01 - Doutorado - Patologia Experimental
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Navegando 01 - Doutorado - Patologia Experimental por Assunto "Antígenos"
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Item Análise da produção de anticorpos IgY das características histológicas do baço e da medula óssea de galinhas poedeiras inoculadas com venenos de serpentesAndrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Loyola, Wagner; Ramos, Solange de Paula; Itano, Eiko Nakagawa; Pavanelli, Wander RogérioResumo: Acidentes ofídicos são causados principalmente por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e tratados pela administração de antissoro de mamíferos Como alternativa a este procedimento, a utilização de anticorpos IgY antiveneno produzidos em galinhas poedeiras tem sido avaliada nos últimos anos Neste trabalho foram realizados dois experimentos No primeiro experimento, foi investigada a participação do baço e da medula óssea na produção de anticorpos IgY em galinhas poedeiras white leghorn (Gallus gallus domesticus) imunizadas com veneno crotálico Amostras de soro e gema foram coletadas durante o experimento, para análise da produção de anticorpos IgY Ao final deste, o baço e a medula óssea dos animais foram coletados e submetidos à análise histológica Os resultados mostraram um aumento dos anticorpos IgY crotálico no soro e na gema, a partir do 32º dia após a primeira imunização Estes níveis permaneceram elevados à medida que foram administradas doses de reforço do veneno usado como antígeno A inoculação de veneno crotálico em galinhas poedeiras induziu a produção de anticorpos IgY, principalmente na polpa branca perielipsoidal do baço e também no espaço extravascular da medula óssea No segundo experimento, galinhas poedeiras foram imunizadas com venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e observadas durante 367 dias Os anticorpos IgY antiveneno foram coletados no soro e na gema dos ovos e avaliados segundo os seguintes parâmetros: níveis, avidez, padrão de reconhecimento antigênico e eficácia Os níveis de anticorpos IgY antibotrópico anticrotálico produzidos aumentaram significativamente após a segunda imunização e assim permaneceram até o final do experimento Índices significativamente elevados de avidez foram observados para anticorpos IgY antibotrópico no 142º dia e para anticorpos IgY anticrotálico no 232º dia após a primeira imunização Os anticorpos IgY antibotro pico reconheceram antí genos de massa molecular de 25 kDa e 5 kDa, enquanto os anticorpos IgY anticrota lico reconheceram principalmente antí genos de massa molecular de 14 kDa e 3 kDa Os antí genos foram mais bem reconhecidos ao final do perí odo experimental Utilizando amostras de soluções aquosas de anticorpos com concentração proteica de 15 mg/ml verificou-se que a solução contendo IgY antibotrópico apresentou eficiência 29µl/3DL5 e potência ,37mg/ml As amostras de solução aquosa contendo anticorpos IgY anticrotálico apresentaram eficiência 246µl/4DL5 e potência de ,829 mg/ml A produção de anticorpos IgY antibotrópico e anticrotálico pôde ser melhorada mediante administração de sucessivas doses dos venenos durante período de imunização superior a 6 meses, afim de se atingirem níveis de anticorpos e índices de avidez mais elevados A avidez elevada e a maior concentração dos anticorpos IgY antiveneno permitiram a neutralização de componentes tóxicos dos venenos inoculados, impedindo seus efeitos letais, sugerindo que estes anticorpos tenham aplicabilidade no tratamento de acidentes ofídicosItem Anticorpos e imunocomplexos aos antígenos dentinários em ratos e anticorpos salivares e resposta linfoproliferativa para frações de dentina humana associados à reabsorção dentária no tratamento ortodônticoCosta, Tânia Maris Pedrini Soares da; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Hidalgo, Mirian Marubayashi; Lima, Carlos Eduardo Oliveira; Marquez, Audrey de SouzaResumo: O potencial imunogênico da dentina tem sido atribuído a antígenos que estariam presentes na dentina, os quais poderiam ser expostos ao sistema imune durante os processos de reabsorção radicular como consequência do tratamento ortodôntico Este estudo teve como objetivo investigar em modelo animal, a resposta imune humoral sistêmica e local aos antígenos dentinários, a formação de imunocomplexos e os níveis séricos de antígenos dentinários solúveis; e em humano, os níveis de IgG salivar, a resposta linfoproliferativa à frações de dentina humana e a correlação entre os dados