trimestre, 7/21 (33,3%) no 2º trimestre e 9/21 (42,8%) no 3º trimestre e em 21/25 (84%) crianças infectadas a mãe foi tratada A variação do peso molecular de proteínas reconhecidos pelo soro da criança apresentado foi de 25kD a 1kD A mais presente foi a de 9kD (26,3%), seguida por 149kD (22,2%) e 28kD (19,2%) A precocidade no diagnóstico da infecção permite o tratamento adequado do bebê sendo capaz de reduzir sequelas da toxoplasmose futuramente nessa criança O diagnóstico pelo exame de Western Blot foi conclusivo e pode ser incluído na rotina do diagnóstico da toxoplasmose congênita, na caracterização precoce dessa infecção e é fator determinante para tratamento das crianças acometidas
Aspectos clínicos e moleculares de infecções sintomáticas por kobuvirus em animais
Ribeiro, Juliane; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Claus, Marlise Pompeo; Headley, Selwyn Arlington; Lorenzetti, Elis; Crhyssafidis, Andréas Lázaros
Resumo: O gênero Kobuvirus, membro da família Picornaviridae, é dividido em seis espécies Aichivirus A a F O segmento 3D do genoma do Kobuvirus é uma região conservada, que codifica a enzima RNA polimerase dependente de RNA (RdRP), que é amplamente utilizada para o diagnóstico do vírus A região genômica que codifica a proteína VP1 do capsídeo viral, região mais variável, é utilizada para estudos filogenéticos em cepas de campo de kobuvírus Kobuvírus tem sido relacionado à diarreia, principalmente em animais jovens e a infecção por kobuvírus ainda é pouco descrita em animais no Brasil O objetivo deste estudo foi avaliar características da infecção em duas espécies animais sendo um animal de produção e outro de estimação O primeiro estudo descreve o envolvimento do kobuvírus (Aichivirus B) em um surto de diarreia em bezerros de um rebanho leiteiro de alta produção Vinte e quatro amostras fecais diarreicas de bezerros com até 3 dias de idade foram coletadas para análise virológica Cinco amostras fecais de bezerros assintomáticos foram incluídas nas análises como grupo controle Utilizando ensaios de RT-PCR, o aichivírus B foi detectado em 54,2% (13/24) e rotavírus A G1P[11] em 25% (6/24) das amostras fecais diarreicas avaliadas Os bezerros assintomáticos foram negativos para ambos os vírus Aichivírus B foi identificado apenas em bezerros com até duas semanas de idade com 83,3% (1/12) das amostras positivas A análise filogenética baseada no gene RdRP agrupou as cepas brasileiras em um novo ramo no cluster Aichivirus B A análise das sequências de nucleotídeos do gene VP1 das cepas brasileiras e chinesas de Aichivirus B permitiu classificar as cepas brasileiras avaliadas na recém proposta, linhagem 1 (genotipo A) Este é o primeiro relato de alta taxa de detecção de aichivírus B em um surto de diarreia em bezerros leiteiros e também o primeiro estudo filogenético com base no gene VP1 realizado com cepas de campo de Aichivirus B identificadas na América do Sul O segundo estudo descreve a detecção extra-intestinal de kobuvírus canino (CaKV) em um filhote de Chihuahua de 5 meses de idade com histórico clínico de fezes com sangue de morte natural Fragmentos de tecido foram submetidos à técnica de histopatologia e imuno-histoquímica (IHC) para identificar antígenos do vírus da cinomose (CDV), parvovírus canino tipo 2 (CPV-2) e adenovírus canino tipos 1 e 2 (CAdV-1 e 2) As técnicas de PCR e RT-PCR foram utilizadas para amplificar genes específicos de CaKV, CDV, CPV-2, CAdV-1 e -2 e herpesvírus canino tipo 1 (CaHV-1) Fragmentos de intestino e amostras de fezes foram avaliados para identificar a presença de rotavírus As principais alterações patológicas encontradas foram peneumonia intersticial, bronquite necrosante, miocardite, enterite e depleção linfóide A RT-PCR detectou CaKV no cerebelo, cérebro, pulmão, tonsila e fígado Neste estudo, também foram identificadas infecções mistas de CaKV com CDV e CPV-2 com CaHV-1 CaKV e rotavírus não foram identificados nas fezes e intestino Os ensaios IHC detectaram antígenos de CDV e CAdV-1 em regiões distintas dos pulmões A análise filogenética da cepa de CaKV identificada neste estudo revelou semelhança com cepas detectadas em outros países Os resultados evidenciam a primeira detecção extra-intestinal de CaKV em tecidos em associação com infecções mistas com outros vírus comumente encontrados em cães e a primeira detecção extra-intestinal de CaKV em um cão Os resultados obtidos nesse estudo adicionaram novos conhecimentos sobre aspectos clínicos e moleculares da infecção por kobuvírus em animais
Aspectos epidemiológicos e perfil de resistência antimicrobiana de Salmonella enterica isoladas da cadeia produtiva de frangos da Mesorregião norte do estado do Maranhão
Brito, Daniela Aguiar Penha; Oba, Alexandre [Orientador]; Pinheiro, João Waine; Freire, Roberta Lemos; Oliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de; Costa, Francisca Neide
