Anaplasma marginale : análise da variabilidade do gene msp1 a e avaliação imunogênica da vacina de DNA contendo genes para MSP1a, MSP1b e MSP5 em camundongos BALB/c
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Resumo: O Anaplasma marginale é um importante patógeno riquetsial de bovinos transmitido por carrapato que invade e se multiplica dentro de eritrócitos, causando anemia hemolítica durante a infecção aguda A imunização com proteínas de membrana externa (OMP) purificadas induz proteção contra doença aguda Das 21 OMPs descritas, seis MSPs (1a, 1b, 2-5) já foram bem caracterizadas O complexo MSP1 (MSP1a e 1b) é adesinas de eritrócitos de bovinos A MSP1a varia em tamanho pelo número de repetições in tandem de 28-29 aminoácidos Vacina de DNA contra a anaplasmose tem sido investigada usando os genes msp1a e msp1ß, e os resultados evidenciaram resposta celular e humoral em camundongos e bovinos A imunização com DNA plasmidial que codifica genes de interesse é uma tecnologia nova e promissora no desenvolvimento de vacinas Vacinas de DNA que visam múltiplos epitopos têm se mostrado mais eficientes aumentando a imunogenicidade e a proteção de animais vacinados quando comparadas com as de epitopo único Os objetivos deste trabalho foram analisar a variabilidade do gene msp1a de amostras paranaenses de A marginale, testar a capacidade dos plasmídios recombinantes expressarem MSP1a, MSP1b e MSP5 em células eucarióticas e avaliar a imunogenicidade destas vacinas administradas individualmente ou em associação, em camundongos BALB/c A análise da região repetitiva do gene msp1a identificou a presença de seis, cinco e três repetições nas amostras PR1, PR2 e PR3, respectivamente, e seis padrões de repetições inéditas Contudo, a região da MSP1a responsável pela imunogenicidade foi conservada Os plasmídios pcDNA/ msp1a, pcDNA/ msp1 ß e pcDNA/ msp5, os quais codificam os genes das MSPs sob o controle do promotor do citomegalovirus e intron A, foram construídos, multiplicados em E coli TOPO1 e purificados A expressão das proteínas MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro foi realizada em células Vero usando lipofectamina 2 e Imunofluorescência Indireta (IFA), utilizando anticorpos monoclonais Sete grupos de camundongos foram imunizados para avaliar a produção de IgG total e determinar os isotipos IgG1 e IgG2a: G1-1 mL PBS; G2-1 mg de vetor; G3- 1 mg de corpúsculos iniciais de A marginale + adjuvante de Freund; G4- 1 mg pcDNA-msp1a; G5-1 mg pcDNA-msp1b; G6-1 mg of pcDNA-msp5 e G7- pool de plasmídios (33 mg de cada plasmídio) Três semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados para avaliar a proliferação dos esplenócitos As células Vero transfectadas com plasmídios recombinantes reagiram com anticorpos monoclonais específicos, demonstrando a expressão dos genes msp IgG específica para a MSP1a e MSP5 foram detectadas tanto por ELISA quanto por Western blot Os grupos que receberam pcDNA-msp1a and pcDNA-msp5 mostraram predomínio do isotipo IgG2a, e proliferação de esplenócitos, sugerindo que estes plasmídios são bons candidatos para estimular reposta imune Th1 A associação dos três plasmídios recombinantes (pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1b and pcDNA-msp5) empregados na imunização de camundongos induziram altos títulos de anticorpos por ELISA e reagiram com todas proteínas recombinantes (rMSP1a, rMSP1b e rMSP5) de A marginale por Western blot Adicionalmente, a combinação dos plasmídios levou a uma forte proliferação de linfócitos (SI = 12, 2), enquanto o gene msp1a determinou significante proliferação significativa (SI = 2,6) e os genes msp1b e msp5 não promoveram proliferação (SI<2) Os resultados demonstraram que a associação dos plasmídios induziu a expressão das MSPs e estimulou significante produção de linfócitos T, podendo ser uma estratégia eficiente para a imunoprofilaxia da anaplasmose
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Palavras-chave
Anaplasmose, Proteínas de membrana, Bovino, Doenças, Imunologia veterinária, Veterinary immunology, Cattle - Diseases