encontrados Em modelo experimental, quarenta ratos Wistar machos escolhidos aleatóriamente foram submetidos ao movimento de inclinação mesial do primeiro molar superior direito, por aplicação de uma força ortodôntica de 55 cN por 3, 7, 14 e 21 dias ou deixado sem tratamento (controle) Após cada periodo experimental, amostras de saliva, sangue e a maxila direita de cada animal foram coletadas para análise O estudo humano constituiu-se de 3 grupos Grupo I, formado por pacientes adolescentes (n=1) onde amostras de saliva foram coletadas em 4 periodos: antes (T), 3 (T3), 6 (T6) e 12 (T12) meses de tratamento ortodôntico, para análise dos níveis de reatividade da IgG salivar para as frações FI, FII ou FIII de extrato dentinário humano No grupo II (n=3), amostras de soro e células mononucleares do sangue periférico de pacientes adolescentes com 6 meses de tratamento ortodôntico foram coletadas para análise dos níveis de IgG sérica e resposta linfoproliferativa às frações de extrato dentinário humano FI ou FIII No terceiro grupo (n=16), voluntários adolescentes que nunca haviam se submetido à tratamento ortodôntico e sem sinais radiográficos de reabsorção radicular, serviram de controle para o segundo grupo de estudo O extrato dentinário total foi obtido à partir de incisivos de rato Wistar ou de dentes terceiros molares humano, respectivamente, sendo que em humano o extrato dentinário foi submetido à cromatografia de gel filtração, Sephadex G-12-15 A reabsorção radicular foi avaliada por análise histopatológica em microscópio óptico em modelo animal e através do método de subtração radiográfica digital dos incisivos superiores, em humano Os níveis de anticorpos, imunocomplexos e antígenos dentinários solúveis no soro foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA) Para o estudo da resposta linfoproliferativa, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humano estimuladas com frações dentinárias foram analisadas por ensaio MTT Níveis mais elevados de IgG sérica em ratos foram detectados em 14 e 21 dias em relação ao controle (p < 5) No entanto, em saliva foram detectados um aumento dos níveis de IgG salivar em 3 e 7 dias em comparação com o controle (p < 1) e uma diminuição de seus níveis em 21 dias em relação a 3 e 7 dias (p < 5) Níveis mais elevados de imunocomplexos no soro foram detectados em 14 e 21 dias (p < 1) e na saliva em 14 dias (p < 5) em relação ao controle, com uma diminuição em 21 dias em relação à 14 dias (p < 5) No grupo I humano foi observado uma maior reactividade da IgG salivar para a fração FII em relação à FIII em T6 e T12 (P < 5) e no grupo II houve uma correlação positiva significante entre proliferação de linfócitos e níveis de IgG sérica para a fração III (r = 58) Em conclusão, houve imunomodulação na resposta de anticorpos IgG salivar a antígenos dentinários durante o tratamento ortodôntico em ratos que diferem secreção sistêmica, da externa (saliva) Os níveis de imunocomplexos em soro ou saliva tem potencial para servir de marcadores biológicos, por indicar a fase ativa da reabsorção radicular Em humanos, mudança na reatividade IgG salivar para FII no decorrer do tratamento ortodôntico também sugerem o potencial desses anticorpos como marcadores biológicos para a detecção precoce da reabsorção radicularItem Antigenúria, níveis de anticorpos específicos e análise histopatológica de pulmões em ratos experimentalmente infectados com Paracoccidioides lutzii e Paracoccidioides brasiliensisChiyoda-Rodini, Franciele Ayumi Semencio; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Lenhard-Vidal, Adriane; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson JoséResumo: Paracoccidioides brasiliensis e a nova espécie Paracoccidioides lutzii são os agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), importante micose sistêmica amplamente distribuída na América Latina A glicoproteína Gp43, é o principal fator de virulência e é considerada padrão ouro no diagnóstico de P brasiliensis Porém tal glicoproteína é expressa em níveis não detectáveis em isolados de P lutzii, além disso, os dados relativos ao desenvolvimento da doença por PCM devido a esses fungos são escassos No presente estudo, comparou-se o efeito da infecção em ratos pelo fungo P lutzii (LDR2), não produtor de gp43 e por P brasiliensis (Pb18) Grupos de 5 ratos Wistar infectados (3x16 leveduras, iv) e grupo controle inoculado com PBS, foram eutanasiados 14, 28 e 56 dias após a infecção As amostras de urina foram analisadas por eletroforese, imunotransferência (IB) e a concentração de antígenos urinários totais e de gp7 determinados por ensaio imunoenzimático competitivo indireto (icELISA), utilizando anticorpos policlonais antiCFA de P lutzii e anti-CFA de P brasiliensis e anticorpo monoclonal anti-gp7, respectivamente Os níveis séricos de anticorpos IgG foram avaliados por ELISA e análise histológica de pulmão por coloração com Grocott Por eletroforese e IB, observou-se perfil distinto de bandas de antígenos entre as infecções por P lutzii e P brasiliensis Por icELISA, os níveis urinários de antígenos totais (CFA) foram significativamente maiores em ratos infectados por P brasiliensis em relação ao P lutzii, em todos os períodos analisados (P<5) Houve aumento em níveis de gp7 em todos os períodos analisados para ambos os grupos infetados, em relação ao grupo controle (p<5), porém em 28 dias de infecção o nível foi maior em infectado por P lutzii (p<5) Níveis séricos elevados de anticorpos IgG foram detectados em ambos, porém significativamente mais elevado em infectados por P brasiliensis (p<5) Pela análise histológica foi observada a presença de fungos em todos os 8 períodos em ambos os grupos, todavia em maior quantidade em animais infectados por P brasiliensis Pb18 Em conclusão, P lutzii (LDR2) possivelmente induz a PCM doença controlada, menos grave que a induzida por P brasiliensis em ratos, o que requer mais estudos Este estudo evidenciou pela primeira vez os principais antígenos P lutzii presentes em urinas de ratos infectados com P lutzii (LDR2)Item Detecção da infecção por Paracoccidioides brasiliensis por meio de PCR-ELISA e ELISA com antígenos recombinante rGp43 e sintético e reatividade à rGp43 na leishmaniose humanaBorges, Isabele Kazahaya; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Furlaneto, Márcia Cristina; Sartori, Daniele; Watanabe, Maria Angelica Ehara; Itano, Eiko NakagawaResumo: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina O diagnóstico da PCM apresenta dificuldades como reatividade cruzada com outras micoses sistêmicas como a histoplasmose ou doenças parasitárias como a leishmaniose Adicionalmente, PCM e leishmaniose são doenças que compartilham as mesmas áreas endêmicas Este estudo teve como objetivos desenvolver métodos de detecção da infecção por P brasiliensis por meio de PCR-ELISA e ELISA baseado em antígenos recombinante e sintéticos e avaliar anticorpos contra P brasiliensis em indivíduos soropositivos e soronegativos para leishmaniose Embora a glicoproteína 43 kDa (gp43) de P brasiliensis seja o antígeno mais utilizado no imunodiagnóstico da PCM, podem ocorrer reações cruzadas devido principalmente a epítopos carboidrato A gp43 recombinante produzida em Escherichia coli não é glicosilada e, portanto, pode contribuir para a redução das reações cruzadas Os peptídeos sintéticos baseados na sequência da gp43 também constituem uma alternativa interessante, pois apresentam vantagens como baixo custo de produção, altas sensibilidade e especificidade Amostras de soro humano positivas (n=2) e negativas (n=22) na imunodifusão com exoantígeno de P brasiliensis foram analisadas por ELISA utilizando gp43 recombinante (rGp43) e peptídeo sintético como antígenos, respectivamente Todas as amostras positivas na imunodifusão também foram positivas para a rGp43 enquanto 75% das amostras foram positivas no ELISA com peptídeo sintético As amostras negativas na imunodifusão apresentaram positividade no ELISA com rGp43 e peptídeo sintético de 36,4% e 4,9%, respectivamente Técnicas de biologia molecular também podem contribuir para o diagnóstico preciso e rápido da PCM Uma amostra de escarro (negativa para P brasiliensis por Nested-PCR) foi inoculada com células de P brasiliensis diluídas em série (1 a 15 células/mL) e o DNA foi extraído e amplificado por Nested-PCR O produto da amplificação foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida e por PCR-ELISA e ambas as formas de detecção permitiram a detecção de baixa quantidade de DNA, embora a PCR-ELISA tenha permitido a análise em menor tempo Amostras de soro humano soropositivas (n=14) e soronegativas (n=39) para leishmaniose foram analisadas por ELISA e imunodifusão utilizando gp43 recombinante e exoantígeno, respectivamente As amostras soropositivas e soronegativas para leishmaniose apresentaram positividade para rGp43 de 64,3% e 53,8%, e a diferença não foi significativa O ELISA baseado em rGp43 e peptídeo sintético, bem como a PCR-ELISA, constituem alternativas promissoras para a detecção da infecção por P brasiliensis