Resumo: Objetivou-se investigar a presença de Salmonella spp e seus sorovares da cadeia produtiva de frangos de corte do Estado do Maranhão, assim como caracterizar o perfil fenotípico e genotípico de resistência antimicrobiana e identificar os fatores associados ao risco de contaminação do abate artesanal de aves Foram coletadas 24 amostras do ambiente de criação (suabe de arrasto, propé, fezes e ração), 1 amostras de suabe cloacal e 18 amostras de carcaças, as quais foram analisadas quanto a presença de Salmonella spp Os isolados foram sorotipificados, testados quanto a suscetibilidade antimicrobiana e detectados os genes codificadores de resistência Realizou-se um estudo observacional transversal em 85 abatedouros artesanais de frangos de corte, onde avaliou-se os procedimentos de abate através de um inquérito epidemiológico e os dados foram associados a contaminação por Salmonella spp nas carcaças comercializadas Os resultados mostraram uma ocorrência da Salmonella spp de 25,% (15/6) em suabe de arrasto; 16,6% (1/6) de propé; 1,6% (1/6) em fezes cecais; ausência (/6) em ração; 7% (7/1) de suabe cloacal e 48,8% (88/18) em carcaças de frango Foram isolados 121 cepas de Salmonella spp sendo identificados Salmonella enterica sorovar: Schwarzengrund (n=34), Albany (n=24), Enteritidis (n=9), Heidelberg (n=9), Panama (n=6); Kentucky (n=5), Muenchen (n=5), Hadar (n=3), Agona (n=3), Typhimurium (n=2), Derby (n=1), Orion (n=1), Anatum (n=1), Stenftenberg (n=1), Worthing (n=1), O:4,5 (n=9), O:68 (n=3), O:3,1 (n=2) e O:4,5:I,v:- (n=1) Salmonella ser Schwarzengrund apresentou maior predominância no fluxo de produção das aves, sendo isolado em 5 amostras ambientais, 2 de aves vivas e 27 de carcaças Constatou-se a resistência antimicrobiana em 98 (81%) amostras e destas, 73 (6,3%) apresentaram resistência múltipla a antimicrobianos (MDR) Os isolados apresentaram resistência para as sulfonamida (58,8%), trimetoprim (48,8%), tetraciclina (45,5%), ácido nalidíxico (44,6%), amoxicilina (26,4%), ampicilina (26,4%), cefazolina (22,3%), estreptomicina (21,5%), nitrofurantoína (2,5%), imipenem (1,6%), cloranfenicol (1,6%) e gentamicina (,82%) Não foi encontrada resistência a norfloxacina, ciprofloxacina e fluorfenicol Salmonella sorovares Schwarzengrund (n=25), Albany (n=17), Enteritidis (n=7) e Heidelberg (n=7) apresentaram maior frequência de fenótipos MDR Em 5 isolados desses sorovares, foram detectados os genes de resistência blaCTX-M (n=11), blaCTX-M2 (n=6) e blaSHV (n=3), sul1 (n=27), sul2 (n=5), tetA (n=13), tetB (n=28), tetC (n=22), tetE (n=4), dfrA12 (n=13) e dfrA1 (n=7) Na avaliação de abatedouros artesanais de frango, verificou-se que 45 (52,9%) amostras estavam contaminadas por Salmonella spp, 83 (97,6%) por coliformes termotolerantes, com contagens variando de 11 a 18 NMP/g e contaminação por bactérias mesófilas com contagens variando de 12 a 18 UFC/g A contaminação de Salmonella nas carcaças teve significativa associação (p=,5) com a presença de aves vivas na área de processamento, contaminação fecal visível durante a evisceração, resíduos de penas, resíduos de vísceras e contato entre carcaças durante o processamento Os resultados encontrados indicam a necessidade de implementação do controle sanitário na cadeia produtiva de aves para as salmonelas paratíficas, especialmente nos abatedouros artesanais, com risco de veiculação da Salmonella spp carreadoras de genes que codificam resistência múltipla a drogas através dos produtos comercializados
Aspectos epidemiológicos, morfológicos e terapêuticos do linfoma cutâneo e índices de proliferação celular (PCNA e Ki-67) no linforma multicêntrico em cães
Moreno, Kleber; Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro [Orientador]; Di Santis, Giovana Wingeter; Zanutto, Marcelo de Souza; Camargo, Pedro Luiz de
Resumos: Linfoma é o termo utilizado para designar um grupo heterogêneo de tumores malignos de origem linfóide Diversos sistemas de classificação foram estabelecidos para facilitar a compreensão do comportamento biológico destas doenças na medicina humana e adaptados para medicina veterinária A classificação anatômica desenvolvida pela Organização Mundial de Saúde é a forma mais simples de classificá-los segundo o local primário de aparecimento A determinação do grau de malignidade, da imunofenotipagem e dos índices de proliferação celular constitui a melhor forma de compreender o seu comportamento biológico, contribuindo na determinação de fatores prognósticos e na escolha de protocolos antineoplásicos Neste estudo foram avaliados os aspectos epidemiológicos, morfológicos e terapêuticos de 49 cães com linfoma cutâneo e a associação do grau de malignidade e imunofenotipagem com os índices de proliferação celular (PCNA e Ki-67) em 55 cães com a apresentação multicêntrica, atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Londrina no período de janeiro de 199 a agosto de 28 Dentre os cães com linfoma cutâneo, 35 eram fêmeas e 14 machos, com distribuição racial heterogênea, porém com maior ocorrência em cães de raça definida e idade variando entre 2 a 14 anos O tumor foi mais freqüente em cães de pequeno e médio porte, com lesões distribuídas principalmente no abdome, dorso e tronco Em 21 cães foi realizada a classificação morfológica verificando-se doze com linfoma não epiteliotrópico e nove com a forma epiteliotrópica Na maioria dos cães tratados com múltiplos fármacos, a remissão clínica foi completa ou parcial Ao utilizar protocolos com monoterapia a doença permaneceu estável ou progrediu, com exceção dos dois pacientes tratados com lomustina A sobrevida foi maior em pacientes tratados com múltiplos antineoplásicos Dos 55 cães com linfoma multicêntrico 3 eram machos e 25 