01 - Doutorado - Fisiopatologia Clínica e Laboratorial

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    Avaliação das variantes rs231775 e rs231779 do gene CTLA4 em pacientes com carcinoma urotelial de bexiga
    (2023-09-20) Koike, Alexsandro; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Reiche, Edna Maria Vissoci; Rodrigues, Marco Aurélio de Freitas; Amarante, Marla Karine; Guembarovski, Roberta Losi; Simão, Andréa Name Colado
    INTRODUÇÃO: O câncer de bexiga é o 10º tumor mais incidente e o 13º mais letal no mundo. O carcinoma urotelial de bexiga (CUB) é o tipo histológico mais freqüente, correspondendo a 90% dos casos. A quantidade de mutações somáticas de uma determinada sequência genômica de um tumor (TMB) comparada ao tecido normal varia em cada tipo de tumor. Os tumores com maiores TMB são o melanoma, seguido do carcinoma de não pequenas células do pulmão e o CUB. Esses tumores tendem a responder melhor ao tratamento imunoterápico. São exemplos de imunoterápicos, as drogas inibidoras de proteínas de ponto de checagem: a anti-proteína de morte programada-1(anti-PD-1); o anti-ligante da proteína de morte programada-1(PD-L1) e o anti-antígeno 4 do linfócito T-citotóxico (anti-CTLA-4). Esses imunoterápicos revolucionaram o tratamento do câncer nos últimos 10 anos. A maior ou menor expressão dessas proteínas na célula tumoral e nos linfócitos estão relacionadas ao prognóstico e resposta ao tratamento, sendo utilizados, também, como biomarcadores de resposta terapêutica. Entretanto, no CUB, parte dos biomarcadores disponíveis muitas vezes falha ao aferir o prognóstico e a eficácia do tratamento a ser realizado. O melhor entendimento dos efeitos das variantes genéticas de citocinas e da expressão de proteínas de ponto de checagem poderia servir como biomarcador do diagnóstico, prognóstico e/ou da decisão do tratamento. OBJETIVO: Buscar um melhor entendimento das diferentes variantes genéticas de citocinas relacionadas ao CUB, avaliar a frequência de 2 variantes genéticas do CTLA4 rs231775(+49AG) e rs231779(+1822CT) e relacionar com suscetibilidade e fatores prognósticos como o estadiamento da doença e a presença de metástases. SUJEITOS E MÉTODOS: Foi realizada uma revisão da literatura de variantes genéticas de citocinas relacionadas ao CUB seguindo as normas para revisões sistemáticas e meta-análises (PRISMA). Também foi realizado um estudo caso-controle, no qual foram selecionados 140 pacientes com diagnóstico de CUB submetidos a cirurgia, recrutados pelo Ambulatório de Urologia do Hospital do Câncer de Londrina, além de 145 indivíduos controle, provenientes de doadores de sangue do Hemocentro Regional de Londrina (CAAE: 17084619.2.0000.5231). Os dados clínicos foram obtidos por questionário aplicado a todos os participantes. Foram avaliadas as variantes genéticas do gene CTLA4(rs231775 e rs231779) por metodologia de reação em cadeia de polimerase em tempo real com sondas específicas tipo TaqMan®. RESULTADOS: Na revisão da literatura, encontramos 36 estudos caso-controle de variantes de citocinas relacionadas ao CUB. As variantes genéticas de IL27(rs153109), IL6(rs1800795), IFNG(rs62559044), IL2(rs2069762) e IL12(rs3212227), cujas expressões dessas variantes tendem a diminuir a produção dessas citocinas, mostraram aumento de risco e recorrência ao CUB. As variantes genéticas de TNFA(rs1800629, rs1799724 e rs1799964), IL22(rs2227485), IL31(rs4758680), IL32(rs12934561 e rs28372698), TGFB(rs1800470 e rs1800471), TGFBR1(rs868), IL4(rs2243248 e rs2243250), IL8(rs4073), IL10(rs1800896 e rs1800871), IL17(rs2275913, rs763780), IL23R(rs10889677 e rs188444), IL18(rs187283 e rs1946518) e IL13(rs1800925), cujas expressões dessas variantes tendem a elevar a