01 - Doutorado - Ciência Animal
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Navegando 01 - Doutorado - Ciência Animal por Autor "Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]"
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Item Análise molecular de cepas incomuns de rotavírus suíno grupo ALorenzetti, Elis; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Vilas-Bôas, Laurival Antônio; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Lunardi, Michele; Headley, Selwyn ArlingtonResumo: A diarreia neonatal é um dos principais problemas sanitários que acomete leitões em todo o mundo Em sistemas intensivos de produção o rotavírus suíno grupo A (RVA) é uma das principais etiologias de diarreia em leitões lactentes e recém-desmamados A caracterização dos genotipos das cepas de RVA detectadas em surtos de diarreia é de grande importância para a identificação de novos genotipos virais, para a análise da diversidade genética, identificação de eventos de ressortimento e transmissão interespécies O objetivo deste estudo foi realizar análises filogenéticas em três cepas de RVA identificadas em fezes diarreicas de leitões As duas cepas virais do primeiro estudo (BRA381 e BRA382) foram selecionadas durante um estudo retrospectivo de genotipagem realizado em amostras fecais diarreicas positivas para o RVA pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida, por apresentarem resultados negativos em testes de genotipagem utilizando primers genotipo-específico para os principais protótipos de RVA de origem humana e animal (bovino e suíno) A cepa viral do segundo estudo (BRA843) foi selecionada para a análise de todos os genes por ser uma cepa G4P[6] diferente do protótipo suíno, a cepa Gottfried No primeiro estudo os produtos da RT-PCR dos genes VP7 (G) e VP4 (P) foram sequenciados e a análise filogenética possibilitou a identificação do genotipo G26P[13] e G26P[X] nas cepas BRA381 e BRA382, respectivamente G26 é um genotipo raro que, até então, somente havia sido identificado em cepas de RVA suíno da Ásia (Japão e China) e, possivelmente, em uma cepa de origem humana da Tailândia O genotipo P[13] é o terceiro genotipo mais comum em RVA suíno, porém a associação G26P[13] ainda não havia sido descrita em cepas de RVA em todo o mundo No segundo estudo, a análise dos 11 genes de uma cepa (BRA843) de RVA suíno G4-IX P[6]-If, anteriormente caracterizada como distinta do protótipo G4P[6] (Gottfried) de origem suína, revelou estreita relação com cepas de RVA detectadas em suínos e também com cepas detectadas em humanos e animais provenientes de ressortimento com cepas suínas Estas características sugerem que a cepa BRA843 seja de origem suína A constelação de genotipos (G4-P[6]-I5-R1-C1-M1-A8-C1-T7-E1-H1) identificada nesta cepa brasileira de RVA suíno tem estrutura Wa-like com genotipos comumente detectados em cepas de RVA de origem suína O genotipo T7 é um genotipo raro que foi primeiramente descrito na cepa de RVA UK (protótipo) de origem bovina Posteriormente, o genotipo T7 foi relatado em cepas de RVA de humanos provenientes de ressortimento com cepas suínas e bovinas Recentemente, o genotipo T7 foi também identificado em cepas de RVA suíno reforçando a origem suína deste genotipo No Brasil, este é o primeiro estudo com análise de todos os genes de uma cepa suína de RVA G4P[6], bem como a primeira descrição de uma cepa G4P[6] suína detectada em um hospedeiro suíno carreando o genotipo T7 Os dois estudos revelaram a complexidade de genotipos de RVA circulantes em rebanhos suínos brasileiros, bem como a importância da análise de todos os genes para a compreensão dos mecanismos de evolução das cepas de rotavírus e o papel dos suínos como reservatórios de uma constelação de genotipos de RVA passíveis de infectar tanto animais quanto humanosItem Aspectos clínicos e moleculares de infecções sintomáticas por kobuvirus em animaisRibeiro, Juliane; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Claus, Marlise Pompeo; Headley, Selwyn Arlington; Lorenzetti, Elis; Crhyssafidis, Andréas LázarosResumo: O gênero Kobuvirus, membro da família Picornaviridae, é dividido em seis espécies Aichivirus A a F O segmento 3D do genoma do Kobuvirus é uma região conservada, que codifica a enzima RNA polimerase dependente de RNA (RdRP), que é amplamente utilizada para o diagnóstico do vírus A região genômica que codifica a proteína VP1 do capsídeo viral, região mais variável, é utilizada para estudos filogenéticos em cepas de campo de kobuvírus Kobuvírus tem sido relacionado à diarreia, principalmente em animais jovens e a infecção por kobuvírus ainda é pouco descrita em animais no Brasil O objetivo deste estudo foi avaliar características da infecção em duas espécies animais sendo um animal de produção e outro de estimação O primeiro estudo descreve o envolvimento do kobuvírus (Aichivirus B) em um surto de diarreia em bezerros de um rebanho leiteiro de alta produção Vinte e quatro amostras fecais diarreicas de bezerros com até 3 dias de idade foram coletadas para análise virológica Cinco amostras fecais de bezerros assintomáticos foram incluídas nas análises como grupo controle Utilizando ensaios de RT-PCR, o aichivírus B foi detectado em 54,2% (13/24) e rotavírus A G1P[11] em 25% (6/24) das amostras fecais diarreicas avaliadas Os bezerros assintomáticos foram negativos para ambos os vírus Aichivírus B foi identificado apenas em bezerros com até duas semanas de idade com 83,3% (1/12) das amostras positivas A análise filogenética baseada no gene RdRP agrupou as cepas brasileiras em um novo ramo no cluster Aichivirus B A análise das sequências de nucleotídeos do gene VP1 das cepas brasileiras e chinesas de Aichivirus B permitiu classificar as cepas brasileiras avaliadas na recém proposta, linhagem 1 (genotipo A) Este é o primeiro relato de alta taxa de detecção de aichivírus B em um surto de diarreia em bezerros leiteiros e também o primeiro estudo filogenético com base no gene VP1 realizado com cepas de campo de Aichivirus B identificadas na América do Sul O segundo estudo descreve a detecção extra-intestinal de kobuvírus canino (CaKV) em um filhote de Chihuahua de 5 meses de idade com histórico clínico de fezes com sangue de morte natural Fragmentos de tecido foram submetidos à técnica de histopatologia e imuno-histoquímica (IHC) para identificar antígenos do vírus da cinomose (CDV), parvovírus canino tipo 2 (CPV-2) e adenovírus canino tipos 1 e 2 (CAdV-1 e 2) As técnicas de PCR e RT-PCR foram utilizadas para amplificar genes específicos de CaKV, CDV, CPV-2, CAdV-1 e -2 e herpesvírus canino tipo 1 (CaHV-1) Fragmentos de intestino e amostras de fezes foram avaliados para identificar a presença de rotavírus As principais alterações patológicas encontradas foram peneumonia intersticial, bronquite necrosante, miocardite, enterite e depleção linfóide A RT-PCR detectou CaKV no cerebelo, cérebro, pulmão, tonsila e fígado Neste estudo, também foram identificadas infecções mistas de CaKV com CDV e CPV-2 com CaHV-1 CaKV e rotavírus não foram identificados nas fezes e intestino Os ensaios IHC detectaram antígenos de CDV e CAdV-1 em regiões