fêmeas, dos quais 39 de raça definida e 16 sem definição racial, com idade média de 5,4 anos Morfologicamente 7,1% dos casos eram de alto grau de malignidade e 29,9% de baixo grau, sendo 32 de células T e 23 de células B A média de células marcadas pelo anticorpo PCNA foi de 9, ± 3,96 em linfomas de alto grau e de 82, ± 2,6 entre os de baixo grau Ao considerarmos todas as células marcadas não houve diferença significativa, porém ao estabelecer como positivas apenas as células fortemente marcadas, obtivemos diferença significativa entre os linfomas de alto grau (84,72 ± 3,79) e os de baixo grau de malignidade (64,19 ± 3,5) Associação significativa entre a proliferação celular mensurada com o anticorpo Ki-67 e o grau de malignidade (64, ± 9,3 para os de alto grau e 9,5 ± 2,49 para os de baixo grau) também foi constatada Não houve associação entre o índice de proliferação celular de nenhum dos anticorpos com o imunofenótipo
Aspectos moleculares de oócitos de fêmeas bos indicus e bos taurus submetidos ao estresse térmico
Cáceres, Mirela Brochado Souza; Martins, Maria Isabel Melo [Orientador]; Seneda, Marcelo Marcondes; Santos, Kátia Cristina Silva; Barreiros, Thales Ricardo Rigo; Dode, Margot Alves Nunes; Sterza, Fabiana de Andrade Melo [Coorientadora]
Resumo: Com o objetivo de avaliar a influência do estresse térmico sobre a competência oocitária, bem como sobre parâmetros fisiológicos de fêmeas bovinas de diferentes raças, foram realizados três experimentos No experimento I, foram avaliados complexo cumulus-oócitos (COCs) de vacas da raça Simental maturados in vitro em diferentes temperaturas (37°C, 38,5°C ou 4°C) Antes da maturação, os oócitos foram corados com Brilhante Cresilblue (BCB) e, classificados em BCB+ e BCB- Os COCs marcados (BCB+) eram considerados de melhor qualidade Após a maturação, foram produzidos embriões in vitro e os oócitos foram avaliados através de PCR em tempo real e imunofluorescência, para avaliação das sirtuínas, BCL11A e p53 A alteração da temperatura (±1,5°C) de maturação do oócito afetou negativamente a taxa de blastocisto após a fertilização in vitro, além de influenciar a expressão de gene importantes para a proteção celular A expressão dos genes SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT5, BCL11a e p53 foi alterada pela temperatura de maturação, em oócitos e células da granulosa No experimento II foram avaliados complexo cumulus-oócitos (COCs) de fêmeas da raça Nelore (Bos Taurus indicus) maturados in vitro em diferentes temperaturas (37°C, 38,5°C e 4°C) Após esse período parte dos COCs foram submetidos a fecundação e cultivo dos embriões e a outra parte, após determinação da taxa de maturação, foram fixados em paraformoldeído para análise de HSP7 e HSP9 por western blott O estresse térmico não influenciou a taxa de maturação nuclear dos oócitos, porém influenciou a taxa de clivagem e de blastocisto A intensidade do sinal da HSP7 foi aumentado nos oócitos submetidos a estresse, em relação ao grupo controle, além disso as células cumulus mostraram um aumento significativo da intensidade de sinal dessa proteína à 4°C A HSP9 mostrou maior quantidade em oócitos maturados à 37°C, porém se mantendo estável nas demais temperaturas A menor taxa de blastocistos e a ação paralela das HSP´s demonstram que a produção in vitro de embriões é afetada quando a maturação in vitro ocorre em situações de estresse crônico (24 hs de MIV; 37°C e 4°C) E no experimento III foram avaliados complexos oócitos-cumulus (COCs) recuperados através da aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU), de vacas Bos taurus x Bos indicus (Girolando) e Bos taurus (Pantaneira) Parte dos COCs viáveis foram submetidos a análise de imunofluorescência sob microscopia confocal para identificação das proteínas HSP7 e HSP9 Antes da realização de cada OPU, foi aferida a temperatura retal (TR) e frequência respiratória (FR) de cada animal O estresse térmico foi estimado pelo Indice de Temperatura do Globo e Umidade (ITGU) que foi calculado de acordo com a fórmula descrita por Buffington et al (1981) e classificados de acordo com o National Weather Service, 9 dias antes de cada OPU A rusticidade das raças Girolando e Pantaneira pode ser confirmada pela manutenção da TR e FR em nívies fisiológicos em ITGUs de até 94 A HSP nos oócitos foi influenciada pelo ITGUs para as duas raças, porem com comportamentos contrários No entanto, a raça Pantaneira sofreu efeitos negativos em ITGUs <78 demonstrando estresse em temperaturas mais amenas Por outro lado, observa-se que ITGUs >78 apresentam efeito deletério na qualidade do oócitos de vacas Girolando Aparentemente a raça Pantaneira reage negativamente em temperaturas mais baixas, já que apresentou menor viabilidade oocitária com ITGUs <78 Por outro lado observa-se que ITGUs de >79 aos 9 dias antes da OPU apresentam um efeito deletério na qualidade do oócitos de vacas Girolando
Associação de fatores e prevalência de anticorpos contra Toxoplasma gondii e Neospora caninum em ovinos e caprinos do Paraná e carneiros reprodutores do Rio Grande do sul, Brasil
Romanelli, Paulo Roberto; Navarro, Italmar Teodorico [Orientador]; Garcia, João Luis; Breganó, Regina Mitsuka; Minho, Alessandro Pelegrine; Okano, Werner