produção dessas citocinas, mostraram aumento ao risco, da recorrência e da progressão tumoral ao CUB. As variantes genéticas do IL1(rs1143634 e rs16944), estudadas em 2 artigos, mostraram resultados divergentes em relação ao risco ao CUB. Em relação ao nosso estudo caso-controle realizado, verificamos que os genótipos heterozigotos no modelo overdominante do CTLA4 rs231775(+49AG) e rs231779(+1822CT) apresentaram diferenças significativas como fator protetor ao CUB. O genótipo codominante heterozigoto rs231779(+1822CT) também se mostrou como fator protetor ao CUB. Não identificamos diferenças estatísticas em relação a invasividade da camada muscular, da presença de metástases, do grupo de risco, da falha ao tratamento com o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) e da recorrência pós primeiro tratamento cirúrgico. O modelo de regressão logística utilizado na comparação entre indivíduos controle e CUB demonstrou que os genótipos homozigóticos das duas variantes, associados a idade e o tabagismo foram preditores da doença, explicando em 89,1% a presença do CUB. CONCLUSÃO: Os estudos das diversas variantes genéticas de citocinas demonstram que sua expressão no CUB apresenta uma ampla gama de resultados, nem sempre intuitiva, possivelmente justificada pelo pleiotropismo da ação das citocinas no sistema imune e no momento a qual suas ações interferem na carcinogênese do CUB. No estudo caso-controle realizado, propomos que os modelos polimórficos overdominantes do CTLA4 (rs231775 e rs231779), em conjunto com idade e tabagismo, podem servir como potenciais biomarcadores de suscetibilidade ao risco do CUB. As variantes genéticas do CTLA4 no CUB são pouco compreendidas e sua relação ainda há de ser esclarecida, necessitando de mais estudos para sua melhor compreensão.
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    Mecanismos antiproliferativos do tratamento in vitro com trans-chalcona em linhagens de carcinoma cervical humano
    (2023-09-28) Siqueira, Elaine da Silva; Panis, Carolina; Amarante, Marla Karine; Mantovani, Mário Sérgio; Oliveira, Karen Brajão de; Victorino, Vanessa Jacob
    Moléculas derivadas de plantas medicinais tem sido fonte de pesquisa para novas terapias antineoplásicas como monoterapia ou terapia adjuvante. Neste estudo, investigamos o impacto do tratamento com trans-chalcona (TC) sobre duas linhagens celulares de diferentes tipos histológicos de carcinoma cervical, com destaque para o adenocarcinoma (HeLa) e carcinoma de células escamosas (SiHa). As linhagens foram tratadas com concentrações crescentes de trans-chalcona (6,25 - 100 µM) e a concentração inibitória de 50% das células (IC50) foi determinada em 28 µM (HeLa) e 23 µM (SiHa) em 24 horas. Para avaliar os mecanismos de ação envolvidos foram realizados ensaios para determinar a viabilidade celular por 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) e azul de tripan, microscopia de varredura (MEV) e transmissão (MET) para constatar alterações morfológicas e ultraestruturais, bem como os possíveis mecanismos de morte envolvidos e análises de estresse oxidativo, que incluíram a avaliação do perfil de despolarização mitocondrial, dosagem dos níveis de hidroperóxidos , determinação da capacidade antioxidante, dosagem dos metabólitos do óxido nítrico e avaliação dos perfis dos fatores de transcrição reguladores do balanço redox NRF2 e NFkB, realizados por marcação com tetrametilrodamina-etil-éster (TMRE), terc-butil hidroperóxido, parâmetro antioxidante total de captura de radicais (TRAP), diclorofluoresceína (DCF) e imunofluorescência, respectivamente. Observamos que o tratamento com TC em linhagens HeLa e SiHa de carcinoma cervical foi capaz de promover a redução da viabilidade