02 - Mestrado - Genética e Biologia Molecular
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Item Atividade anticâncer do flavonoide braquidina C em células tumorais de próstata DU145 cultivadas em modelo 2D e 3D(2021-11-26) Oliveira, Larissa Cristina Bastos de; Serpeloni, Juliana Mara; Antunes, Lusânia Maria Greggi; Favaron, Phelipe Oliveira; Cólus, Ilce Mara de SyllosO câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo e, juntamente com os desafios apresentados pela quimioresistência, tem despertado o interesse por fitoquímicos que apresentem propriedades quimioterápicas. Fridericia platyphylla (Cham.) L.G. Lohmann é uma espécie vegetal nativa do cerrado brasileiro cujo potencial anticâncer deve-se principalmente ao seu efeito antiproliferativo, anti-inflamatório e citotóxico, demonstrados em estudos anteriores. A braquidina C (BrC), flavonoide isolado a partir das raízes dessa espécie vegetal, foi avaliada nesse estudo quanto aos seus efeitos sobre a viabilidade, proliferação e migração de células de próstata DU145 cultivadas em modelos 2D e 3D in vitro. O efeito da BrC na viabilidade celular foi avaliado pelos ensaios de redução de resazurina e liberação de lactato desidrogenase (LDH) em cultura de células 2D (0,24-30,72 µM) e 3D (5-60 µM). Após 24 h de tratamento, a BrC reduziu a viabilidade das células DU145 em ambos os modelos com valores de IC50 iguais a 47,31 (2D) e 229,8 µM (3D). Em EMTs de próstata esse efeito mostrou-se tempo-dependente com valores de IC50 iguais a 229,8, 210,5, 116,1 e 65,02 µM após, respectivamente, 24, 48, 72 e 96 h de tratamento. Após 72 h de tratamento, observou-se a redução da viabilidade celular com a BrC nas concentrações de 30,72 µM (2D) e 60 µM (3D) no ensaio do LDH. No modelo bidimensional, a BrC não alterou a proliferação das células DU145. Na avaliação dos esferoides, após 11 dias de tratamento, a BrC (5 - 60 µM) interferiu no crescimento, morfologia, integridade e volume dos EMTs. A redução da viabilidade celular induzida pela BrC parece não estar relacionada à indução de espécies reativas, como demonstrado por meio da utilização da sonda CM-H2DCFDA. A BrC reduziu a migração e a invasão das células DU145 no modelo 2D (6,00 µM) e a migração celular no modelo 3D (5-60 µM). Os mecanismos pelos quais a BrC reduziu a viabilidade celular foram avaliados por meio da expressão de genes (RT-qPCR) e proteínas (western blotting). Na avaliação da expressão gênica após 48 h de tratamento, BrC (50 µM) regulou positivamente os genes CASP3 e TNF-a e negativamente o gene BIRC5, que codifica a proteína anti-apoptótica survivina. O gene Nkx3.1, um gene supressor tumoral relacionado com as vias de proliferação celular, foi regulado positivamente pela BrC (5 e 50 µM). Na avaliação da expressão proteica, BrC (60 µM) aumentou a expressão de CASP7 e BAX enquanto reduziu a expressão de TNF-a. A BrC (5-60 µM) interferiu nos processos migratórios das células DU145 em EMTs após 48 h de tratamento, diminuindo a área de migração em relação ao grupo controle. A redução na capacidade migratória parece estar relacionada com a modulação negativa dos genes MMP9, MMP11 e ITGAM e regulação positiva de CDH1. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a BrC afeta a viabilidade, proliferação e migração de células DU145 em modelos 2D e 3D, contribuindo para a busca de alternativas terapêuticas contra o câncer de próstata metastático.Item Genotoxicidade e indução de apoptose por Fluconazol em células de mamíferos in vitroNamba, Vickeline; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Orientador]; Santos, Fábio Vieira dos; Mantovani, Mário SérgioResumo: O Fluconazol é um antifúngico amplamente prescrito para combater candidíase e dermatomicoses, além de ser usado como medida profilática em transplantados, imunodeprimidos e pessoas com câncer Apesar desse antimicótico já ser comercializado, é necessário farmacovigilância, que consiste em verificar efeitos prejudiciais dos medicamentos, visando prevenir possíveis danos aos seres humanos No presente estudo, foram avaliadas 1 diferentes concentrações do Fluconazol para se determinar sua citotoxicidade e as concentrações a serem utilizadas nos experimentos posteriores Esta avaliação foi realizada em uma linhagem de células de ovário de hamster Chinês (CHO-K1) e na linhagem de hepatoma de Rattus novergicus (HTC), utilizando o teste MTT As concentrações de ,781, 1,5625 e 3,125 µg/mL foram avaliadas por meio do ensaio do cometa, teste do micronúcleo e teste de apoptose Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando os testes de Kruskal-Wallis/Dunn para avaliar os dados de citotoxicidade e ANOVA/Tuckey para os demais resultados O Fluconazol apresentou citotoxicidade para as células CHO-K1 a partir da concentração de 6,25 µg/mL, porém, a citotoxicidade não foi observada para as células HTC Nas células CHO-K1, o Fluconazol foi genotóxico em todas as concentrações testadas após 24h de tratamento e não induziu mutagênese nem apoptose O antimicótico apresentou genotoxicidade para a linhagem celular HTC em todas as concentrações testadas após 3h de tratamento, e após 24h de tratamento somente nas concentrações de 1,5625 e 3,125 µg/mL Entretanto, após 24 horas de tratamento não foi mutagênico, mas induziu apoptose, que pode ter mascarado a formação de micronúcleos A genotoxicidade e a ausência de mutagenicidade detectadas nas duas linhagens celulares sugerem que o sistema de reparo atuou, impedindo uma possível fixação do danoItem Estudo citogenético em representantes do gênero Eleocharis (cyperaceae)Silva, Carlos Roberto Maximiano da; Vanzela, André Luis Laforga [Orientador]; Jordão, Berenice Quinzani; Pierozzi, Neiva IzabelResumo: O gênero Eleocharis (Cyperaceae) apresenta cerca de 6 espécies distribuídas desde os trópicos até os pólos