Resumo: O presente trabalho é parte integrante do Programa Nacional de Caracterização Zoosanitária da caprinocultura e da ovinocultura no Brasil: Epidemiologia, fatores de risco e impacto econômico das enfermidades; objetivando a determinação da prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum nos rebanhos ovinos e caprinos do estado do Paraná e carneiros reprodutores do Rio Grande do Sul e os fatores associados a essas enfermidades Foram colhidas 1617 amostras de soro ovino de 84 propriedades distribuídas em 25 municípios e 597 amostras de soro caprino em 35 propriedades distribuídas em 2 municípios No estado do Rio Grande do Sul em 225 municípios foram colhidas 18 amostras de soro de reprodutores ovinos em 75 propriedades No estado do Paraná para análise dos soros ovinos, utilizou-se a técnica de Elisa indireto para detecção de anticorpos anti-T gondii e para detecção de anticorpos anti-N caninum Na análise dos soros caprinos, empregou-se a reação de ELISA indireto para detecção de anticorpos anti-T gondii e também para detecção de anticorpos anti-Neospora caninum a técnica de ELISA indireto (Kit comercial) Em relação aos soros de reprodutores ovinos do estado do Rio Grande do Sul, utilizou-se a técnica de Elisa indireto para detecção de anticorpos anti-T gondii e na detecção de anticorpos anti-N caninum foi utilizada a reação de Imunofluorescência indireta (Kit comercial) O rebanho ovino do Paraná apresentou prevalência de 45,94% (743/1617) para T gondii, 17,62% (285/1617) para N caninum, sendo que destas apenas 9,9% (161/1617) foram reagentes para os dois parasitos No rebanho caprino a prevalência foi de 37,52% (224/597) para T gondii e 7,37% (44/597) para N caninum sendo 3,18% (19/597) dos animais reagentes aos dois parasitos Os ovinos reprodutores do Rio Grande do Sul apresentaram prevalência de 33,5% (595/18) de T gondii, 18,44% (332/18) ao N caninum e 8,94% (161/18) destes animais reagentes aos dois agentes No estado do Paraná, em relação ao rebanho ovino, as variáveis “presença de gatos” (OR=1,36), “animais recolhidos diariamente para abrigo” (OR=1,92), “sexo (fêmea)” (OR=1,83), “idade (> 1 ano)” (OR=2,6), “presença de aborto” (OR=1,47), “água proveniente de fontes superficiais” (OR=1,41) e “água fornecida em vasilhames fora das instalações” (OR=1,67), apresentaram associações significativas entre o resultado da sorologia para o T gondii, revelando-se como fatores de risco para ocorrência da toxoplasmose As variáveis “separa matrizes antes de parir” (OR=1,35), “animais que tem livre acesso às fontes de água” (OR=1,38), “água fornecida em vasilhames fora das instalações” (OR=2,8), “idade (> 1 ano)” (OR=1,8), “sexo (fêmea) (OR=2,63) e “cães que se alimentam de restos placentários de ovinos” (OR=1,7), apresentaram associação significativa à sorologia para N caninum, revelando-se como fatores de risco para a ocorrência da neosporose ovina O estudo do rebanho caprino revelou associação significativa entre o resultado da sorologia para T gondii e as variáveis “presença de gatos” (OR=2,26), “presença de felídeos selvagens” (OR=1,97), “local de abate para animais na propriedade” (OR=2,35), “gatos se alimentam de restos placentários” (OR=2,53), “idade (> 8 meses) (OR=2,53), “fornece ração concentrada aos animais” (OR=1,84), “água fornecida em vasilhames fora das instalações” (OR=3,16), “animais bebem água direto da fonte” (OR=2,91), “água proveniente de fonte profunda” (OR=3,61); quanto ao N caninum, ocorreu associação entre as variáveis “fornece ração concentrada aos animais” (OR=4,77) e “morte até o desmame” (OR=9,65), apresentando-se como fatores de risco para a ocorrência da toxoplasmose e neosporose, respectivamente No rebanho ovino do Rio Grande do Sul as variáveis “tamanho da propriedade (<5ha)” (OR=1,94), “tamanho do rebanho (<1 animais)” (OR=1,44), “sistema de criação (semi-intensivo/intensivo) (OR=1,71), “monta natural sem controle” (OR=1,97) e “pastoreio dos ovinos em outras propriedades” (OR=1,87) apresentaram-se como fator de risco para ocorrência do T gondii e as variáveis “tamanho da propriedade (<5ha)” (OR=1,86), “tamanho do rebanho (<1 animais)” (OR=1,42), “sistema de criação (semi-intensivo/intensivo) (OR=1,46) e “monta natural sem controle” (OR=2,81) apresentaram-se como fatores de risco para ocorrência do N caninum As taxas denotam importantes prevalências dos agentes distribuídas nos dois estados, o estudo das variáveis associadas a essas parasitoses, permitiu caracterizar deficiências de manejo ambiental e saneamento, manejo nutricional, presença de hospedeiros e tipo de exploração; que irá subsidiar programas sanitários e políticas públicas relacionadas à prevenção de T gondii e de N caninum em rebanhos de pequenos ruminantes no Sul do Brasil
Avaliação clínica e laboratorial como preditores do estado nutricional e prognóstico em cães hospitalizados
Fabretti, Andrei Kelliton; Pereira, Patrícia Mendes [Orientador]; Venturini, Danielle; Gomes, Lucas Alécio; Balarin, Mara Regina Stipp; Takemura, Luciana Sayuri