distintas dos pulmões A análise filogenética da cepa de CaKV identificada neste estudo revelou semelhança com cepas detectadas em outros países Os resultados evidenciam a primeira detecção extra-intestinal de CaKV em tecidos em associação com infecções mistas com outros vírus comumente encontrados em cães e a primeira detecção extra-intestinal de CaKV em um cão Os resultados obtidos nesse estudo adicionaram novos conhecimentos sobre aspectos clínicos e moleculares da infecção por kobuvírus em animaisItem Caracterização genética de um novo membro do gênero Deltapapillomavirus (Papilomavírus bovino tipo 13) identificado em lesões epiteliais de bovinos e equinosLunardi, Michele; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Araújo Junior, João Pessoa; Heinemann, Marcos Bryan; Vilas-Bôas, Laurival Antônio; Headley, Selwyn ArlingtonResumo: O papilomavírus (PV) pertence a um grupo muito diversificado de vírus que infecta grande variedade de espécies de vertebrados O PV está relacionado com proliferações da pele e mucosa de seus hospedeiros Em bovinos, o papilomavírus bovino (BPV) é o agente etiológico da papilomatose cutânea e dos cânceres da bexiga urinária e do trato gastrointestinal superior Nos equinos, os sarcóides são neoplasias fibroblásticas locais com característica agressiva, reconhecidas como o tumor de pele mais comum em equinos de todo o mundo Os sarcóides raramente regridem e, frequentemente, recorrem após a terapia Pela identificação sucessiva do DNA do BPV em sarcóides, e a demonstração da expressão de diversos genes virais nestas lesões, o envolvimento direto do BPV na patogênese do sarcóide foi corroborado Atualmente, doze tipos de BPV foram identificados e caracterizados em bovinos Estes BPVs estão classificados nos gêneros Deltapapillomavirus (BPV1 e 2), Xipapillomavirus (BPV3, 4, 6, 9, 1, 11, e 12) e Epsilonpapillomavirus (BPV5 e 8), com a exceção do BPV7 que pertence a um gênero ainda indefinido Além dos tipos de BPV caracterizados por meio da sequência completa do genoma viral, dezenas de prováveis novos tipos virais, identificados por meio de PCR com primers degenerados que amplificam fragmentos parciais do gene L1, têm sido descritos em rebanhos bovinos provenientes de regiões geográficas diversas Recentemente, estudos realizados no Brasil revelaram notável diversidade entre os BPVs detectados em papilomas bovinos, sendo descritos quatro prováveis novos tipos virais que foram designados BPV/BR-UEL2 a BPV/BR-UEL5 O presente estudo descreve a sequência genômica completa e o posicionamento filogenético de um destes novos tipos de BPV (BPV/BR-UEL4) identificado em bovinos e tentativamente denominado de papilomavírus bovino tipo 13 Adicionalmente, o envolvimento deste novo tipo de BPV em sarcóides equinos também é relatado Em cavalos, seis sarcóides que foram coletados cirurgicamente, a partir de várias regiões anatômicas de dois cavalos, foram avaliados com oito pares de primers degenerados Estes primers foram desenhados para detectar regiões conservadas dos genes L1 e E1 dos PVs cutâneos Os produtos de PCR obtidos foram sequenciados diretamente Nos sarcóides avaliados, as quatro sequências geradas dos produtos de PCR apresentaram 1% de identidade com o BPV13 O BPV13 foi identificado em um papilomas localizado na orelha de bovino pertencente a um rebanho da região sul do Brasil Para amplificar a sequência completa do genoma do BPV13, a amostra de DNA foi submetida à técnica de amplificação por círculo rolante (RCA) Para confirmar que o produto obtido era DNA de papilomavírus, PCR com primers degenerados foi realizada no produto RCA Estes produtos de PCR foram sequenciados e, baseando-se nestas sequências parciais dos genes E1 e L1, dois pares de primers para PCR de fragmentos longos foram selecionados para a amplificação da maior parte do genoma do BPV13 A sequência completa dos fragmentos longos clonados foi determinada por sequenciamento contíguo, iniciando-se a partir do sítio para os primers universais no vetor de clonagem pCR4-TOPO As falhas remanescentes nas sequências foram eliminadas por sequenciamento direto do produto RCA A sequência genômica completa do BPV13 possue 7961 pb, com conteúdo GC de 45,1%, e oito ORFs, codificando para seis proteínas não-estruturais (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) e duas proteínas estruturais (L1 e L2) A análise filogenética, realizada a partir do alinhamento de sequência de nucleotídeos concatenada dos genes E7, E1, E2, L2 e L1 do BPV13 e de outros PVs de ungulados, mostrou que o BPV13 é um membro do gênero Deltapapillomavirus, que já contém os BPVs 1 e 2 A sequência do gene L1 do BPV13 apresentou identidade de 85,5-88,2% com as mesmas sequências dos BPVs 1 e 2 A identificação do BPV13 nos sarcóides examinados sugere a possibilidade de que muitos PVs isolados de sarcóides, e que foram previamente diagnosticados por meio de PCR com primers específicos para o BPV1/2, podem ter sido classificados erroneamente como BPV2, especialmente devido ao fato do sequenciamento direto não ter sido realizado para muitas amostras Assim como o relatado para os BPVs 1 e 2, é tentador sugerir que o BPV13 também é capaz de induzir fibropapilomas em seus hospedeiros naturais O agrupamento do BPV13 no gênero Deltapapillomavirus, o qual reune PVs que determinam fibropapilomas em artiodactilos ruminantes, assim como os achados da presença do gene E5 e da perda do motivo de ligação do fator pRB na proteína E7, dão suporte a esta hipótese Os PVs são espécie-específicos e a ocorrência de transmissão entre espécies é relatada como evento muito raro, somente ocorrendo entre espécies hospedeiras próximas, como a infecção de cavalos pelos BPVs 1 e 2 Assim como os outros representantes da espécie Delta4, este novo tipo viral foi identificado em associação com casos de sarcóide equino em rebanhos brasileiros A caracterização de novos BPVs colabora para a compreensão da filogenia do PV e para a interpretação das enfermidades relacionadas a estes vírus A obtenção de informações adicionais sobre a base molecular e epidemiologia dos BPVs caracterizados, assim como dos ainda não caracterizados, será necessária para a completa compreensão da patogenia das doenças associadas ao BPVItem Circovírus suíno 3 e Mycoplasma hyopneumoniae em suínos asselvajados na região dos Campos Gerais, Paraná, BrasilSouza, Tatiana Carolina Gomes Dutra de; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Agnol, Alaís Maria Dall; Gava, Danielle; Brum, Juliana Sperotto; Donin, Daiane GüllichResumo: Circovírus suíno 3 (PCV-3) é um vírus emergente na produção de suínos e Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) é considerado um dos patógenos respiratórios mais importantes na suinocultura mundial Em todo o mundo há poucos trabalhos que avaliam a prevalência destes microrganismos em suínos asselvajados Considerando as diferentes classes e características dos microrganimos avaliados, serão apresentados dois estudos: o primeiro aborda a investigação sobre a infecção por PCV-3 em suínos asselvajados de vida livre e o segundo sobre a infecção por Mhyo na mesma amostragem Os animais foram manejados por