celular, induzir alterações morfológicas e ultraestruturais com inibição da capacidade de migração do tecido nas duas linhagens. Posteriormente, descobrimos que o tratamento com TC foi capaz de promover despolarização mitocondrial, induzir a formação de gotículas lipídicas e vacúolos autofágicos com consequente morte celular por apoptose tardia. A TC também induziu a geração de estresse oxidativo observada pelo aumento da geração de hidroperóxidos na linhagem Hela e diminuição em SiHa. Houve ainda redução na produção dos metabólitos do NOx em ambos modelos avaliados. Concomitantemente, observamos superexpressão de NRF2 e diminuição da regulação do NF?B em células HeLa, enquanto na linhagem SiHa houve apenas estímulo de NF?B. Estes achados sugerem que a TC exerce seu efeito antiproliferativo no câncer cervical a partir da redução significativa da viabilidade das células HeLa e SiHa em todos os tempos testados (p=0,0001), indução de atividade citostática e geração de estresse oxidativo via distintos mecanismos de acordo com a origem e tecido acometido, tornando-se uma alternativa terapêutica promissora no desenvolvimento de compostos antitumorais frente ao carcinoma cervical.
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    Avaliação dos efeitos da variante genética MTHFR 677c>T (rs1801133) sobre a suscetibilidade à esclerose múltipla, incapacidade por agravamento e progressão da doença
    (2024-04-18) Ribeiro, Claudia Mara; Reiche, Edna Maria Vissoci; Maciel, Damacio Ramon Kaimen; Oliveira, Karen Brajão de; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Luz, Tamires Flauzino; Oliveira, Sayonara Rangel
    Introdução: Vários mecanismos fisiopatológicos estão envolvidos na patogênese da esclerose múltipla (EM), entre eles a elevação dos níveis da homocisteína (Hcy). Variantes no gene MTHFR associadas ao aumento da Hcy são descritas; no entanto, os resultados são conflitantes sobre seu papel na fisiopatologia da EM. Objetivos: Realizar uma revisão da literatura sobre a relação entre a variante genética MTHFR 677C>T, níveis de Hcy, vitamina B12 e folato e sua associação com a suscetibilidade e fisiopatologia da EM; avaliar os efeitos da variante genética MTHFR 677C>T (rs1801133) sobre a suscetibilidade, incapacidade e progressão da doença. Métodos: Na revisão da literatura, utilizou-se as bases de dados PubMed/US National Library of Medicine/USA para a busca de artigos originais publicados no idioma Português e Inglês, no período de 1990 a 2023. Realizou-se, também, um estudo caso-controle em que foram avaliados 163 pacientes com EM e 226 indivíduos controles. O grau de incapacidade dos pacientes foi avaliado pela Escala Expandida do Estado de Incapacidade (EDSS) e a progressão da doença foi avaliada pela escala Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS). A genotipagem da variante MTHFR 677C>T foi realizada pela reação em cadeia da polimerase em tempo real. Foram avaliados os valores plasmáticos de marcadores inflamatórios como a proteína C reativa (PCR), interleucina (IL)2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, interferon (IFN)-?, fator de necrose tumoral (TNF)-a e seus receptores solúveis (sTNFR1 e sTNFR2) e marcadores metabólicos como homocisteína, folato, 25 hidroxivitamina D [25(OH)D] e adiponectina. Dois novos escores foram propostos: índice de atividade inflamatória (IAI) composto pelos valores de citocinas de macrófagos M1 (IL-6 e TNF-a) + citocinas Th1 (IL-2 e IFN-?) + citocinas Th17 (IL-6 e IL-17) e citocinas regulatórias Th2 +T regulatórias (IL-4 e IL-10) e TNF-a+sTNFR1+sTNFR2; índice de gravidade da EM composto por o diagnóstico da EM + EDSS + MSSS. Resultados: No artigo 1, foram selecionados 30 estudos que avaliaram