Resumo: A desnutrição é subdiagnosticada em medicina veterinária Reconhecer precocemente o animal desnutrido permite uma assistência nutricional rápida e acelera a recuperação Adicionalmente, a determinação do prognóstico embasa as decisões de conduta, por permitir prever a gravidade de doença, tempo de internamento (TI) e mortalidade Este trabalho objetivou, utilizando cães de uma população hospitalar, descobrir e estudar a eficiência de marcadores do estado nutricional (EN) e prognóstico, de fácil acesso e baixo custo, práticos para uso na rotina profissional Além disso, estabelece um intervalo de referência para a relação proteica C reativa (PCR)/albumina (R:PCR/ALB) nessa espécie De conhecimento dos autores, este é o primeiro estudo desta relação em cães Para cumprir os objetivos, foram avaliados 246 cães da rotina do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Londrina, por exame clínico, avaliação hematológica e mensuração de diversos parâmetros bioquímicos Foram calculadas as frequências, médias e desvios-padrões das variáveis, análises de correlação e análises comparativas (Kruskal-Wallis em a = 5%) Os indicativos de desnutrição foram: baixos valores de transferrina (TF), capacidade total de ligação com ferro (CTLF), proteína total (PT) e ureia, anemia e elevações do índice de saturação da transferrina (IST) Em relação ao prognóstico, foram realizadas análises de correlação com as variáveis: gravidade de doença, TI e mortalidade Os marcadores relevantes de gravidade de doença em cães foram: presença de desnutrição, incluindo histórico de hiporexia, anorexia, escore de condição corporal (ECC) =3 e escore de massa muscular (EMM) =2; baixos valores de transferrina (TF) e da capacidade total de ligação ao ferro (CTLF) e anemia; além de valores elevados de índice de saturação da transferrina (IST), lactato e da R:PCR/ALB Nos animais sem doenças sistêmicas ou com doenças discretas a moderadas, os indicadores de elevado TI foram: baixos valores de TF, CTLF, albumina, PT, elevada R:PCR/ALB e hiporexia Nos animais com doenças sistêmicas críticas, os indicadores de baixo TI foram: ocorrência de anorexia, índice de massa corporal (IMC) abaixo da média, baixos valores de TF, CTLF, anemia e baixa contagem de linfócitos Os indicadores de mortalidade em cães doentes foram: alta gravidade de doença, hipoalbuminemia e elevada concentração de ureia O intervalo de referência estipulado para a R:PCR/ALB em cães foi de ,36-,6, determinado pelo intervalo de confiança da média das reamostragens Esta relação é melhor marcadora de gravidade de doença e TI em cães do que a PCR e albumina analisadas separadamente Conclui-se que a constatação das alterações supracitadas, especialmente quando ocorrem simultaneamente, embasa a determinação do EN e prognóstico em cães de uma população hospitalar, de maneira objetiva, prática e acessível
Avaliação da farinha de larvas de mosca de soldado negro (Hermetia illucens L.) na alimentação de galinhas poedeiras leves
Barbosa Filho, João Antonio; Oba, Alexandre [Orientador]; Silva, Caio Abércio da; Venâncio, Emerson José; Simonelli, Sandra Maria; Marcato, Simara Marcia
Resumo: O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos diferentes níveis de inclusão da farinha de larvas de mosca do soldado negro (FLMSN) sobre imunologia, desempenho, análise sensorial e qualidade dos ovos de galinhas poedeiras comerciais Foram realizados dois experimentos No Experimento 1 foi adotado um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com quatro tratamentos, seis repetições e oito aves por parcela experimental Foram utilizadas 192 poedeiras da linhagem Bovans, com 25 semanas de idade por um período de 63 dias, dividido em três ciclos de 21 dias Os tratamentos consistiram em quatro níveis de inclusão de FLMSN (, 3, 6 e 9%) Foram avaliados consumo de ração, porcentagem de postura, peso médio dos ovos, massa dos ovos, conversão alimentar, unidade Haugh, coloração da gema, índice de gema, pH albúmen e gema, porcentagem albúmen, gema e casca, espessura de casca, e quantificação de IgY no soro e na gema dos ovos A inclusão de FLMSN não afetou (P>,5) o desempenho e o teor de IgY do soro e gema dos ovos Em relação à qualidade dos ovos, houve efeito quadrático (Y = 98,72925 + ,65364x – ,7458x2) para unidade Haugh, com ponto de máximo o nível de 4,38% de FLMSN, efeito linear decrescente (Y =65,15 – ,525185x) para porcentagem de albúmen e aumento linear (Y = 25,28 + ,41889x) para porcentagem de gema Conclui-se que a FLMSN pode ser usada até 9% de inclusão na dieta de poedeiras sem comprometer o desempenho, quantificação de IgY do soro e gema do ovo, entretanto influencia em algumas características de qualidade dos ovos No experimento 2, foi adotado um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 4 (níveis de inclusão de FLMSN e quatro tempos de armazenamento) Na avaliação sensorial dos ovos foi utilizado o teste triangular, com 6 avaliadores não treinados Objetivou-se nesse experimento avaliar a qualidade de ovos armazenados em diferentes períodos (, 7, 14 e 21 dias), provenientes de galinhas poedeiras alimentadas com diferentes níveis de inclusão de FLMSN, e uma análise sensorial de ovos de poedeiras submetidas a dietas com e 9% de FLMSN As análises de qualidade de ovos realizadas foram: perda de peso, gravidade específica, unidade Haugh, índice de gema, coloração da gema, porcentagem de albúmen, gema e casca, pH albúmen e gema e espessura de casca A inclusão de FLMSN na dieta de aves não alterou as características sensoriais dos ovos Houve interação significativa entre níveis de FLMSN x períodos de armazenamento sobre unidade Haugh e