controladores autorizados, entre 217 e 219 no estado do Paraná, Brasil, e georreferenciamento, sexo e peso foram registrados para cada animal No primeiro estudo, amplicons com tamanho de 33 pb foram obtidos por PCR convencional em 7/7 (1,%) amostras de soro avaliadas e confirmados específicos para PCV-3 por análise da sequência de nucleotídeos (nt) Em seguida, amostras de pulmão provenientes dos sete animais previamente positivos no soro foram também avaliadas por PCR Destas, três amostras apresentaram boa quantificação de DNA e foram submetidas ao sequenciamento genômico completo para análise filogenética das cepas de PCV-3 identificadas As três sequências completas obtidas foram agrupadas no clado “a” de PCV-3 e as sequências apresentaram 1% de identidade de nt entre si As cepas de PCV-3 deste estudo possuem 99,5% a 99,8% e 98,8% a 1% de identidade de nt e similaridade de aminoácido (aa), respectivamente, com as sequências de genoma completo de cepas de todo o mundo No segundo estudo, a presença de anticorpos anti-Mhyo foi avaliada por meio de kit comercial de ELISA indireto em 88 amostras de soro Adicionalmente, a presença de lesões macroscópicas semelhantes à pneumonia enzoótica foi identificada em 27 amostras de pulmões, e a marcação pela técnica de imuno-histoquímica (IHQ) foi observada em 15/27 (55,5%) amostras O teste do qui-quadrado e a intensidade da associação com o odds ratio e intervalo de confiança de 95% foram utilizados para avaliar as diferenças nas variáveis qualitativas entre os grupos (sexo e município) Os javalis jovens apresentaram maior seroprevalência para Mhyo do que os mais velhos (p=,5) O município de Teixeira Soares diferiu na taxa de soroprevalência de Mhyo comparado aos municípios de Castro (p<,1), Ponta Grossa (p=,4) e Carambeí (p<,1) As fêmeas apresentaram 6,79 vezes mais chance de possuirem lesões de consolidação pulmonar do que os machos (p=,4) Dentre as amostras de pulmão com lesões avaliadas, 57,1% (8/14) e 53,8% (7/13) foram positivas para Mhyo por IHQ em animais provenientes dos municípios de Castro e Ponta Grossa, respectivamente, confirmando que as lesões macroscópicas identificadas foram ocasionadas pela infecção por Mhyo Estes estudos demonstram a circulação de PCV-3 e de Mhyo em suínos asselvajados de vida livre, sugerindo que estes animais podem participar do ciclo epidemiológico destes microrganismos e constituem fator de risco para as criações comerciais de suínos domésticosItem Classificação molecular de sapovírus suíno e dinâmica da infecção de diferentes estirpes em suínos livres de patógenos específicosBarry, Aline Fernandes; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Fúngaro, Maria Helena Pelegrinelli; Vilas-Bôas, Laurival Antônio; Headley, Selwyn Arlington; Garcia, João LuisResumo: O sapovírus (SaV) foram primeiramente associados a surtos de gastroenterite em crianças Mais recentemente os SaV tem sido associados a surtos de diarreia em indivíduos de todas as idades A descrição desses surtos vem também se tornando mais frequente independentemente dos testes diagnósticos utilizados Em suínos, a frequência dos SaVs é elevada em diversos países, e é sabido que o vírus circula nos rebanhos suínos de todo o mundo A alta identidade relativa de estirpes de SaV suíno com SaV humano, sugere que o suíno possa ser um reservatório do vírus humano, caracterizando assim uma zoonose, e também que recombinaçoes entre estirpes de SaV humano e suíno possam ocorrer No presente estudo, foram conduzidos dois trabalhos com o objetivo de esclarecer aspectos ainda obscuros da patogenia e classificação dos SaV O primeiro estudo, teve por objetivo organizar a classificação dos SaV suínos, utilizando como base os SaV humanos, cuja antigenicidade já é conhecida para algumas estirpes Desse modo, a classificaçao foi realizada com base no gene da VP1 Uma vez que o gene da polimerase (RpRd) viral é o mais comunmente utilizado para o diagnóstico, a classificação do gene da VP1 foi comparada à filogenia obtida com o gene da RpRd, concluindo que para os SaV suínos, ambos os genes podem ser utilizados para a classificação em genogrupos Com a classificaçao estabelecida, foi possível verificar que todos os genogrupos de SaV suíno circulam em todo o mundo No segundo estudo, leitões livres de patógenos específicos (SPF) foram inoculados com estirpes de SaV suíno (GVII e GVIII) e uma estirpe de SaV humano (GI2) As estirpes claramente mostraram diferentes padrões na dinâmica da infecção, incluindo eficiência na replicação e capacidade de invadir outros orgáos fora do trato gastrointestinal A estirpe de SaV humano não se replicou nos animais, sugerindo que o suíno não é um reservatório do vírus humano e que provavelmente recombinações com estirpes de SaV humano e suíno sejam improváveis de ocorrer uma vez que para o fenômeno seja necessário a infecção concomitante com ambas as estirpes Em nenhum dos grupos de leitões inoculados houve associação entra infecção por SaV e o desenvolvimento de sinais clínico Em resumo, com o presente trabalho, uma classificação pode ser estabelecida para os SaV suino e importantes aspectos da dinamica da infecção em suínos foram esclarecidosItem Diagnóstico e estudo molecular de cepas brasileiras de rotavírus suíno espécies B e HMolinari, Bruna Letícia Domingues; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Zotti, Everson; Alberton, Geraldo Camilo; Headley, Selwyn Arlington; Leme, Raquel de ArrudaResumo: A gastroenterite em leitões lactentes e recém-desmamados representa a principal causa de morbidade e mortalidade durante o período neonatal A síndrome é caracterizada por infecção entérica multifatorial e multietiológica Entre as causas infecciosas, o rotavírus (RV) é o principal agente etiológico viral Por serem mais frequentes, as espécies de rotavírus A (RVA) e C (RVC) são as mais estudadas No entanto, surtos de diarreia causados por espécies de rotavírus B (RVB) em leitões lactentes estão sendo relatados em rebanhos de suínos das regiões sul e centro-oeste do Brasil Por sua vez, a espécie de rotavírus H (RVH) foi descrita apenas recentemente na suinocultura brasileira Os objetivos deste estudo foram avaliar a presença de cepas de RV em um surto de diarreia em leitões lactentes e recém-desmamos que ocorreu em uma granja com programa de vacinação contra patógenos entéricos, incluindo RVA, e realizar a caracterização molecular das cepas de RVB e RVH identificadas Para isso, três estudos independentes foram realizados O objetivo do primeiro estudo foi determinar as sequências de nucleotídeos (nt) e de aminoácidos (aa) dos genes que codificam as proteínas VP6, VP7, VP4 e NSP4 de seis cepas de campo identificadas como RVH (BR59, BR6, BR61, BR62, BR63 e BR64) no surto de diarreia A partir da cepa de RVH suína, SKA-1, primers específicos foram selecionados para amplicação dos genes citados acima Com base nas altas identidades encontradas entre as sequências de nt (~99%) dos genes VP6, VP4, VP7 e NSP4 entre cinco das cepas estudadas (BR59 a BR63), é possível considerá-las pertencentes a mesma linhagem de RV, denominada RVH / BRA-1 Em contraste, uma vez que a amostra fecal