porém, ocupa preferencialmente a área tropical das Américas Eleocharis é reconhecido em Cyperaceae pela inflorescência única sem brácteas involucrais As características citológicas como, cromossomos holocêntricos, meiose pós-reducional, ausência de tétrades e cariótipos reorganizados por agmatoploidia, simploidia e poliploidia são compartilhadas por todos os representantes desta família Estudos citogenéticos descrevem uma considerável variação no tamanho e no número cromossômico deste gênero As espécies mostram cariótipos variando de 2n = 1 a 2n = ca 196, com número básico x=5 Variações no número e posicionamento de bandas C-CMA3/DAPI e na quantidade de sítios de DNAr 45S localizados por FISH sempre nas extremidades dos cromossomos, características encontradas nas espécies desta família Neste trabalho os cariótipos de 24 populações de 12 espécies de Eleocharis (Cyperaceae) foram analisados Todas as espécies mostraram cromossomos holocêntricos já que não foram observadas contrições primárias Os números cromossômicos variaram de 2n = 6 em E subarticulata a 2n = 54 em E acutangula Para E subarticulata que possui um número cromossômico reduzido (n=3), característica pouco comum nos vegetais, foi analisado o comportamento meiótico, que foi pós-reducional Bandamento C-CMA3/DAPI foi realizado em sete espécies Todas mostraram bandas CMA3+ nas extremidades dos cromossomos e em apenas poucos pares Apenas E sellowiana apresentou bandas DAPI terminais em alguns cromossomos FISH com a sonda de DNAr 45S foi feito em cinco espécies e, com exceção de E flavescens e E sellowiana com dez marcações terminais, as outras apresentaram quatro marcações A hibridação com sonda telomérica realizada em E subarticulata marcou todas as extremidades dos seis cromossomos e dois mostraram marcações intersticiais A maioria das espécies estudada pertence à seção Eleocharis, que contém a maior variação cariotípica Na seção Eleogenus as espécies estudadas foram confirmadas como poliplóides Na seção Limnochloa as espécies analisadas exibiram cromossomos pequenos e numerosos, características da seção Estes resultados indicam que a poliploidia é o evento evolutivo mais importante na diferenciação dos cariótipos deste gênero e, em algumas espécies os cariótipos foram diferenciados por agmatoploidia e simploidiaItem Efeito protetor do selenito de sódio frente aos danos causados pelo H2O2 em células HepG2/C3AZanetti, Thalita Alves; Mantovani, Mário Sérgio [Orientador]; Guterres, Zaira da Rosa; Lepri, Sandra ReginaResumo: Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) estão envolvidas em vários processos patológicos Esses efeitos são minimizados no organismo por compostos com atividade antioxidante como o Selênio O Selenito de Sódio (SS) é uma forma inorgânica de selênio e sua capacidade protetora precisa ser melhor esclarecida Por isso, o estudo investigou o efeito do SS contra o peroxido de hidrogênio (H2O2) em células HepG2/C3A analisando citotoxicidade e proliferação celular comparando com dados molecular (mRNAs e proteínas) O SS apresentou atividade citoprotetora e antigenotóxica, entretanto, não foi observado alteração na curva de proliferação celular e na alteração das fases de ciclo celular (retenção em G2/M) nos tratamentos associados (SS+ H2O2) quando comparado com H2O2 O SS modulou o sistema de defesa antioxidante nas células induzidas ao estresse oxidativo pelo H2O2, onde observou-se um aumento da expressão relativa do mRNA GPX1 no tratamento associado mostrando resposta antioxidante Além disso, alterações do mRNA CAT e proteína SOD1 e PRX2 pelo H2O2, foram minimizadas pelo tratamento associado também Observou-se normalização dos níveis do mRNA CCN2B nos tratamentos associados, entretanto, esse efeito não foi evidenciado na expressão dos outros genes controladores de ciclo celular, onde observou-se aumento na expressão dos mRNAs CDKN1A, CDKN1C, CDKN2B e GADD45A nos tratamentos com H2O2 independente de SS Desta maneira, nossos resultados demonstram que a proteção do SS se deve pela modulação do sistema de defesa antioxidante, entretanto este efeito não foi eficiente ao ponto de modular a expressão de genes que controlam o ciclo celular impedindo a continuidade do crescimento celularItem Prospecção de genes de soja expressos sob condições de déficit hídricoRibeiro, Juliana Marcolino; Nepomuceno, Alexandre Lima [Orientador]; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Molinari, Hugo Bruno CorreaResumo: A soja (Glycine max (L) Merril) é uma cultura economicamente importante, sendo utilizada principalmente na alimentação humana e animal, mas também com um grande potencial para se tornar uma importante fonte de biocombustíveis Entre os fatores que influenciam a produtividade, a seca é o principal fator limitante e o de mais difícil controle Neste estudo, foram analisadas duas cultivares de soja contrastantes quanto a tolerância / sensibilidade à seca: BR 16 (sensível) e Embrapa 48 (tolerante) As plantas foram cultivadas em sistema hidropônico até o estádio V3, quando o tratamento de déficit hídrico foi imposto, consistindo na exposição das raízes à desidratação Bibliotecas subtrativas foram construídas e sequenciadas por equipamento Genome Analyzer IIe (Illumina) Análises in silico das sequências obtidas permitiu a identificação de vários genes diferencialmente expressos em raízes das duas cultivares durante o déficit hídrico A categorização de acordo com os processos biológicos envolvidos revelou as alterações celulares em resposta à seca e as diferenças nos perfis transcricionais entre as cultivares Além disso, foram encontrados diversos fatores de transcrição, dentre eles, genes da família AP2/EREBPAnálises filogenéticas destes genes revelaram estreita relação com genes DREB de Fabaceae Ensaios de qPCR confirmaram a expressão de