coloração da gema Com o aumento dos níveis de FLMSN houve redução linear (Y = 1,5192 – ,168x) na perda de peso e crescente (Y =1,816 + ,1x) na gravidade específica Quanto ao tempo de armazenamento dos ovos, verificou-se efeito quadrático para perda de peso (Y = ,8262 – ,436x + ,54x2), gravidade específica (Y = 1,944 – ,6x – ,3x2) e índice de gema (Y = ,46 – ,15x + ,3x2) A inclusão de níveis crescente de FLMSN na dieta de aves promoveu aumento linear (Y = 27,6332 + ,14x) na porcentagem de gema e redução (Y = 62,711 – ,1319x) na porcentagem de albúmen O tempo de armazenamento dos ovos afetou na porcentagem de albúmen e gema Houve um efeito linear decrescente (Y = 63,9926 – ,1787x) para porcentagem de albúmen, enquanto que para a porcentagem de gema houve um efeito linear crescente (Y = 26,2477 + ,1765x) A porcentagem de casca e espessura de casca não tiveram efeito para os tratamentos utilizados O pH do albúmen e gema dos ovos de poedeiras foi influenciado pelo tempo de armazenamento, sendo que o pH do albúmen dos ovos apresentou efeito quadrático (Y = 8,1862 + ,1893x – ,6x2) e o pH da gema efeito linear crescente (Y = 5,912 + ,81) Conclui-se que a FLMSN apresentou melhora na unidade Haugh e coloração da gema e não influencia no sabor dos ovos
Avaliação da imunidade protetora em frangos de corte vacinados com proteína recombinante rHsp70 de Eimeria tenella
Bogado, Alexey Leon Gomel; Garcia, João Luis [Orientador]; Yamamura, Milton Hissashi; Vidotto, Odilon; Silva, Luiz César da; Headley, Selwyn Arlington; Guimarães Júnior, José da Silva [Coorientador]
Resumo: A epidemiologia da coccidiose aviária caracteriza-se por uma grande disseminação de oocistos no meio ambiente, podendo ocorrer significantes prejuízos em granjas com aves infectadas, fazendo-se necessárias, portanto, medidas profiláticas para o seu controle Estas medidas são realizadas principalmente com o uso de anticoccídicos adicionados à ração No entanto, o manejo incorreto e a falta de critérios definidos para o uso dessas drogas têm gerado sérios problemas de resistência Somando-se a esse quadro, existe a pressão do mercado consumidor para banir drogas da alimentação animal Pesquisas que visam à obtenção de vacinas para o controle da coccidiose são realizadas com a finalidade de buscar alternativas frente à quimioterapia usual O objetivo do presente estudo foi clonar e expressar o gene HSP7 de E tenella em Escherichia coli, bem como, imunizar frangos de corte e avaliar a imunidade protetora Para isso 8 aves da linhagem Cobb, machos e fêmeas, com um dia de idade, foram alojadas em baterias metálicas com fornecimento de ração e água ad libitum, as quais foram distribuídas em quatro grupos (G1, G2, G3, e G4) com 2 aves cada No sétimo dia do experimento os animais foram separados e os tratamentos realizados como segue: G1 – aves vacinadas com a proteína rHSP7 associada ao adjuvante (Quil-A, 5?g), G2 – aves não imunizadas e não desafiadas, G3 – aves não imunizadas e desafiadas e G4 – aves inoculadas com adjuvante Quil A (5?g) Foram realizadas duas doses da vacina via sub-cutânea, com 15 e 5?g nos dias 7 e 14, respectivamente O mesmo foi realizado no G1 e G4 com PBS No dia 24 foi feito o desafio com 5,x14 oocistos de Eimeria tenella em todos os grupos, exceto o G2 Para a clonagem foi realizada a extração do RNA total dos esporozoítos pelo reagente TRIzol® de acordo com as instruções do fabricante O cDNA foi obtido a partir do de 1 µg de RNA total através do kit de Protoscript® M-MuLV Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene HSP7 foram confeccionados a partir da sequência Z46965 depositada no Genbank Em seguida, os fragmentos de DNA necessários para a clonagem foram obtidos pela técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando os oligonucleotídeos acima citados A clonagem dos genes foi realizada no vetor pTrcHis2 TOPO® (Invitrogen, USA) Após a clonagem em bactérias E coli, a proteína foi expressada e apresentou um tamanho de 23kDa, com rendimento de 5mg/L Quando avaliado a imunidade protetora, a eliminação de oocistos apresentou diferença significativa entre os tratamentos, sendo que a taxa de aumento da fecundidade dos oocistos do grupo vacinado com rHSP7 foi 66% maior em relação aos grupos controles desafiados Não houve diferença entre os tratamentos para o ganho de peso e escore de lesão O título de anticorpos dos dias 24 e 31 do grupo vacinado com rHSP7 apresentou uma densidade óptica pelo menos duas vezes maior em relação aos grupos controles desafiados A concentração de luteína plasmática do grupo vacinado não diferiu do grupo controle não desafiado Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a proteína rHSP7 promoveu um aumento da fecundidade dos oocistos e a concentração de luteína plasmáticas manteve-se nos mesmos níveis das aves não desafiadas, indicando uma proteção parcial contra o desafio realizado
Avaliação da imunogenicidade da proteína rHSP70 de Eimeria tenella em frangos de corte por via ocular
Martins, Guilherme Felippelli; Vidotto, Odilon [Orientador]; Garcia, João Luis; Guimarães Junior, José da Silva; Bogado, Alexey L. G.; Pereira, Ademir Benedito da Luz
