Navegando por Autor "Tavares, Eliandro Reis"
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Item Atividade antimicrobiana da fração F4A obtida de cultura de Pseudomonas aeruginosa LV em Staphylococcus aureus(2020-05-19) Gonçalves, Guilherme Bartolomeu; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Tavares, Eliandro Reis; Navarro, Miguel Octavio PérezStaphylococcus aureus é um patógeno relevante nos âmbitos comunitário e de assistência à saúde, conhecido pela dificuldade terapêutica associada à resistência antimicrobiana e à formação de biofilmes. A partir de 1940, S. aureus passou a ter notoriedade global, devido à resistência à penicilina e, em 1961, à meticilina. Como infecções causadas por essa bactéria dificultam a prática clínica, se faz notável a necessidade de pesquisas por novas substâncias antibióticas para tratar os pacientes acometidos. Ao longo da história, produtos naturais, especificamente metabólitos secundários de microrganismos, têm sido usados para combater patógenos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade inibitória da fração F4A, obtida da purificação do sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa cepa LV, sobre células planctônicas e sésseis de S. aureus, as alterações morfológicas causadas nessas células e sua toxicidade para células de mamíferos. Para isso, foram selecionados 26 isolados clínicos de S. aureus da coleção do Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos, da Universidade Estadual de Londrina (UEL). Os valores de CIM de F4A variaram de 1,56 a 6,25 µg/mL; 19 isolados apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) de 3,13 µg/mL (73,1%), 6 apresentaram CIM de 1,56 µg/mL (23,1%) e 1 isolado apresentou CIM de 6,25 µg/mL(3,8%). Concentração bactericida mínima (CBM) de 3,13 µg/mL foi detectada em 84,6% dos isolados (n=21) e 18 apresentaram valores idênticos de CIM e CBM, evidenciando o potencial efeito bactericida da fração. Pela cinética do tempo de morte, observou-se que S. aureus reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (UFCs) a partir de 4 h de tratamento com a CIM/CBM de F4A. A microscopia eletrônica de transmissão das cepas de referência tratadas com a CIM/CBM de F4A evidenciou alterações ultraestruturais como: diminuição na eletrodensidade citoplasmática, discreto espessamento e diminuição na compactação da parede celular, inibição da formação de septo e descolamento da membrana citoplasmática. O biofilme de todos os isolados apresentou redução significativa na atividade metabólica nas concentrações de 12,5 e 25 µg/mL. A maioria dos isolados apresentou concentração inibitória mínima para 50% das células sésseis (SCIM50) de 6,25 µg/mL (n=15), seguido de 12,5 µg/mL (n=8), 3,13 µg/mL (n=2) e 25,0 µg/mL (n=1). Para a maior concentração testada (50 µg/mL), a atividade hemolítica foi superior a 3%, enquanto as outras concentrações (25 a 0,1 µg/mL) não ultrapassaram 1% de hemólise; a concentração citotóxica para 50% das células (CC50) LLCMK2 de F4A após 24 h foi de 3,44 µg/mL. Como conclusão, a fração F4A apresentou atividade bactericida contra S. aureus, incluindo atividade antibiofilme. Embora mais estudos sejam necessários em relação à sua toxicidade para células de mamíferos e ensaios in vivo, a fração F4A pode ser promissora para o tratamento de infecções causadas por S. aureus.Item Atividade antimicrobiana de benzoiltioureias em agentes etiológicos de sepse neonatalBiasi-Garbin, Renata Perugini; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Bispo, Marcelle de Lima Ferreira; Tavares, Eliandro Reis; Lopes, Gilselena Kerbauy; Navarro, Miguel Octávio PérezResumo: Sepse neonatal representa importante causa de morbidade e mortalidade em recém-nascidos e Streptococcus agalactiae (Estreptococo do Grupo B - EGB) continua sendo o principal agente etiológico envolvido nessa infecção A dificuldade no diagnóstico e a emergência de isolados resistentes aos antimicrobianos comerciais representam desafio para prevenir esta infecção Considerando as atividades biológicas descritas para compostos contendo o núcleo tioureia, o objetivo deste estudo foi sintetizar e avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de benzoiltioureias contra importantes agentes etiológicos de sepse neonatal e realizar um estudo preliminar de relação estrutura-atividade Uma série de vinte e seis benzoiltioureias com vários substituintes alifáticos e aromáticos na porção tioureia foi apropriadamente sintetizada Posteriormente, a substância que apresentou o melhor potencial antimicrobiano (N-(butilcarbamotioil) benzamida, composto 5, foi modificada através da introdução de diferentes substituintes na porção benzoíla, fornecendo mais três derivados Além disso, o composto 5 foi convertido nos derivados guanidina e ureia correspondentes, com o objetivo de confirmar a importância da fração tioureia para a atividade antimicrobiana Inicialmente, a atividade antimicrobiana dos compostos foi avaliada frente a cepas