seis candidatos AP2/EREBP em resposta à seca, validando os resultados obtidos nas bibliotecas subtrativas Curiosamente, em nossas bibliotecas, foram identificados 12 fatores de transcrição ainda não relacionados com a resposta ao déficit hídrico e formulamos hipóteses sobre seu papel neste tipo de estresseItem Detecção molecular e isolamento de Streptococcus agalactiae em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) com e sem sinais clínicos de doença bacterianaScarpassa, Josiane Aniele; Vilas-Boas, Laurival Antônio [Orientador]; Alfieri, Alice Fernandes; Casaril, Kérley Braga Pereira Bento; Pretto-Giordano, Lucienne Garcia [Coorientadora]Resumo: A produção de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) está em intenso crescimento no Brasil e no mundo Streptococcus agalactiae é considerado um sério problema sanitário em sistemas intensivo de cultivo de tilápias, causando prejuízos econômicos a atividade O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia de identificação de S agalactiae pela técnica de amplificação por PCR e isolamento bacteriano de S agalactiae em tilápia do Nilo com e sem sinais clínicos de doença bacteriana durante as quatro estações do ano de 213 Foram coletados 2 peixes em cinco propriedades de criação em tanques-rede, no norte do Paraná, Brasil, sendo 5 animais por estação O verão foi a estação com maior ocorrência de S agalacitae tanto pela técnica de amplificação por PCR quando pela técnica de isolamento Dentre os peixes coletados, 17 apresentavam sinais clínicos de doença bacteriana e 183 estavam aparentemente saudáveis De cada peixe foram colhidas amostras em duplicata de rim, encéfalo e fígado, para isolamento bacteriano e extração de DNA e posterior amplificação por PCR utilizando os iniciadores F1 e IMOD específicos para região do gene 16S rRNA de S agalactiae Em 56% (112/2) dos peixes avaliados a PCR foi eficaz na detecção de positivos para S agalactiae e, somente, em 1% (2/2) dos peixes foi possível o isolamento da bactéria Foi detectada por PCR em 1% (17/17) dos peixes com sinais clínicos e destes 94,11% (16/17) por isolamento Dos 183 peixes assintomáticos, 51,91% foram positivos na PCR e somente 2,18% por isolamento Esses dados sugerem que o próprio peixe pode ser o reservatório desta bactéria, podendo em condições adversas, os animais assintomáticos tornarem-se sintomáticos e disseminar a bactéria Desta forma, a utilização de técnicas de detecção mais sensíveis como a PCR são importantes para monitorar a presença da bactéria nos tecidos de peixes assintomáticos e intervir no manejo sanitário antes do agravamento dos sinais clínicos e morte dos peixesItem Degeneração nuclear durante o desenvolvimento do grão de pólen em Rhynchospora breviuscula H. Pfeiff (Cyperaceae)Rocha, Danilo Massuia; Vanzela, André Luis Laforga [Orientador]; Mariath, Jorge Ernesto de Araújo; Andrade, Célia Guadalupe Tardeli de JesusResumo: A microsporogênese em Cyperaceae é marcada pela formação de pseudomônades, em que um núcleo permanece no centro da célula enquanto os demais migram para uma das extremidades, são separados por parede, tornam-se sucessivamente menores e eventualmente são abortados Este trabalho buscou investigar os componentes celulares dessa estrutura, PCD e possível perda de material genético nas células degenerativas em Rhynchospora breviuscula Anteras foram processadas de diferentes maneiras para microscopia de luz Foi estudado o comportamento de elementos do citoesqueleto por microscopia de luz e citoquímica Elementos repetitivos de DNA foram localizados por FISH para entender seu comportamento no processo de degeneração, que também foi avaliado por citometria de fluxo Em R breviuscula, células degenerativas encontram-se no polo abaxial e apresentam-se funcionais até estágios tardios de desenvolvimento Actina-F foi depositada regularmente na placa celular na meiose e PM I Contudo, células tratadas com colchicina apresentaram quatro a cinco núcleos similares aos degenerativos na região central-abaxial, indicando a necessidade do fragmoplasto na manutenção de um produto funcional cuja seleção não seria estocástica Sinais de hibridização dos elementos Tyba-SatDNA e gypsy-like diminuem de acordo com a perda global de cromatina, enquanto copia-like apresenta uma diminuição mais acentuada Possivelmente esta diferença esteja relacionada à diferente distribuição desses grupos nos cromossomos: Tyba é um satDNA típico de centrômeros enquanto gypsy-like e copia-like possuem distribuição dispersa, sendo o último encontrado em regiões de cromocentro A perda de material genético foi confirmada por citometria de fluxoItem Regulação da produção de subtilisinas pelo fungo entomopatogênico Beauveria bassianaFerrari, Leandro de Barros; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Fungaro, Maria Helena Pelegrinelli; Furlaneto-Maia, LucianaResumo: As proteases extracelulares tem sido demonstradas como determinantes de virulência na patogenicidade dos fungos contra insetos Neste estudo foi analisada a produção de protease tipo-subtilisina (Pr1) por Beauveria bassiana CG425, que é um fungo de interesse para o controle do gafanhoto Rhammatocerus schistocercoides Para entender o papel de Pr1 durante a infecção de R schistocercoides foi analisado a secreção desta protease durante o crescimento do fungo em meio contendo nitrato e meio contendo a cutícula Foi observado um aumento da produção de Pr1 em meio contendo cutícula As análises de PCR em tempo real revelaram que o nível de expressão relativa de Pr1Bb em 12 horas de incubação no meio contendo a cutícula, foi aproximadamente 32 vezes superior ao observado no meio contendo nitrato Em meio mínimo contendo metionina (,5%) um alto nível de Pr1 também foi observado Nestas condições os níveis transcricionais de Pr1Bb foi aproximadamente 