Resumo: A coccidiose aviária é uma doença parasitária causada por protozoários do Filo Apicomplexa, do gênero Eimeria Diversos antígenos recombinantes vem sendo testados em vacinas sob condições experimentais apresentando resultados promissores A HSP7 é uma proteína que apresenta múltiplas funções em diversas fases do ciclo de vida deste parasito sendo considerada por diversos autores como promissora para utilização como imunógeno devido ao seu potencial imunogênico Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo produzir a proteína recombinante rHSP7 de E tenella, e avaliar a sua proteção contra desafio homólogo em frangos de corte O segmento de DNA, da proteína HSP7 foi obtido pela técnica de PCR utilizando primers específicos para o gene total Estes segmentos foram incorporados ao vetor de expressão de proteínas pTrcHis2 (Invitrogen) para produção dos plasmídeos recombinantes e posteriormente inseridos em E coli TOP1 competente quimicamente para obtenção e purificação das proteínas recombinantes Foram utilizadas 8 aves, não vacinadas contra coccidiose, distribuídas em quatro tratamentos: G1 - rHSP7 mais toxina colérica (n=2); G2 – soro albumina bovina e toxina colérica (n=2), G3 – somente PBS (controle positivo, n=2) e G4 - somente PBS (controle negativo, n=2) Os tratamentos foram executados por via ocular aos dias 7 e 14 do experimento No dia 21, todos os tratamentos foram desafiados com 5x14 oocistos esporulados de E tenella Foram avaliados o ganho de peso, conversão alimentar, eliminação de oocistos, fecundidade e anticorpos anti-rHSP7 A expressão do gene hsp7 permitiu a produção de uma proteína rHSP7 de aproximadamente 23kDa Quanto ao ganho de peso G1 apresentou um aumento de 2,7% em relação a G4, enquanto G3 apresentou redução de 2,22% neste parâmetro A titulação de anticorpos demonstrou uma intensa resposta humoral em G1 no pós-desafio Apesar da maior eliminação de oocistos em G1, não foram observadas diferenças estatísticas significantes entre os grupos desafiados (p=,162) Da mesma forma não foi observado diferença estatística entre os grupos desafiados no quesito escore de lesão (p=,137) Os tratamentos não promoveram a melhora nos parâmetros estudados à exceção dos níveis de anticorpos que mostraram altos títulos pós desafio, sugerindo tal proteína como promotora da imunidade humoral
Avaliação da qualidade do leite pasteurizado produzido e comercializado no estado do Paraná, Brasil, no período de março/2005 a setembro/2007
Sassahara, Marcia; Pontes Netto, Daisy [Orientador]; Machinski Junior, Miguel; Barros, Márcia de Aguiar Ferreira; Balarim, Mara Regina Stipp; Beloti, Vanerli
Resumo: O leite é um alimento que apresenta elevado valor nutricional, desempenhando importante papel na economia nacional Por ser passível de adulterações e contaminações, é necessário o monitoramento de sua qualidade, a fim de assegurar ao consumidor e à indústria um produto final com qualidade adequada Durante o período de março de 25 a setembro de 27 foram coletadas 252 amostras de leite pasteurizado produzido no Estado do Paraná, em laticínios locais e pontos de comércio varejista Deste total de amostras, 246 foram submetidas a análises físico-químicas, sendo que 19 (77,2%) das amostras apresentaram alteração de pelo menos um dos itens avaliados A avaliação microbiológica foi efetuada em 123 amostras, das quais 68 (55,3%) apresentaram alterações nos valores observados A pesquisa de resíduos de antibióticos foi realizada em 252 amostras de leite quanto à presença de ß-lactâmicos, tetraciclinas e gentamicinas (método SNAP®), estreptomicinas e neomicinas (ELISA), apresentando positividade de 5 (2,%), 6 (23,8%), 4 (1,6%), 7 (2,8%) e 25 (9,9%), respectivamente Os valores encontrados neste estudo indicam que as amostras de leite analisadas apresentam-se fora dos padrões de qualidade adequados, refletindo falhas na cadeia produtiva do leite
Avaliação da sanguinarina sobre parâmetros intestinais e sanguíneos de suínos por meio de diferentes modelos experimentais (in vitro, ex vivo e in vivo)
Silva, Roberta Abrami Monteiro; Silva, Caio Abércio da [Orientador]; Buck, Letícia Yamasaki; Oba, Alexandre; Venâncio, Emerson José; Tse, Marcos Livio Panhosa; Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro [Coorientadora]
Resumo: A plena atividade funcional do trato digestório garante o êxito de desempenho dos leitões em toda sua vida O intestino, diante dos desafios constantes a que é submetido nos sistemas comerciais de produção, demanda recursos que preservem sua integridade e aumentem a sua capacidade absortiva, melhorando o aproveitamento do alimento ingerido Para esse fim, o presente trabalho objetivou avaliar os efeitos do extrato vegetal Sanguinarina sobre a integridade de células epiteliais intestinais e na saúde intestinal de suínos no pós desmame e na fase de crescimento O trabalho foi realizado em três etapas: testes in vitro, ex vivo e in vivo Na primeira etapa, a Sanguinarina foi testada sobre células epiteliais intestinais de suínos (IPEC-1), as quais após o processo de divisão celular foram expostas às doses de ,1; ,25; ,5; ,75; 1, e 5, µM de Sanguinarina por 48 horas O teste de citotoxicidade realizado (MTT), apontou 5% de mortalidade celular (IC5) com a dose de ,65 µM, equivalente a 25 mg/ L de Sanguinarina Na segunda etapa, a Sanguinarina foi testada em explantes de jejuno de leitões com 24 dias de vida Após testes para estabelecer a melhor dose de Sanguinarina, optou-se