BR64 apresentou uma diferença relativamente alta (81,6% e 83,4% de identidade para nt e aa, respectivamente) na sequência referente à proteína VP7, quando comparada com as outras cinco amostras, a mesma foi denominada cepa RVH / BRA-2 No segundo estudo, com o objetivo de triar todas as amostras diarreicas (n = 5) obtidas no surto para RVA, B, C e H, realizou-se RT-PCR com primers específicos para cada espécie De acordo com os testes, RVC (78%) foi mais prevalente nas infecções singulares (34%) e mistas (44%), seguido pelo RVA (46%), RVB (32%) e RVH (18%) A análise filogenética de três cepas de RVA permitiu a caracterização de dois genotipos G / P distintos, representados por G5P[13] e G9P[23], diferentemente do G5P[7] presente em vacinas comerciais Independentemente da espécie de RV, as infecções mistas (54%) foram mais prevalentes do que as infecções por um único agente RVB e RVH foram detectados apenas em associação com outros grupos de RV, sugerindo uma ação secundária dessas espécies no surto relatado Finalmente, no terceiro estudo, com base na qualidade do produto amplificado por RT-PCR, a amostra fecal de RVB identificada como BR62, foi selecionada para análises moleculares adicionais As sequências de nt e aa do gene VP7 foram determinadas e a análise comparativa desta cepa com as cepas dos outros 21 genotipos de VP7 previamente identificados mostraram que a cepa suína brasileira pertence a um novo genotipo, G22, e parece estar circulando em diferentes partes do mundo Os estudos reforçam o papel dos RV como importantes agentes causadores de diarreia demonstram a variabilidade genética entre as espécies Além disso, esta é a primeira detecção do genotipo de RVB, G22, em rebanhos suinícolas brasileirosItem Diagnóstico molecular e análise de polimorfismos do gene S1 de estirpes brasileiras do coronavírus bovino em fezes diarreicas de bezerros naturalmente infectadosTakiuchi, Elisabete; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Heinemann, Marcos Bryan; Garcia, José Eduardo; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Fungaro, Maria Helena PelegrinelliResumo: O coronavírus bovino (BCoV) é um importante agente etiológico de diarréia neonatal em bezerros Usualmente, as técnicas para a detecção do BCoV limitam-se a métodos de baixa sensibilidade como ensaios imunoenzimáticos e testes de hemaglutinação (HA)/ inibição da hemaglutinação (HI) Embora a PCR seja altamente sensível e específica, a natureza da amostra biológica é um fator limitante no diagnóstico do BCoV, devido à presença de inibidores de PCR nas fezes que podem gerar resultados falso-negativos A utilização de um controle interno na reação de PCR tem sido útil para monitorar a qualidade da extração e amplificação do ácido nucléico Este trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema de Semi nested-PCR (SN-PCR) para amplificação de um fragmento de 251 pares de bases (pb) do gene do nucleocapsídeo (N) do BCoV a partir de amostras fecais congeladas (n=25) e frescas (n=25) de bezerros com sinais clínicos de diarréia e naturalmente infectados Para aperfeiçoar a detecção do BCoV em amostras fecais pela SN-PCR foi avaliada a inclusão de um controle interno e os resultados foram comparados com uma RT-PCR convencional descrita na literatura O gene N do BCoV foi detectado pela SN-PCR e RT-PCR em respectivamente, 24% (12/5) e 8% (4/5) das amostras analisadas (K=,43) Somente as amostras que não sofreram o congelamento foram positivas na RT-PCR enquanto a SN-PCR descrita neste trabalho detectou o BCoV em ambas condições de preservação A possibilidade de resultados falso-negativos foi descartada com a amplificação do controle interno em todas as amostras analisadas A inclusão de um controle interno na PCR possibilitou maior precisão no diagnóstico do BCoV como agente etiológico da diarréia em bezerros Com o objetivo de estabelecer as relações genéticas entre as três estirpes brasileiras de BCoV daquelas descritas em outros países, foi desenvolvida uma estratégia de seqüenciamento para o gene que codifica a subunidade S1 da glicoproteína da espícula aplicando posteriormente o método da máxima parcimônia para realização das estimativas filogenéticas A análise filogenética da seqüência total de nucleotídeos e dos aminoácidos deduzidos do gene S1 revelou que as estirpes brasileiras descritas neste trabalho apresentaram maior identidade com a estirpe entérica americana BCoV-ENT com 98,7% e 98,7%, respectivamente A menor identidade foi observada com o protótipo BCoV Mebus com 97,8% (nucleotídeos) e 96,8% (aminoácidos) Na reconstrução da árvore filogenética não enraizada, baseada na região hipervariável da subunidade S1, nossas amostras foram agrupadas com as amostras americanas (BCoV-ENT, 182NS), amostras canadenses de diarréia neonatal (BCQ2, BCQ7373, BCQ27, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) e uma amostra canadense de diarréia do inverno (BCQ259) e agruparam-se em um ramo separado das estirpes de origem coreana e as estirpes respiratórias de BCoV Observou-se ainda que as três estirpes localizaram-se em um ramo bem distante de outras amostras brasileiras (AY66193, AY66194) anteriormente descritas Portanto, estes dados colaboram com a reconstrução genealógica dos BCoV e sugerem a existência de no mínimo dois BCoV circulantes no Brasil Adicionalmente o presente trabalho apresenta a descrição de uma mutação inédita na seqüência de aminoácidos observada no sítio de clivagem da proteína S As prováveis conseqüências biológicas desta mutação foram especuladas a partir de estudos relacionados com o coronavirus da hepatite dos comundongos (MHV)Item Diarreia neonatal bovina : epidemiologia e caracterização molecular dos genotipos G (VP7) e P (VP4) de rotavírus A, Brasil, 2006-2015Medeiros, Thais Neris da Silva; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Navarro, Italmar Teodorico; Vilas-Bôas, Laurival Antônio; Silva, Luiz César da; Lunardi, MicheleResumo: O rotavírus bovino A (RVA) é uma das principais causas de diarreia neonatal em bezerros de todo o mundo Os genes VP7 e VP4 de RVA determinam a classificação binária em genotipos G e P, respectivamente As principais combinações de genotipos G e P descritas em bovinos são: G6P[1], G6P[5], G6P[11], G8P[1] e G1P[11] A presente pesquisa originou dois estudos temporais, em que foram coletadas amostras de fezes diarreicas de bezerros de corte e de leite de rebanhos brasileiros durante o período de 26 a 215 O objetivo do primeiro estudo foi descrever a frequência de RVA presente nas fezes diarreicas avaliadas e o objetivo do segundo estudo foi descrever os genotipos G e P de cepas de RVA circulantes nos rebanhos bovinos brasileiros No primeiro estudo foram avaliadas 1498 amostras de fezes diarreicas pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (ss-PAGE) seguida da coloração pelo nitrato de prata, de 124 rebanhos de corte e 56 rebanhos leiteiros das três principais regiões produtoras de bovinos do Brasil O RVA foi identificado em 27,4% (41/1498) das amostras fecais avaliadas e a frequência de amostras positivas para RVA em bezerros de corte (31,9%; 328/127) foi significativamente maior (p=,5) que a frequência verificada em bezerros leiteiros (17,4%; 82/471) A infecção pelo RVA foi verificada nas três regiões produtoras brasileiras avaliadas, no entanto, a frequência de bezerros com diarreia positivos para RVA na região Centro-Oeste (39,4%), foi significativamente maior (p=,5) que as regiões Sul (19,4%) e Sudeste (17,6%) No segundo estudo, as amostras foram selecionadas a partir de um conjunto que consistia de 1589 amostras fecais previamente avaliadas para a presença de RVA pela técnica de ss-PAGE de cinco regiões geográficas brasileiras e destas, 417 (26,2%) foram positivas para RVA Foram selecionadas por rebanho bovino uma ou duas amostras fecais positivas para RVA em ss-PAGE, sendo 155 cepas de RVA, 7 pertencentes a rebanhos de corte e 3 de rebanhos leiteiros Os genes G e P das cepas de RVA foram amplificados por RT-PCR e sequenciados para análise filogenética Os genotipos G6, G1, P[5] e P[11] foram detectados nas amostras de RVA avaliadas Uma distribuição diferente de combinações de genotipos G e P foi encontrada de acordo com o tipo de aptidão, sendo o genotipo G6P[5] mais prevalente (68,5%) em rebanhos de corte e os genotipos G1P[11] (4,5%) e G6P[11] (32,4%) mais prevalentes em rebanhos leiteiros (p<,5) Com relação às regiões geográficas analisadas, o maior número de cepas de RVA genotipadas pertenceu à região Centro-Oeste, sendo o genotipo G6 foi único identificado nesta região As regiões Sul e Sudeste apresentaram maior diversidade de genotipos G e P A combinação de genotipos G6(IV)P[5](IX) foi predominante em bovinos de corte, e as combinações G6(III)P[11](III) e G1(V)P[11](III) foram prevalentes em bovinos leiteiros A linhagem P5(II) foi descrita pela primeira vez no Brasil, em rebanho de corte do Rio Grande do Sul Com os resultados apresentados, conclui-se que o RVA continua sendo um dos principais agentes etiológicos de diarreia neonatal em bezerros nos rebanhos bovinos brasileiros Em outras regiões do mundo, a diversidade de genotipos G e P é consideravelmente maior do que a encontrada no presente estudo, mesmo utilizando as mesmas metodologias diagnósticas que pode ser devido a eficácia das medidas de controle e profilaxia utilizadas A importância dos estudos de genotipagem, particularmente com análises retrospectivas realizadas em diferentes regiões geográficas ou tipos de aptidão (corte e leite), contribui para a compreensão da evolução viral e da epidemiologia da infecção de RVAItem Epidemiologia molecular do Teschovirus A, Sapelovirus A e Enterovirus G em suínos domésticos e selvagens no BrasilDonin, Daiane Güllich; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Lorenzetti, Elis; Headley, Selwyn Arlington; Zotti, Everson; Silva, Luiz César daResumo: Os picornavírus entéricos suínos (PEVs), Teschovirus A (TV-A), Sapelovirus A (SV-A) e Enterovirus G (EV-G) são agentes infecciosos específicos dos suínos que se encontram disseminados pelos rebanhos suinícolas em todo o mundo Na maioria dos casos se apresentam de forma assintomática, porém têm sido associados a uma variedade de enfermidades, dentre elas doenças entéricas, reprodutivas, respiratórias e neurológicas Este estudo visou avaliar a infecção natural pelos PEVs em rebanhos de três importantes regiões geográficas produtoras de suínos do Brasil Para isso, foram realizados dois estudos, utilizando a reação em cadeia da polimerase precedida por transcrição reversa (RT-PCR) e nested-PCR que tiveram como alvo a região conservada 5´ não traduzida (5’NTR) do genoma destes vírus O primeiro estudo teve como objetivo avaliar a frequência de infecção natural por TV-A, SV-A e EV-G em criações de suínos localizadas nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste do país Foram selecionadas aleatoriamente 4 amostras de fezes com consistência normal (n=17) e diarreica (n=23) de leitões lactentes (n=22) e desmamados (n=18) Foi possível demonstrar que tanto a infecção pelo TV-A quanto pelo EV-G foi comum entre os leitões lactentes (1 a 3 semanas de idade), com frequência de 4,9% (9/22) em infecções singulares e mistas O SV-A não foi detectado nesta categoria animal Nos leitões desmamados (4 a 8 semanas de idade) foi observada maior frequência destes agentes (77,8%, 14/18) nas amostras fecais, sendo mais comum a observação de infecções mistas pelo TV-A e EV-G (4/14) Somente foram detectadas infecções singulares por TV-A e EV-G O SV-A foi identificado em infecção mista com os outros agentes em 38,8% (7/18) das amostras avaliadas Para confirmar a especificidade dos fragmentos amplificados neste estudo, duas amostras positivas para cada vírus na nested-PCR foram selecionadas para sequenciamento As cepas de TV-A, SV-A e EV-G detectadas no Brasil revelaram alta identidade nas sequências de nucleotídeos com as disponíveis em bases públicas de dados Este estudo concluiu que as regiões geográficas brasileiras pesquisadas apresentam ao menos dois dos vírus estudados circulando entre leitões lactentes e desmamados O segundo estudo teve como objetivo avaliar a distribuição da infecção pelos PEVs entre javalis do estado do Paraná e avaliar catetos e queixadas como portadores para estes três vírus Foram analisadas 36 amostras de fezes de animais assintomáticos Vinte e dois javalis com idade entre 2 e 7 meses (n=14) e entre 2 e 4 anos (n=8) e 14 catetos e queixadas com idade de 6 a 8 meses foram avaliados Os PEVs foram detectados em 54,5% (12/22) das amostras de javalis O vírus mais frequente foi EV-G (5%, 11/22), seguido por TV-A (45,5%, 1/22) e SV-A (18,2%, 4/22) De acordo com a idade, animais jovens foram mais frequentemente infectados que os adultos Um produto amplificado na nested-PCR de cada um dos vírus foi submetido ao sequenciamento A sequência de nucleotídeos das cepas deste estudo mostrou alta identidade com as sequências de PEVs disponíveis em bases públicas de dados, incluindo as relatadas no Brasil no primeiro estudo Catetos e queixadas foram negativos para os três vírus Neste estudo, foi possível comprovar pela primeira vez a circulação de TV-A, SV-A e EV-G em javalis do Brasil e demonstrar que catetos e queixadas não foram positivos para estes patógenos exclusivos dos suínos Desta forma, foi possível demonstrar que a infecção por TV-A, SV-A e EV-G está presente nas diferentes regiões geográficas produtoras de suínos do Brasil, tanto em fezes com consistência normal quanto em diarreicas, e também em javalis no BrasilItem Identificação e estudo da diversidade do papilomavírus associado a lesões cutâneas em bovinosClaus, Marlise Pompeo; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Vilas-Boas, Laurival Antônio; Garcia, João Luis; Freitas, Julio Cesar deResumo: O papilomavírus (PV) é de ocorrência mundial e está envolvido no desenvolvimento de neoplasias epiteliais benignas e malignas em seres humanos e animais A família Papillomaviridae apresenta grande diversidade, infecta uma ampla variedade de hospedeiros e, atualmente, é composta por 18 gêneros O genoma do PV é constituído por DNA de fita dupla circular e a fita codificante contém 1 ORFs A ORF L1, que codifica a principal proteína do capsídeo viral, é a mais conservada e tem sido