6 vezes superior em relação ao meio contendo nitrato Além disso, no meio suplementado com cutícula de gafanhoto, a adição de metionina numa concentração de ,75% reprimiu a produção desta protease e a expressão de Pr1Bb Os resultados obtidos demonstraram que o gene Pr1Bb é regulado por componentes da cutícula de R schistocercoides e pelo aminoácido metionina Neste estudo foi demonstrado, pela primeira vez, os níveis transcricionais do gene Pr1 de B bassiana na presença da cutícula de R schistocercoides, ampliando o conhecimento sobre a regulação da produção de Pr1 por este fungoItem Estudo genético populacional em Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) na cidade de Londrina-PRLopes, Thayná Bisson Ferraz; Rosa, Renata da [Orientador]; Silva, Mário Antônio Navarro da; Souza, Rogério Fernandes de; Zequi, João Antonio Cyrino [Coorientador]Resumo: Londrina é um dos maiores e mais urbanizados municípios do Estado do Paraná e da região Sul do Brasil No município, afim de evitar a infestação do mosquito vetor e a circulação de vírus, o uso de inseticidas piretroides é bastante comum Esse composto químico têm um custo acessível e é utilizado principalmente no ambiente doméstico, porém seu uso descontrolado pode ocasionar a seleção de alelos de resistência nas populações (resistência knockdown) O monitoramento de mutações de resistência assim como a variabilidade genética do mosquito é importante para conhecer a estrutura das populações e direcionar campanhas de controle do inseto Sendo assim, o presente estudo avaliou onze localidades em diferentes regiões da cidade e três localidades dentro da Universidade durante os meses de novembro e dezembro de 217 Em relação a variabilidade genética (gene mitocondrial ND4), dezessete haplótipos foram encontrados nas cinco regiões do município, enquanto na Universidade dez haplótipos foram observados Em ambas análises, o número haplotípico pode ser considerado elevado O fluxo gênico foi baixo e as populações avaliadas se demonstraram estruturadas: a variação foi maior entre populações que dentro delas em ambas localidades (77,9% em Londrina e 67,7 na UEL) Em relação às mutações de resistência (Val116Ile e Phe1534Cys kdr), as populações avaliadas apresentaram uma elevada frequência dos alelos mutantes: 5% para o alelo Ilekdr na cidade de Londrina e 57,3% na UEL, enquanto para o alelo Cyskdr, a frequência foi de 52% na cidade de Londrina e 62,2% nos três centros avaliados da UEL Na Universidade, 3321 ovos de Ae aegypti foram coletados para monitoramento, com positividade de 54% nas armadilhas e proporções semelhantes de infestação nas três localidades Os resultados demonstraram a diferenciação de cada ponto de coleta, sugerindo que ações de controle devem ser direcionadas considerando a particularidade de cada região e de cada localidade A partir da forte presença dos alelos de resistência, é possível que a aplicação de inseticidas piretroides não seja a forma de controle ideal no município, tornando necessário o uso de outras alternativas para evitar a proliferação do mosquito e surtos de dengue e outras arbovirosesItem Estudos citogenéticos em peixes da subfamília Loricariinae (siluriformes, loricariidae)Maia, Tatiana Peres de Assis; Dias, Ana Lúcia [Orientador]; Vanzela, André Luís Laforga; Oliveira, CláudioResumo: A subfamília Loricariinae apresenta 29 espécies distribuídos em 31 gêneros, sendo que até o momento apenas 15 espécies foram estudadas citogeneticamente Frente à grande variabilidade interespecífica que é encontrada na macroestrutura cariotípica da subfamília Loricariinae, este grupo é um excelente material para estudos citogenéticos No presente estudo foram analisadas cinco espécies da subfamília Loricariinae: Loricariichthys platymetopon e Rineloricaria pentamaculata, coletados na bacia do Rio Paranapanema; Loricariichthys anus, Rineloricaria cadeae e Rineloricaria strigilata, coletados no sistema hidrográfico do lago Guaíba/RS Os exemplares foram submetidos a análises cariotípicas por meio da coloração convencional (Giemsa), impregnação por nitrato de prata, bandamento C e fluorocromos base-específicos Cromomicina A3 e DAPI Na análise com Giemsa, Loricariichthys platymetopon e Loricariichthys anus apresentaram 2n=54 cromossomos, entretanto com diferentes fórmulas cariotípicas Loricariichthys platymetopon apresentou 6m+18sm+4st+26a e L anus 8m+16sm+4st+26a, sendo que nesta ultima espécie foi encontrado um polimorfismo estrutural no par 25, tanto para machos como para fêmeas O gênero Rineloricaria, apresentou número diplóide, de 2n=56 cromossomos (2m+6sm+48a) para R pentamaculata, 2n=62 cromossomos (2sm+2st+58a) para R cadeae e 2n=7 (4sm+2st+64a) para R strigilata A impregnação pelo nitrato de prata detectou RONs simples para todas as espécies, sendo intersticial somente para L anus A coloração com CMA3 mostrouse correspondente a estas regiões, que apresentam-se negativas com DAPI A heterocromatina mostrou-se distribuída na região pericentromérica da maioria dos cromossomos e também associada às RONs em todas as espécies analisadas Os resultados obtidos no presente trabalho são importantes para uma melhor caracterização das espécies estudadas e podem auxiliar nos estudos relacionados a evolução cariotípica desta subfamíliaItem Inferência funcional de genes hipotéticos da ilha simbiótica da estirpe CPAC 15 de Bradyrhizobium japonicumFerreira, Everton Geraldo Capote; Barcellos, Fernando Gomes [Orientador]; Batista, Jesiane Stefânia da Silva; Rodrigues, Elisete Pains; Hungria, Mariângela [Coorientadora]Resumo: A fixação biológica do nitrogênio (FBN) na soja (Glycine max (L) Merr) ocorre através da simbiose com bactérias (rizóbios), como a espécie Bradyrhizobium japonicum, seu principal simbionte Recentemente após o sequenciamento do genoma da estirpe