por trabalhar com a dose de 1, mg/L Posteriormente, os explantes foram incubados na presença de Sanguinarina (1, mg/L); DON (1 µM) e Sanguinarina (1, mg/L) + DON Os explantes, quando desafiados com DON apresentaram redução (p<,5) no escore tecidual, altura de vilosidades e profundidade de criptas A Sanguinarina na presença de DON diminuiu de forma significativa as lesões causadas pela micotoxina no epitélio intestinal Na terceira e última etapa do trabalho, foram utilizados 24 suínos, com idade média de 8 dias e peso médio inicial de 3,36 ± 2,9 kg Foi realizada coleta de sangue ao abate para quantificação de imunoglobulinas Após cinco dias de gavagem, com as soluções Controle (água mineral) e Sanguinarina (1,mg/ L), os animais foram eutanasiados e fragmentos das porções do intestino delgado foram coletadas para avaliações histológicas e morfométricas O fornecimento de Sanguinarina aumentou a secreção de IgA sérica A Sanguinarina não mostrou melhora da arquitetura tecidual quando comparada ao grupo controle A manutenção das funções absortiva e de barreira física do intestino exposto à Sanguinarina não foi eficaz, necessitando estudos posteriores
Avaliação da toxicidade de desoxinivalenol e micotoxinas emergentes em suínos
(2023-03-02) Hasuda, Amanda Lopes; Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro; Di Santis, Giovana Wingeter; Sartori, Daniele; Keller, Kelly Moura; Oliveira, Carlos Augusto Fernandes de
O desoxinivalenol (DON) é uma micotoxina que causa danos intestinais por meio do estresse ribotóxico e oxidativo. Algumas micotoxinas detectadas recentemente são chamadas de micotoxinas emergentes, entre elas a beauvericina (BEA) e as eniatinas (ENNs). No entanto, dada a falta de estudos in vivo, o risco de BEA e ENNs para a saúde animal e humana não pode ser confirmado. Portanto, o objetivo desse trabalho foi verificar os efeitos tóxicos de DON, BEA e ENNs em suínos. Para isso, foram realizados três experimentos. O primeiro avaliou o efeito da ingestão de DON (2,5 mg/kg) sozinho (grupo DON), uma mistura de BEA (2,5 mg/k) e ENN B + ENN B1 (1,35 mg/kg) (grupo EB) e uma associação entre todas as micotoxinas (2, 3,5 e 1,8 mg/kg, respectivamente) (grupo EB + DON) em 32 leitões por 14 dias. O sangue dos animais foi colhido 7 e 14 dias após o início dos tratamentos para obtenção do plasma para avaliações hepáticas (atividade de enzimas e metabolismo hepático) e intestinais (i-FABP, ZON e IGF-1). Os animais foram eutanasiados para obter amostras de jejuno, cólon, fígado e linfonodos. Todos os fragmentos de órgãos foram processados para análise histológica e a expressão de genes no jejuno e fígado. As fezes foram colhidas ao final do experimento para análise do microbioma. A ingestão de EB + DON diminuiu o ganho de peso dos animais. As atividades das enzimas hepáticas diminuíram após 14 dias em leitões recebendo dieta EB + DON em comparação com leitões recebendo dieta controle. Todas as dietas contaminadas com as micotoxinas levaram a alterações histológicas moderadas a graves no jejuno, fígado e linfonodos. A análise metagenômica revelou que a ingestão de EB diminuiu a diversidade da microbiota intestinal. O segundo e o terceiro experimentos utilizaram uma associação do modelo in vitro (células HepG2) e o modelo ex vivo, com uma técnica de corte de precisão (PCLS) do fígado. Foram avaliados a viabilidade celular, os biomarcadores hepáticos, a morfologia hepática e a expressão de diversos genes. Para avaliar a citotoxicidade, as células foram incubadas em concentrações crescentes (0-100 µM). Para as demais análises, os dois modelos foram expostos ao DON (10 µM) ou às micotoxinas emergentes (BEA, ENN A1/B/B1, emodina - EMO, apicidina - API e aurofusarina - AFN) (10 µM). No segundo experimento, o DON diminuiu a viabilidade celular, induziu alterações teciduais, apoptose e modificou a expressão de genes inflamatórios e de fatores de transcrição de forma semelhante em ambos os modelos. Os biomarcadores hepáticos não mostraram alteração, e a expressão dos genes apoptóticos e do estresse oxidativo alterou-se apenas in vitro. Os resultados demonstram que o fígado é um alvo relevante para observar a resposta inflamatória devido à superexpressão de fatores de transcrição em ambos os modelos. Os parâmetros avaliados in vitro e ex vivo mostraram perfis semelhantes, apesar de algumas diferenças na intensidade da expressão gênica. No terceiro experimento, a maioria das micotoxinas foram citotóxicas e alteraram os níveis de genes relacionados à inflamação, fator de transcrição e metabolismo hepático in vitro. Nos explantes, apenas ENN B1 foi capaz de causar alteração morfológica significativa, mas sem mudanças nos níveis plasmáticos dos bioquímicos hepáticos. A ENN B1 também alterou poucos genes relacionados à inflamação, estresse oxidativo e proteínas de junção. No geral, nossos resultados fornecem novos insights sobre o impacto das micotoxinas emergentes sozinhas ou com DON no desempenho, saúde intestinal e parâmetros imunológicos em suínos. Também fornecem dados adicionais sobre os efeitos tóxicos do DON e das micotoxinas emergentes no fígado e mostram que explantes de fígado são uma ferramenta relevante para avaliar a toxicologia de contaminantes alimentares.

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