utilizada para a identificação do tipo viral A PCR realizada com primers genéricos para a amplificação de seqüências conservada do gene L1 do PV, e posterior seqüenciamento dos amplicons, tem sido a técnica mais utilizada para a definição do tipo de PV presente em espécimes clínicas O papilomavírus bovino (BPV) é classificado nos gêneros Deltapapillomavirus (BPV-1 e -2); Epsilonpapillomavirus (BPV-5 e -8) e Xipapillomavirus (BPV-3, -4, -6, -9, e -1) O BPV-7, até o momento, não está incluído em nenhum dos gêneros existentes A papilomatose bovina está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de corte e, principalmente, de leite de todas as regiões geográficas brasileiras Porém, os tipos de BPV, assim como as formas de infecção (singular, mista ou co-infecção), mais prevalentes nos rebanhos brasileiros ainda não foram determinados O presente estudo teve como objetivo a determinação dos tipos virais e formas de infecção pelo BPV em amostras de papilomas cutâneos provenientes de rebanhos bovinos da região norte do Estado do Paraná Utilizando a técnica da PCR, com os primers genéricos FAP59/FAP64, foram analisadas 22 amostras de papilomas cutâneos de 2 rebanhos de corte (n=16) e 2 de leite (n=6) Os produtos amplificados foram seqüenciados para a realização de análises filogenéticas Os amplicons de 4 amostras onde o tipo viral não pode ser determinado foram clonados Análises filogenéticas foram realizadas a partir das seqüências obtidas dos clones A PCR amplificou um produto com aproximadamente 48 pares de bases em todas as amostras de papilomas cutâneos avaliadas O seqüenciamento direto dos amplicons e análises das seqüências identificaram quatro tipos de BPV (-1, -2, -6, e -8) O BPV-8, recentemente descrito na Ásia e Europa, foi identificado pela primeira vez no continente Americano, sugerindo a sua provável distribuição universal Foram ainda identificados quatro supostos novos tipos de BPV ainda não descritos na literatura mundial Os papilomas colhidos de diferentes regiões do corpo de 6 animais, sendo mais de um por animal, revelaram infecção mista caracterizada pela presença de dois tipos virais em cinco animais e três tipos virais em um animal Adicionalmente, foi também identificado um caso de co-infecção Em uma amostra de papiloma extraído do teto de uma vaca adulta, por meio de clonagem e seqüenciamento, foram identificados dois tipos virais distintos (BPV-1 e BPV-6) na mesma lesão A infecção mista e a co-infecção, ainda não haviam sido descritas no Brasil Os resultados desse estudo demonstram que, a exemplo do observado nas infecções pelo papilomavírus humano, a epidemiologia da papilomatose cutânea bovina no Brasil é bastante complexa envolvendo vários tipos virais e formas de infecção Considerando a importância clínica e econômica da papilomatose bovina, estudos de caráter epidemiológico e molecular mais abrangente são necessários para o desenvolvimento e avaliação de medidas de controle e profilaxia da infecção nos rebanhos brasileirosItem Infecção pelo vírus da mancha branca (WSSV) e vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHNV) na carcinicultura catarinenseLenoch, Robert; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Ballester, Eduardo Luis Cupertino; Albinati, Ricardo Castelo Branco; Leonhardt, Júlio HermannResumo: As doenças de etiologia viral apresentam grande impacto na criação de camarões marinhos em todas as regiões do mundo comprometendo o desenvolvimento da carcinicultura Entre as principais doenças, a doença da mancha branca (WSSD) e a infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHN) estão presentes no estado de Santa Catarina e tem causado prejuízos consideráveis à atividade camaroneira O objetivo deste estudo foi avaliar a freqüência da ocorrência do vírus da mancha branca (WSSV) e do vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHNV) em fazendas de camarão marinho cultivado na região norte catarinense O estudo foi realizado no período de 25 a 28 em 12 fazendas A amostragem (n=44) consistiu de tecidos de camarões coletados em vários períodos de cultivo que incluiu pós-larvas, na chegada à fazenda, camarões com 3, 6 e 9 dias de cultivo, por ocasião da despesca e de animais com qualquer idade quando da presença de sinais clínicos Nestas ocasiões também foram coletadas amostras de tecidos de animais nativos assintomáticos, possíveis hospedeiros naturais, como caranguejos (Aratus pisoni e Uca thayeri), siris (Callinectes sapidus), zooplancton, peixes e camarões nativos (Penaues schmitti) As coletas foram realizadas nos tanques de cultivo, nos reservatórios e no canal de despesca das fazendas A presença do WSSV e do IHHNV foi avaliada por meio de reações de PCR realizadas de acordo com as recomendações descritas pela OIE Entre as 12 fazendas avaliadas, o WSSV foi identificado em 9 (75,%) sendo que em 1 (11,1%) a infecção foi assintomática e nas 8 (88,9%) fazendas restantes foram observados animais com sinais clínicos e taxas de mortalidade entre 75 a 1% Das 44 amostras obtidas de camarão Litopenaeus vannamei, 93 (21,13%) foram positivas para o WSSV O vírus foi também identificado em 22 (1,47%) amostras de tecidos obtidas de organismos nativos como caranguejo, siri, zooplancton e camarão nativo, sugerindo o papel destes animais como hospedeiros naturais A infecção pelo IHHNV apresentou caráter endêmico no período eregião estudados tendo sido identificada tanto em amostras de camarão cultivado quanto em amostras provenientes de animais nativos Das 411 amostras de camarão L vannameiavaliadas 21 (48,9%) foram positivas para o IHHNV Em animais nativos (n=74) foramencontradas taxas de positividade que variaram entre 2,8% em caranguejo da espécie Aratuspisoni e 33,3% em amostras provenientes de camarão nativo da espécie Penaues schmitti Os resultados desse estudo demonstraram que no litoral norte do estado de Santa Catarina asinfecções ocasionadas pelo WSSV e pelo IHHNV apresentaram-se amplamente distribuídas tanto em criações de camarões L vannamei quanto em hospedeiros naturaisItem Rotavírus grupos A, B e C em leitões lactentes : frequência de diagnóstico e avaliação molecular de rotavírus atípicosMédici, Kerlei Cristina; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Seneda, Marcelo Marcondes; Garcia, João Luis; Takiuchi, ElisabeteResumo: O Rotavírus é um dos principais agentes etiológicos das diarréias em leitões lactentes em todo o mundo Devido à facilidade na identificação, com freqüência, apenas o grupo A de rotavírus é incluído nos estudos epidemiológicos da rotavirose em leitões O objetivo desse estudo foi avaliar a freqüência de diagnóstico de rotavírus grupos A, B e C em episódios de diarréia em leitões lactentes e realizar análises filogenéticas em estirpes de rotavírus grupos B e C identificadas no Brasil Para a definição da amostragem foi utilizado como critério de inclusão o resultado prévio obtido pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), tendo sido selecionadas 144 amostras fecais que apresentaram resultados inconclusivos em PAGE A identificação dos grupos A, B e C foi realizada por meio de técnicas de RT-PCR Para o grupo A foram utilizados