CPAC 15 de Bradyrhizobium japonicum, utilizada como inoculante comercial em soja, observou-se a presença de aproximadamente 5% de genes codificando para proteínas hipotéticas Neste contexto, o estudo teve como objetivo a análise da expressão de genes localizados dentro da ilha simbiótica e que codificam para proteínas hipotéticas e que possam estar relacionadas à FBN e a atividade saprofítica A inferência funcional foi realizada com base em busca de similaridades com diversos bancos de dados e programas de predições de estruturas como peptídeos sinais, localização celular, domínios conservados, entre outros A avaliação da expressão gênica foi realizada através de RT-qPCR com indução com genisteína em meio de cultivo com a bactéria, por aproximadamente, 48 horas As análises de similaridade com o banco de dados RefSeq demonstrou que todas as proteínas hipotéticas estavam distribuídas em vários genomas de diferentes espécies do gênero Bradyrhizobium Os resultados obtidos por RT-qPCR demonstraram que todos os genes hipotéticos selecionados obtiveram elevados níveis de expressão em presença de genisteína em relação ao controle, o metanol A maioria dos genes codificando para proteínas hipotéticas inferidos funcionalmente estava relacionada ao transporte de substâncias, vias metabólicas de aminoácidos e degradação de compostos, e possivelmente então, podendo ser úteis na atividade saprofítica da estirpe e na FBN em siItem Diversidade nucleotídica de genes envolvidos na biossíntese de açúcares e diterpenos de Coffea sppYanagui, Karina; Pereira, Luiz Filipe Protasio [Orientador]; Mondego, Jorge Mauricio Costa; Vilas-Bôas, Laurival AntônioResumo: A utilização de ferramentas biotecnológicas, como os marcadores moleculares, pode acelerar os programas de melhoramento através da seleção assistida por marcadores Para o café, um planta perene, essa característica é particularmente desejável devido ao tempo e recursos despendidos para o lançamento de uma nova cultivar Contudo, para Coffea arabica, a principal espécie de importância econômica do gênero Coffea, o número de marcadores polimórficos disponíveis é muito baixo comparado a outras importantes culturas Muitos estudos foram realizados para tentar acessar a variabilidade da espécie e a despeito de alguns polimorfismos serem encontrados, estes foram pouco eficientes para a discriminação genotípica e mapeamento genético Neste contexto, o presente estudo buscou acessar a diversidade nucleotídica pela detecção de SNPs, em uma população do centro de origem de C arabica onde se espera encontrar a maior diversidade da espécie Foram selecionados oito genes envolvidos na biossíntese de açúcares e diterpenos bem como um gene cloroplastídico e um de álcool desidrogenase (ADH) Fragmentos dos respectivos genes de 12 genótipos de C arabica (oito do centro de origem e quatro comerciais), oito de Coffea canephora e um de Coffea eugenioides foram amplificados e sequenciados O alinhamento das sequências e a detecção manual dos polimorfismos foram realizados pelo programa Codon Code Aligner Como resultado, nove kb foram sequenciados e analisados neste trabalho, possibilitando a detecção de 36 polimorfismos entre C arabica e seus ancestrais, C canephora e C eugenioides Destes, 142 eram polimorfismos intraespecíficos de C arabica: a maioria (82%), como descrito em estudos anteriores, era relacionada a diferenças entre os subgenomas ancestrais Entretanto, 25 SNPs (18% do total) corresponderam a diferenças intraespecíficas, não observadas em C canephora e C eugenioides: 13 destes eram fixados entre os genótipos e 12 mostraram variabilidade entre os genótipos Esses 12 SNPs evidenciam a existência de variabilidade intraespecífica, ainda que em frequência reduzida, que pode ser aplicada para genotipagem e estudos de mapeamento Os resultados demonstram a importância de utilizar genótipos do centro de origem de C arabica para detecção de SNPs e são relevantes para nortear futuros trabalhos de caracterização da variabilidade genética da espécieItem Análise em larga escala de pequenos RNAs derivados de elementos transponíveis em genomas vegetaisLorenzetti, Alan Péricles Rodrigues; Domingues, Douglas Silva [Orientador]; Paschoal, Alexandre Rossi [Coorientador]Resumo: Os elementos transponíveis (TEs) constituem uma grande parte dos genomas eucariotos e desempenham grande importância em sua evolução Esse componente do genoma pode atuar de diversas maneiras, seja inativando genes, alterando a expressão deles, aumentando seu número de cópias, ou até mesmo criando novas sequências nucleotídicas capazes de influenciar no funcionamento do organismo Nesse último caso, sabe-se que os TEs podem originar loci responsáveis pela transcrição de RNAs não codificantes funcionais (ncRNAs), como microRNAs (miRNAs), os quais podem atuar na regulação pós-transcricional de genes Com base nessas informações, os objetivos da primeira parte do trabalho foram a anotação de TEs de 15 genomas vegetais utilizando métodos de busca baseados em similaridade, e a procura por interseções posicionais com precursores de miRNAs anotados Os resultados obtidos permitiram a criação do Plant Transposable Element-related microRNAs Database (PlanTE-MIR DB, disponível em ), que agrega 152 TE-MIRs para 1 espécies vegetais e facilita o acesso às anotações por meio de uma interface amigável, disponibilizando múltiplos formatos de arquivo Boa parte desses loci produtores de pequenos ncRNAs estão relacionados a um tipo específico de TEs: os elementos transponíveis de repetição invertida em miniatura (MITEs, do inglês Miniature Inverted-Repeat Transposable Elements) Visando explorar em maior profundidade essa relação, o objetivo da segunda parte do trabalho foi realizar a busca por pequenos RNAs relacionados aos MITEs no genoma de Coffea canephora A