a associação dos níveis de Hcy, folato e vitamina B12 entre os pacientes com EM e indivíduos saudáveis. Os principais resultados encontrados foram: 18 estudos descreveram valores elevados de Hcy em pacientes com EM comparados aos controles; em relação aos valores de folato, 3 estudos mostraram diminuição e 1 estudo mostrou aumento nos pacientes com EM comparados aos controles. Em relação aos valores de vitamina B12, 8 estudos os valores foram menores nos pacientes comparados aos controles. Quando avaliada a possível associação entre a variante genética MTHFR 677C>T e a EM, foram selecionados 11 estudos realizados em diferentes populações; 5 artigos mostraram associação e 6 apresentaram resultados discordantes. No artigo 2, os resultados mostraram que a variante genética MTHFR 677 C>T não foi associada com a suscetibilidade à EM, incapacidade por agravamento e progressão da incapacidade (p>0,05); 21,8% da variação da incapacidade foi explicada pela idade, IAI e PCR (todos positivamente associados); 54,4% da variação do índice de gravidade foi devido a idade, IAI, Hcy, folato e PCR (todos positivamente) e adiponectina, sexo masculino, índice de massa corporal variante MTHFR 677 C>T no modelo recessivo e 25(OH)D (todos negativamente). Em pacientes e controles, 16,6% da variação nos valores de Hcy foram explicados pelo genótipo em homozigose (TT) da variante do MTHFR, sexo masculino e idade (positivamente associados) e folato (negativamente associado). Conclusão: Pelo artigo 1 verificou-se que os valores de Hcy foram mais consistentemente elevados em pacientes com EM, enquanto os níveis de folato e vitamina B12 foram conflitantes. Em relação à associação entre a variante genética MTHFR 677C>T e EM em populações distintas, 5 estudos mostraram associação, enquanto 6 estudos mostraram resultados discordantes, portanto, há necessidade de mais estudos em outras populações. No artigo 2, os resultados mostraram que não houve associação entre os genótipos da variante 677 C>T do MTHFR e a EM, incapacidade por agravamento e progressão da doença; no entanto, o genótipo TT desta variante mostrou efeitos indiretos sobre a suscetibilidade à EM e agravamento da incapacidade, e estes efeitos seriam mediados pela Hcy
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    Impacto da fase de indução da quimioterapia no perfil de mediadores inflamatórios sistêmicos e do microambiente tumoral na leucemia linfocítica aguda da infância
    Oliveira, Geise Ellen Broto; Panis, Carolina [Orientador]; Venturini, Daniele; Amarante, Marla Karine; Victorino, Vanessa Jacob; Tomiotto-Pellissier, Fernanda
    Resumo: A leucemia linfocítica aguda (LLA) é a principal neoplasia da infância cujo tratamento se baseia na poliquimioterapia dividida em fases (indução, consolidação e manutenção) A indução consiste em uma etapa determinante para o bom prognóstico dos pacientes portadores de LLA e no uso intensivo de drogas antineoplásicas combinadas no período de 28 dias, escalonados do dia (D - ao diagnóstico), ao dia 28 (D28 - final da fase de indução) Apesar do bom prognóstico da doença, com taxas de cura superiores a 8%, pouco se sabe sobre o impacto do tratamento no perfil de mediadores moleculares da inflamação, um hallmark do câncer descrito como determinante do comportamento biológico dos tumores A importância das proteínas e metabólitos produzidos na resposta inflamatória, como citocinas e mediadores do estresse oxidativo, tem sido discutida tanto no funcionamento normal da medula óssea, como na resposta à invasão medular pelos clones malignos Apesar disso, pouco se sabe sobre o impacto do tratamento quimioterápico sobre a dinâmica destes mediadores e de que forma isso pode influenciar tanto a resposta