primers consensuais para G (VP7) e P (VP4) tipos O diagnóstico do grupo B foi realizado por meio de semi nested-PCR que amplifica um fragmento com 434 pb do gene 8 (NSP2) O grupo C foi identificado por meio da amplificação por RT-PCR de um produto com 27 pb do gene 5 (VP6) Das 144 amostras analisadas apenas 41 (28,5%) foram negativas, simultaneamente, para os três grupos de rotavírus Infecções singulares foram identificadas em 58 (4,3%) amostras sendo que em 34 (23,6%) amostras foi identificado o grupo A, em 19 (13,2%) o grupo B e em 5 (3,5%) amostras o grupo C Em 45 (31,2%) amostras prevaleceram as infecções mistas com dois e até mesmo os três grupos de rotavírus Rotavírus dos grupos B e C foram identificados com maior freqüência (42,4%) em infecções mistas Onze produtos amplificados a partir de amostras positivas para o rotavírus grupo C e três para o grupo B foram seqüenciados em ambos os sentidos Com relação ao grupo C, nove seqüências puderam ser analisadas A identidade de nucleotídeos entre elas variou de 81,3% a 94,3% Três produtos apresentaram identidade próxima (91,3%-93,9%) ao protótipo Cowden de origem suína As outras seis amostras formaram um novo ramo, distinto daqueles formados pelas estirpes de origem suína, bovina e humana disponíveis em bases públicas de dados Os três produtos, amplificados a partir de amostras fecais de leitões positivas para o rotavírus grupo B, apresentaram entre si identidade de 9,1% a 91,8% e formaram um ramo distinto daqueles formados pelas estirpes de origem humana e de rato, evidenciando que as estirpes puderam ser diferenciadas de acordo com o seu hospedeiro de origem As taxas de diagnóstico positivo identificadas nesse trabalho ratificam a importância da rotavirose nos episódios de diarréia em leitões lactentes no Brasil A expressiva freqüência de diagnóstico dos grupos B e C, tanto em infecções singulares quanto mistas, sugere que a taxa de infecção de leitões por esses vírus esta sendo subestimada As análises moleculares demonstraram a heterogeneidade das estirpes brasileiras de rotavírus suíno grupo C no Brasil Foi possível ainda a caracterização de um novo cluster de rotavírus grupo B, ainda não descrito na literatura, composto pelas amostras brasileiras de origem suína, e que possibilitou diferenciar as estirpes de origem humana e de rato disponíveis em bases públicas de dados com aquelas de origem suínaItem Senecavirus A : virose vesicular emergente na suinocultura brasileiraLeme, Raquel de Arruda; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro; Takiuchi, Elisabete; Alberton, Geraldo Camilo; Costa, Marcio Carvalho daResumo: As doenças vesiculares são de grande importância para a Medicina Veterinária A febre aftosa, a doença vesicular suína, o exantema vesicular suíno e a estomatite vesicular são doenças vesiculares clássicas de etiologia viral Na família Picornaviridae estão incluídos o vírus da febre aftosa e o vírus da doença vesicular suína que ocasionam lesões vesiculares em suínos Entretanto, dois estudos realizados no Canadá e nos EUA a partir de 28 identificaram uma nova espécie de picornavírus, denominada Senecavirus A, como o mais provável agente etiológico de doença vesicular, similar à febre aftosa, em suínos No final de 214 e início de 215 houve diversos relatos de doença vesicular em suínos nas fases de creche e terminação, além do aumento da incidência de doença multissistêmica em leitões, com altas taxas de mortalidade, nos principais estados brasileiros produtores de suínos O objetivo deste estudo foi investigar a infecção natural pelo Senecavirus A em suínos de diferentes categorias de produção provenientes de granjas dos estados brasileiros de maior importância para a suinocultura Para isso foram realizados três estudos O primeiro estudo teve como objetivo investigar a infecção pelo Senecavirus A em surtos de doença vesicular de origem desconhecida em suínos das categorias de creche e adultos Um conjunto de primers específico para amplificar um produto de 542 pb da região VP3/VP1 do genoma do vírus foi desenhado para ser utilizado na técnica de RT-PCR Amostras clínicas de suínos foram coletadas em oito granjas com surto da doença vesicular, incluindo fluido vesicular (n=4), swabs de vesículas rompidas (n=7) e raspados de lesões ulcerativas (n=5) Foram também analisadas raspados de pele (n=52) de suínos assintomáticos provenientes de granjas com e sem histórico da doença Os agentes virais de doenças vesiculares clássicas foram investigados e não foram detectados O RNA do Senecavirus A foi detectado em todas as amostras (16/16) provenientes de animais acometidos pela doença vesicular, enquanto nenhuma das amostras de animais assintomáticos foram positivas para o vírus O segundo e o terceiro estudos descrevem, respectivamente, novas manifestações clínicas associadas ao Senecavirus A assim como os achados patológicos, imunohistoquímicos e moleculares associados à infecção, ambos em leitões neonatos com 1 a 5 dias de idade No segundo estudo, foram analisadas amostras de órgãos/tecidos (n=81) e de fezes (n=6) de 1 leitões, provenientes de cinco granjas dos estados do Paraná, Santa Catarina e Mato Grosso do Sul O terceiro estudo é complementar ao segundo e foram incluídas amostras clínicas de mais dois leitões provenientes dos estados de São Paulo e Santa Catarina, totalizando 12 amostras de órgãos/tecidos e 8 amostras de fezes Todos os leitões incluídos nos estudos manifestaram sinais clínicos de fraqueza, letargia, salivação excessiva, hiperemia cutânea, sinais neurológicos, diarreia e/ou morte espontânea Em conjunto, os resultados desses dois estudos revelaram que os achados de necropsia mais comuns foram impressão das costelas em pulmões (n=9), glossite diftérica (n=6) e lesões ulcerativas na banda coronária (n=5) A histopatologia revelou pneumonia intersticial (n=12), miocardite (n=6), glossite diftérica (n=3), encefalite (n=3) e atrofia das vilosidades intestinais com vacuolização das células epiteliais superficiais (n=6) A imunohistoquímica com anticorpos monoclonais específicos para Senecavirus A demonstrou imunorreatividade no plexo coróide do cérebro, epitélio degenerado de lesões ulcerativas da língua, uroepitelio do rim e vesícula urinária e nas células superficiais do intestino e em vários tecidos dos leitões; os ensaios moleculares para os outros vírus avaliados apresentaram resultados negativos Os estudos descrevem pela primeira vez a infecção pelo Senecavirus A fora da América do Norte e sugerem que o vírus seja o agente causal dos surtos de doença vesicular descritos no Brasil, bem como a participação do vírus em múltiplas lesões observadas em leitões neonatos, caracterizando-se como um vírus pantrópico capaz de causar doença multissistêmica em suínos infectados precocementeItem Tremor congênito em leitões recém-nascidos e a infecção por pestivírus suíno atípicoPossatti, Flávia; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Takiuchi, Elisabete; Lunardi, Michele; Amude, Alexandre Mendes; Lorenzetti, ElisResumo: Pestivírus suíno atípico (APPV) tem sido associado ao tremor congênito (TC) tipo A-II em leitões neonatos Apesar do número