análise revelou que aproximadamente 1,5% do genoma da espécie é composto por MITEs e que a maior parte das inserções está localizada em regiões ricas em genes Além disso, foram encontradas e classificadas 44 famílias relacionadas a pequenos RNAs, sendo pelo menos uma delas representada em ESTs A maior parte dos pequenos RNAs associados a essas famílias são de 24 nt, sugerindo a participação desses elementos na biogênese de siRNAs Esses dados trazem importantes contribuições para a compreensão da evolução genômica em plantas, fornecendo informações sobre a inter-relação entre os seus diversos componentesItem Análise transcricional de genes e validação de marcadores moleculares relacionados à resistência à ferrugem (Hemileia vastatrix) do cafeeiroAriyoshi, Caroline; Pereira, Luiz Filipe Protasio [Orientador]; Tomaz, Juarez Pires; Ribas, Alessandra FerreiraResumo: O Brasil é o principal produtor e exportador mundial de café e possui o segundo maior mercado consumidor Entre os principais objetivos do melhoramento genético de cafeeiros estão os estudos visando resistência de cultivares à ferrugem, doença causada pelo fungo Hemileia vastratix Híbrido de Timor (HDT), uma planta derivada do cruzamento interespecífico natural entre Coffea arabica e Coffea canephora, apresenta resistência à maioria das raças fisiológicas de H vastratix Sendo as progênies de HDT estimadas nos programas de melhoramento Com o objetivo de aumentar e auxiliar o conhecimento sobre os mecanismos de resistência a essa doença, foi feita a caracterização de genes relacionados ao lócus de resistência e também a validação de marcadores moleculares SCARs relacionados à resistência à ferrugem, provenientes de HDT Primeiramente foi verificada a amplificação de genes relacionados à resistência à ferrugem em clones BACs de HDT– CIFC 832/2 Pela técnica de PCR dois genes, NBS-LRR (sinalização) e PR5 (resposta de defesa) foram amplificados no lócus de resistência A análise in silico de um dos BAC também detectou a presença do gene NBS-LRR Através de qPCR a expressão diferencial de NBS-LRR e PR5 foi avaliada nas cultivares resistente IAPAR 59 (com introgressão de HDT) e suscetível Catuaí Vermelho, ambas inoculadas com H vastatrix raça II NBS-LRR e PR5 apresentaram picos de expressão significativamente maiores na cultivar IAPAR 59 72 h após a inoculação Na validação dos marcadores SCARs foram utilizados dois pares de primers que flanqueiam um gene de resistência em uma distância de recombinação menor que 1,6 cM, previamente descritos na literatura Foram avaliados genótipos derivados de IAPAR 59, IPR 99, IPR 97, IPR 98, IPR 14, IPR 17 e de uma geração F4 IAPAR 59 X (Etiópia x Catuaí), provenientes do programa de melhoramento do IAPAR Entre 23 genótipos derivados das cultivares IAPAR 59, IPR 99, IPR 17, IPR 97, IPR 98, IPR 14, somente 1 apresentaram amplificação, e 21 entre 22 amostras de F4 IAPAR 59 X (Etiópia x Catuaí) Os resultados demonstram a possibilidade do uso de Marcadores Moleculares em Seleção Assistida e reforçam a importância dos genes NBS-LRR e PR5 para resistência à ferrugem em cafeeirosItem Estrutura genética de populações de Parapiptadenia rígida (Benth.) Brenan (Leguminosae-Mimosoideae) na região sul do Brasil por marcadores AFLPSouza, Laís Bérgamo de; Ruas, Paulo Maurício [Orientador]; Gaino, Ana Paula Silva Campos; Medri, CristianoResumo: Parapiptadenia rigida é uma espécie arbórea tropical característica de florestas latifoliadas semideciduais Por ser uma espécie agressiva, indiferente às condições físicas do solo e produzir anualmente grande quantidade de sementes, é considerada de grande importância na recuperação de áreas degradadas Sua distribuição ocorre ao longo da Mata Atlântica que, em decorrência da intensa ocupação humana e modificação do bioma, encontra-se bastante fragmentada e desconectada A fragmentação florestal provoca alterações na dinâmica das populações, o que pode levar à perda de diversidade genética Estudos de genética de populações utilizando técnicas de marcadores moleculares permitem avaliar a estrutura e a variabilidade genética de espécies de plantas em áreas fragmentadas Visando contribuir para estratégias de conservação e manejo de espécies arbóreas tropicais este trabalho teve como objetivo estudar, por meio de marcadores AFLP, a diversidade e a estrutura genética de oito populações de P rigida obtidas de fragmentos de mata nos estados do Paraná e Santa Catarina Cinco combinações de primers seletivos renderam um total de 126 fragmentos, todos polimórficos Os valores médios para porcentagem de locos polimórficos (Pp) e para o índice de diversidade gênica (Hs) foram de 6,45% e ,217, respectivamente A análise da Coordenada Principal mostrou que a maioria das populações estudadas apresenta-se estruturada A distribuição da variabilidade genética foi maior dentro das populações (72,2%) que entre as populações (22,8%) de P rigida O padrão de distribuição da variabilidade e estrutura genética moderada na maioria das populações de P rigida sugere que a fragmentação da maioria das populações seja um evento recente que, até o momento, não teve sérias implicações evidentes na redução da variabilidade genéticaItem Seleção de cafeeiros arábicos resistentes à mancha aureolada (Pseudomonas Syringae pv. Garcea)Ito, Dhalton Shiguer; Sera, Tumoru [Orientador]; Yorinori, José Tadashi; Moreira, Rosângela PintoResumo: A cafeicultura brasileira tem sofrido severos danos pela doença mancha aureolada causada pela bactéria Pseudomonas syringae pv garcae, principalmente em regiões cafeeiras mais frias e expostas a ventos É possível o controle químico desta doença, porém, em lavouras adultas, na maioria das vezes, o controle é antieconômico O objetivo deste trabalho foi selecionar cafeeiros com alta produtividade, alto vigor vegetativo e