ao tratamento, como a imunopatogênese da LLA Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto da quimioterapia na fase de indução do tratamento da LLA sobre o perfil de mediadores inflamatórios produzidos sistemicamente e no microambiente tumoral em amostras de sangue de pacientes pediátricos diagnosticados com LLA do tipo B (LLA-B), comparando-se os perfis em D e D28 Para alcançar este objetivo, este estudo foi dividido em 2 etapas A primeira parte teve como objetivo traçar o perfil proteômico sistêmico e tumoral de amostras de sangue periférico (SP) e de medula óssea (MO) coletadas em D e D28, e validar possíveis proteínas de interesse ou vias de sinalização pouco conhecidas na LLA-B Na segunda etapa, avaliou-se o perfil de estresse oxidativo e de citocinas em amostras de SP e MO de pacientes com LLA-B também em D e D28 O estudo encontra-se cadastrado na Plataforma Brasil sob o número CAAE 244982135231 e foi aprovado pelo comitê de Ética Institucional Para ambas as etapas, foram recrutados 17 pacientes pediátricos atendidos no Instituto de Câncer de Londrina, entre setembro de 214 a dezembro de 216, com diagnóstico confirmado clínica e laboratorialmente para LLA-B, submetidos ao mesmo protocolo de tratamento Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido pelos responsáveis, e assentimento dos pacientes, foram coletadas amostras anticoaguladas de SP (5mL) e aspirado de MO (2 a 3 mL) em D e D28 As amostras foram centrifugadas para obtenção de plasma, onde foram realizadas as seguintes análises: investigação do perfil diferencial de proteínas por espectrometria de massa label-free, dosagem dos níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) e interferon gama (IFN-?) por enzimaimunoensaio (ELISA), dosagem de transtiretina por ensaio imunoturbidimétrico, determinação dos níveis dos metabólitos do óxido nítrico pela técnica de Cádmio-Cobre-Griess (NOx), determinação do conteúdo de grupos sulfidrila de proteínas (SH) baseado na reação do ácido 5,5-ditiobis-2 nitrobenzóico, determinação da capacidade antioxidante total plasmática (TRAP) e mensuração dos níveis de hidroperóxidos lipídicos por quimioluminescência Dados clínicos foram obtidos de consultas aos prontuários médicos e incluíram idade e peso ao diagnóstico, perfil do hemograma, acometimento de sistema nervoso central e testicular, dados de mielograma e avaliações sobre a presença de doença residual mínima (DRM) ao final do tratamento de indução Os dados obtidos foram analisados no software GraphPad Prism 7 (USA) e foi adotado o valor de p<,5 como significante Em relação ao estudo proteômico, em D o SP x MO, foi caracterizado como um ambiente pró-inflamatório, com a expressão das proteínas de coagulação cininogênio (KNG), plasmina e plasminogênio downreguladas D28 foi caracterizado pelos processos relacionados à resposta imunológica e a super expressão do IRF3 (activation of Interferon Regulatory Factor 3) e da proteína transtiretina O fator de transcrição da proteína leucemia mielóide aguda 1 (RUNX1) foi apontado como fator de transcrição comum tanto em D como em D28 As proteínas transtiretina e IFN-? foram validadas nas amostras e se mostraram aumentadas e diminuídas, respectivamente, em D28 Sobre o perfil de citocinas e de estresse oxidativo, observou-se que no D28 os níveis de TNF-a estavam aumentados no SP, enquanto que o IFN-? aumentou de modo significante apenas na MO Os hidroperóxidos aumentaram em D28 no SP de pacientes com DRM positiva Os resultados obtidos em ambos estudos permitem concluir que a transtiretina e IFN-? desempenham um papel importante nos mecanismos de resolução da LLA-B, e que os níveis de hidroperóxidos podem variar ao longo do tratamento de LLA na presença da DRM