de estudos sobre o APPV ter aumentado, as alterações histopatológicas, bem como outros aspectos relativos à caracterização antigênica e molecular do vírus e aspectos epidemiológicos da infecção em leitões ainda são pouco descritos O objetivo do primeiro estudo foi descrever os achados patológicos e moleculares associados à infecção simultânea de APPV e teschovírus suíno (PTV) em leitões com manifestações clínicas de TC provenientes de um rebanho do estado do Paraná com altas taxas de letalidade em animais recém-nascidos Em 217, foram relatados casos de TC em leitegadas com alta letalidade neonatal em um rebanho paranaense e três leitões da mesma leitegada que morreram espontaneamente foram enviados para diagnóstico As principais alterações patológicas encontradas em todos os leitões foram desmielinização secundária e hipomielinização no cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal confirmadas por histopatologia e coloração Luxol Fast Blue Alterações histopatológicas adicionais incluíram necrose neuronal multifocal, neuronofagia e gliose encontrados no córtex cerebral e medula espinhal e enterite atrófica de todos os leitões e edema no mesocólon de um deles RNA de APPV e de PTV foi detectado por nested-RT-PCR no sistema nervoso central (SNC) dos leitões afetados, sendo que PTV também foi detectado no intestino e nas fezes As alterações patológicas e os resultados moleculares demonstram que os leitões avaliados apresentavam infecção por APPV e PTV, o que pode ter ocasionado a alta letalidade (1%) de leitões recém-nascidos identificada nesse caso No segundo estudo foram descritas as características histopatológicas da infecção espontânea singular por APPV em quatro leitões com sinais clínicos de TC Os quatro leitões de dois dias de idade com TC foram avaliados por histopatologia, imunohistoquímica (IHQ) e análise molecular As principais alterações histopatológicas no encéfalo e medula espinhal incluíram necrose neuronal, gliose, neuronofagia, satelitose, desmielinização, degeneração walleriana e necrose de células de purkinje Na IHQ, realizada com o objetivo de detectar a proliferação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) em áreas afetadas do encéfalo e medula espinhal, demonstrou que a proliferação de células GFAP positivas e fibras era predominante em leitões com TC infectados com APPV em relação a leitões assintomáticos não infectados da mesma idade As reações de nested-RT-PCR identificaram RNA de APPV no cérebro, cerebelo e tronco cerebral de todos os leitões, enquanto outros vírus (teschovírus suíno, sapelovírus suíno e vírus Seneca Valley) conhecidos por induzir sinais clínicos semelhantes não foram identificados Estes resultados sugerem que as alterações histopatológicas induzidas pela infecção singular por APPV nos leitões avaliados são predominantemente degenerativas e necróticas e correlacionadas com as alterações identificadas no primeiro estudo Com estes resultados podemos sugerir que a necrose neuronal, a gliose, a neuronofagia e a satelitose possam ser consideradas características histológicas importantes da infecção induzida por APPV em leitões recém-nascidos com sinais clínicos de TCItem Vigilância epidemiológica dos genotipos G (VP7) e P (VP4) de rotavírus A em rebanhos bovinos leiteiros vacinados contra rotaviroseFritzen, Juliana Torres Tomazi; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Alfieri, Alice Fernandes; Claus, Marlise Pompeo; Lorenzetti, Elis; Otonel, Rodrigo Alejandro ArellanoResumo: A diarreia neonatal bovina (DNB) é uma enfermidade multifatorial que, com maior frequência, acomete bezerros com até 3 dias de idade A DNB é o principal evento sanitário em bezerras leiteiras lactentes e devido às taxas de morbidade e mortalidade a infecção ocasiona perdas econômicas consideráveis à cadeia produtiva do leite O principal agente infeccioso viral envolvido na etiologia dessa enfermidade é o rotavírus A (RVA) Entre as várias medidas de controle e profilaxia a serem adotadas para a redução da frequência de DNB em rebanhos bovinos leiteiros destaca-se a vacinação das vacas no período pré-parto O objetivo desse estudo foi monitorar os genotipos G (VP7) e P (VP4) de cepas de RVA identificadas em bezerras leiteiras em rebanhos regularmente vacinados com vacina comercial contendo RVA genotipo G6P[5] Para isso, foram conduzidos dois experimentos sendo o primeiro de caráter longitudinal e o segundo transversal No primeiro experimento, 122 bezerras provenientes de um rebanho da raça Holandesa foram avaliadas até os 3 dias de idade Em todas as bezerras, independentemente da presença ou ausência de DNB, nos dias 1, 4, 7, 1, 14, 17, 21, 24, 28 e 3 de idade foram realizadas colheitas de amostras fecais totalizando 122 amostras O segundo experimento foi realizado em 14 rebanhos bovinos leiteiros regularmente vacinados contra a rotavirose, e em cada rebanho foi realizada apenas uma colheita de amostras fecais diarreicas (n=87) em bezerras de até 3 dias de idade Como técnica de triagem, a presença de RVA nas amostras fecais foi avaliada pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) Todas as amostras positivas para RVA por EGPA foram submetidas à amplificação dos genes VP7 e VP4 por RT-PCR e os genotipos G e P, respectivamente foram determinados por sequenciamento dos produtos amplificados e análise das sequencias obtidas No experimento longitudinal foram identificados 76 (62,3%) e 99 (8,1%) animais e amostras fecais positivas para RVA, respectivamente Todas as amostras RVA-positivas (n=1) selecionadas para o sequenciamento foram caracterizadas como genotipo G1P[11] No experimento transversal somente 42,86% (6/14) das propriedades foram analisadas Oito rebanhos foram excluídos do estudo, por não apresentarem bezerras com diarreia (n=2) ou por não apresentarem amostras fecais positivas para RVA (n=6) Nos seis rebanhos restantes, 17 (25,4%) amostras de fezes foram positivas para RVA O sequenciamento e análise filogenética dos produtos amplificados dos genes VP7 e VP4 possibilitaram identificar os genotipos G6P[11] em cinco rebanhos e G1P[11] em um As cepas G6 pertencem a linhagem III enquanto a cepa G6 vacinal pertence a linhagem IV, caracterizando a ocorrência nos rebanhos vacinados de RVA genotipo G6 distinto daquele presente na cepa vacinal Adicionalmente, nestes rebanhos vacinados com RVA genotipo G6P[5] foi observada a emergência dos genotipos G1 e P[11] caracterizando possível falha na proteção heteróloga Os resultados, tanto do experimento longitudinal quanto do transversal, demonstraram que nos rebanhos bovinos regularmente vacinados com a cepa G6P[5] de RVA houve redução na frequência de diarreia em bezerros com idade inferior a 3 dias Contudo, houve circulação de RVA com genotipos G e P distintos daqueles presentes na cepa vacinal Com isso, evidencia-se a importância do constante monitoramento das cepas de RVA circulantes em rebanhos bovinos regularmente vacinados e também da realização de estudos de vigilância epidemiológica para a identificação de genotipos emergentes e para a caracterização molecular de cepas de RVA com maior virulência e/ou com potencial zoonótico