resistentes à P syringae pv garcae em genótipos portadores de genes de resistência à bacteriose originados de germoplasmas resistentes à ferrugem O experimento foi instalado no IAPAR (Londrina) no delineamento em blocos casualizados, com 28 tratamentos, três repetições e dez plantas por parcela A avaliação da resistência em condições de campo em plantas jovens foi realizada em março de 21 e baseada numa escala de notas de 1 a 5, onde: 1 = ausência do sintoma de mancha-aureolada nas folhas e 5 = 45 % a 1 % de folhas lesionadas Além da resistência à bacteriose foram avaliadas as variáveis produção e vigor vegetativo dos cafeeiros O ganho de seleção máximo foi estimado para as progênies com alta produtividade, alto vigor vegetativo e porcentagem de plantas suscetíveis à bacteriose menor do que 5 % Sete progênies F2 resistentes à ferrugem, com mais uma geração de seleção para a produção, poderão aliar alta produtividade, alto vigor vegetativo, além de serem fontes de resistência à Pseudomonas syringae pv garcaeItem Identificação molecular de embriões e larvas de peixes (Teleostei: Osteichthyes) da bacia do médio-baixo rio ParanapanemaSilva, Wilson Frantine da; Almeida, Fernanda Simões de [Orientador]; Morelli, Karina Alessandra; Oliveira, Cláudio de; Sofia, Sílvia Helena [Coorientadora]Resumo: Ações antrópicas têm incidido fortes impactos sobre a ictiofauna, influindo no sucesso reprodutivo destas espécies, e em muitos casos, comprometendo sustentabilidade das populações de peixes Deste modo, avaliar quais espécies completa efetivamente o recrutamento populacional é imprescindível para traçar medidas de conservação eficazes Uma das abordagens mais eficientes para avaliação do processo de recrutamento é quantificação e identificação de ovos e larvas, embora, a identificação de indivíduos em diferentes fases de desenvolvimento seja extremamente complexa Neste contexto, objetiva-se com o presente estudo identificar os produtos reprodutivos de peixes (ovos e larvas) através do uso da metodologia DNA barcoding, relacionando os produtos reprodutivos com suas respectivas espécies no Rio Paranapanema, bacia do alto Rio Paraná Amostragens foram realizadas ao longo do período de maior atividade reprodutiva dos peixes (outubro a fevereiro) entre os anos de 212 e 213, em diferentes pontos da bacia do médio rio Paranapanema Análises de distância genética a partir de sequências do gene CO1 de aproximadamente 648pb possibilitaram a identificação de 99,81% das 536 amostras de ovos (293) e larvas (243) submetidas à análise, resultando em 37 espécies distribuídas em 27 gêneros, 15 famílias e quatro ordens Os tributários da porção lótica do reservatório de Capivara mostraram a maior riqueza de espécies e densidade de ovos, bem como a maior frequência de espécies migradoras A identificação molecular de ovos contribuiu com cerca de 3% da riqueza de espécies, além de indicar a existência de táxons restritos a este tipo de material Os resultados apresentados demonstram a eficiência da abordagem DNA barcoding na identificação molecular do ictioplâncton, fornecendo informações precisas para programas manejo e conservaçãoItem Efeitos da suplementação de ácido fólico na citotoxicidade, proliferação celular e expressão gênica de células MCF-7 tratadas com diferentes agentes mutagênicosXavier, Muriel de Almeida; Mantovani, Mário Sérgio [Orientador]; Vilas-Bôas, Gislayne Fernandes Lemes Trindade; Vicentini, Verônica Elisa PimentaResumo: Os folatos são vitaminas encontradas em diversos alimentos e desempenham importante papel no crescimento celular, síntese de nucleotídeos e reações de metilação Sua deficiência está implicada no desenvolvimento de diversas doenças, porém os efeitos de sua suplementação ainda não são totalmente conhecidos Esse trabalho avaliou os efeitos da alta concentração de ácido fólico (AF) na citotoxicidade, proliferação celular e expressão gênica em células tratadas com diferentes agentes mutagênicos Células MCF-7 foram tratadas com AF e sua associação à doxorrubicina (DXR), camptotecina (CPT) e metil metanossulfonato (MMS) utilizando o Ensaio do MTT, Análise Celular em Tempo Real (RTCA) e PCR em Tempo Real (qPCR) Os resultados do Ensaio do MTT revelaram que o ácido fólico não provocou citotoxicidade e também não interferiu na citotoxicidade causada pelos agentes químicos Pelo RTCA, o AF não interferiu na proliferação celular, tanto isoladamente, quanto em associação aos agentes químicos A expressão de genes de apoptose, ciclo celular, sinalização de danos e receptores de folato não foi alterada no tratamento apenas com AF, contudo, associado à DXR, aumentou a expressão de BAX, BCL-XL, CASP8 (associados a apoptose), e diminuiu BIRC5 (associado a sinalização de danos e ciclo celular) Em associação à CPT, AF aumentou a expressão de BAK, BCL-XL, CASP7, CASP8, CASP9 (associados a apoptose), DDIT3 (sinalização de danos) e também diminuiu BIRC5 (associado a ciclo celular) Em associação ao MMS, o AF aumentou BIRC5 e diminuiu TP53 (associados a ciclo celular) em relação ao tratamento apenas com o indutor, mas não interferiu nos genes associados a apoptose Esses resultados demonstraram que o AF isoladamente não altera a proliferação e morte das células, porém, pode exercer papel adjuvante na eliminação dessas células ou impedir a apoptose quando associado à diferentes quimioterápicos modulando a ação desses agentes Esses efeitos podem influenciar na quimioterapia e quimioprevenção e, consequentemente, na saúde humanaItem Caracterização da expressão de três genes de a-Expansinas de Coffea arabica e Coffea racemosa durante o desenvolvimento do frutoBudzinski, Ilara Gabriela Frasson; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves [Orientador]; Nepomuceno, Alexandre Lima; Pot, DavidResumo: O desenvolvimento dos frutos de café é caracterizado por intensa divisão celular, alongamento e relaxamento da parede celular, processos relacionados à ação de proteínas, incluindo as expansinas, e diferentes enzimas As expansinas são codificadas por uma família multigênica e, com base na similaridade entre as seqüências, podem ser classificadas em quatro famílias: a-expansinas (EXPA), ß-expansinas (EXPB), expansina-like A (EXLA) e expansina-like B (EXLB) As a-expansinas e ß-expansinas têm a capacidade de promover extensão da parede celular; no entanto, as funções biológicas de expansina-like A e expansina-like B ainda não foram identificadas As a-expansinas representam a maior subfamília e atuam no alongamento celular, maciez dos frutos, abscisão, germinação e polinização Deste modo, este trabalho teve por objetivo identificar e caracterizar a expressão de a- expansinas transcritas durante o desenvolvimento e maturação dos frutos de café Através de buscas no banco de dados do Projeto Genoma Café foram selecionadas três a-expansinas com seqüências presentes em bibliotecas de frutos As três isoformas (CaEXPA1, CaEXPA2 e CaEXPA3) têm região codante variando entre 254 e 258 aminoácidos, tamanho similar ao descrito para ORFs (open reading frames) de outros organismos Possuem também peptídeo sinal e domínios específicos de expansinas, um domínio N-terminal com homologia ao domínio catalítico de hidrolases glicosídicas (GH-45) e um domínio C-terminal com homologia ao grupo 2 de alergênicos de grão de pólen Foram feitas análises do padrão transcricional dos genes, em diferentes tecidos de C arabica cv IAPAR-59 (raiz, ramo, folha, botão floral e flor) e frutos de C racemosa, Coffea arabica cv IAPAR-59 e cv IAPAR-59 Graúdo (cultivar caracterizado por possuir frutos grandes) Foi observado para CaEXPA1 e CaEXPA3 maior transcrição em botão floral, tecido onde ocorre intensa divisão celular Já a CaEXPA2 apresentou sinais de hibridização em raízes e em ramos plagiotrópicos jovens e maduros Visando estudar mais detalhadamente as diferenças espaciais e temporais na transcrição das três isoformas selecionadas, frutos coletados mensalmente da antese até a maturação tiveram seus tecidos (pericarpo, perisperma e endosperma) separados Deste modo foram realizadas análises de Northern blot com amostras dos diferentes tecidos do cafeeiro, do fruto inteiro, pericarpo, perisperma e endosperma Quando hibridizados com membranas contendo RNA de C racemosa as três isoformas apresentaram padrão transcricional semelhante com sinais de hibridização detectados somente em pericarpo Em C arabica, a isoforma CaEXPA1 mostrou alta transcrição no perisperma (tecido responsável pela definição do tamanho do grão do café) As diferenças observadas entre os padrões de transcrição no perisperma de IAPAR-59 e de IAPAR-59 Graúdo sugerem a participação de CaEXPA1 na regulação do tamanho do grão de café Por outro lado, a isoforma CaEXPA2 mostrou transcrição específica em pericarpo nos estádios finais de maturação do fruto, o que sugere que esta isoforma pode estar envolvida na despolimerização da parede celular e, conseqüentemente, no controle da maturação do pericarpo Para CaEXPA3, o padrão de transcrição foi similar ao encontrado para CaEXPA1; no entanto, baseado no padrão de transcritos observados, esta isoforma parece estar mais envolvida nos processos fisiológicos de relaxamento da parede relacionados com a maturação dos frutosItem Caracterização morfológica e molecular de acessos de Capsicum baccatum LCardoso, Rafaella; Ruas, Claudete de Fátima [Orientador]; Nunes, Maria Paula Barion Alves; Ruas, Eduardo Augusto; Gonçalves, Leandro Simões Azeredo [Coorientador]Resumo: Capsicum baccatum L, tendo o seu centro de origem na Bolívia e no sul do Peru, é considerada uma das principais pimentas da América do Sul No Brasil, essa espécie é amplamente produzida por agricultores familiares, sendo os tipos cambuci e dedo-de-moça os mais cultivados Essa espécie de pimenta é geralmente consumida in natura ou processadas na forma de pós ou extratos O presente trabalho teve como objetivo a caracterização de 79 acessos de C baccatum, provenientes de diferentes regiões do Brasil, por meio de descritores morfoagronômicos do fruto e de marcadores moleculares de AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphisms) O uso de quinze descritores, sendo onze qualitativos e quatro quantitativos, empregados para a caracterização morfológica, identificou uma ampla variabilidade fenotípica entre os acessos de C baccatum avaliados A análise dos dados, usando o método de Ward-MLM, resultou na formação de dois grupos, sendo o formato e o comprimento do fruto, essenciais para esta separação Para a análise molecular, o DNA dos acessos foi amplificado usando seis combinações de primers seletivos de AFLP marcados com fluorescência A análise dos produtos amplificados por AFLP identificou um total de 12 bandas, das quais 1122 (93,5%) foram polimórficas O dendrograma gerado por do coeficiente de distância genética de Jaccard, a partir do método de agrupamento UPGMA, identificou a formação de dois grupos, sendo possível a separação da variedade silvestre C baccatum var praetermissum das demais Estes resultados corroboram com a análise de coordenada principal (PCoA) e com a análise Bayesiana de agrupamentos Não houve relação entre distância genética e origem geográfica dos acessos, provavelmente, devido à intensa troca de frutos e sementes entre agricultores Os descritores morfoagronômicos, usados concomitantemente com os marcadores AFLP, se mostraram eficientes para detectar altos níveis de variabilidade genética entre acessos mantidos na coleção de germoplasma analisada Esses resultados podem ser utilizados como uma fonte adicional de informações para auxiliar na condução de programas de melhoramento genético de C baccatum