de referência de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras, pelo ensaio de microdiluição em caldo, e as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram determinadas Entre todos os derivados avaliados, os compostos alifáticos, principalmente 3, 5 e 6, foram mais ativos que os aromáticos contra todas as bactérias e leveduras utilizadas Streptococcus agalactiae ATCC 13813 foi a espécie mais sensível, apresentando valores de CIM de 62,5 µg/mL (5), 125, µg/mL (6) e 5, µg/mL (3), indicando que, para esta espécie, a atividade antibacteriana foi sensível ao comprimento da cadeia alquílica Além disso, a substituição isostérica de enxofre por nitrogênio ou oxigênio não produziu melhora no efeito antimicrobiano contra essa bactéria, sugerindo que o grupo tiouréia poderia ser considerado um grupo farmacóforo Em seguida, a atividade do composto 5 foi avaliada sobre células planctônicas e sésseis de isolados clínicos de EGB O composto 5 inibiu o crescimento de todos os isolados de EGB, com valores de CIM variando de 15,6 µg/mL a 62,5 µg/mL e valores de CBM iguais a 1, µg/mL para todos os isolados, indicando um efeito bacteriostático Este resultado foi corroborado pela análise da curva de morte e microscopia eletrônica de transmissão, que mostraram que o composto 5 na CIM reduziu a população de células planctônicas em aproximadamente 4 a 6 log após 24 h de tratamento e provocou mudanças significativas na ultraestrutura de EGB após 4 horas de incubação Com exceção de três cepas de EGB, o composto 5 na CIM diminuiu a viabilidade da maioria dos biofilmes maduros (24h) de EGB Adicionalmente, o composto 5 apresentou toxicidade seletiva para as cepas de EGB em comparação com seu efeito sobre as células de mamíferos, HeLa e eritrócitos humanos Estes resultados sugerem que o composto 5 apresenta potencial como protótipo para o desenvolvimento de uma nova classe de agentes antimicrobianos contra EGBItem Atividade antimicrobiana e imunomoduladora de benzoiltioureias (RTB02 e RTB62) sobre Trypanosoma cruziFernandes, Bruna Terci; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]; Costa, Ivete Conchon; Tavares, Eliandro ReisResumo: A doença de Chagas é considerada uma das principais doenças negligenciadas do mundo todo, pois afeta principalmente populações em regiões com maior fragilidade social e econômica Estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estão infectadas atualmente por Trypanosoma cruzi, parasito causador da doença O tratamento é limitado a apenas dois fármacos, que causam muitos efeitos colaterais e possuem baixa eficácia, portanto, estudos que buscam novos compostos terapêuticos são necessários para o desenvolvimento de fármacos realmente eficazes para o tratamento da doença Derivados de tioureia têm se mostrado promissores agentes antimicrobianos, suas atividades já foram relatadas como antibacterianos e antifúngicos, mas há poucos estudos como agentes antiprotozoários Por esse motivo, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de duas benzoiltioureias sobre as três formas evolutivas de T cruzi, seu mecanismo de ação e avaliação da citotoxicidade em células mamíferas, além da determinação e quantificação de Óxido Nítrico, Espécies Reativas de Oxigênio e avaliação na expressão de genes envolvidos na imunomodulação Os ensaios mostraram que as duas substâncias inibiram o crescimento das formas flageladas e a proliferação das formas intracelulares de T cruzi Ambas induziram a produção de EROs, peroxidação lipídica e alteração no potencial de membrana que possivelmente levou a morte celular do parasito Não ocorreu aumento no número de corpos lipídicos para RTB2, no entanto, quando epimastigotas foram tratados com RTB62 ocorreu declínio na produção O efeito tripanocida não resultou da produção de EROs e NO por células aderentes do exsudato peritoneal e sim pela ação direta no parasitoItem Atividade antiviral, in vitro, de polissacarídeos obtidos de plantas para o herpes simplex tipo 1 e poliovírusGodoi, Ananda Marques de; Linhares, Rosa Elisa Carvalho [Orientador]; Orsato, Alexandre; Faccin-Galhardi, Ligia Carla; Tavares, Eliandro Reis; Amarante, Marla KarineResumo: As infecções virais estão entre as causas mais frequentes de doenças infecciosas, resultando em constante ameaça para a saúde pública, incentivando a procura de antivirais mais eficientes O vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), família Herpesviridae, compostos por DNA linear de fita dupla, com capsídeo icosaédrico, coberto por envelope lipoproteico, provoca infecções, principalmente na região oral, em todas as faixas etárias, estando presente em 8% dos adultos A droga de escolha para o tratamento do HSV-1 é o aciclovir, porém tem se observado o surgimento de cepas resistentes O poliovírus (PV) pertence à família Picornaviridae é o agente causador da poliomielite, uma doença que atinge gravemente o sistema nervoso, causando paralisia flácida A prevenção da doença é feita através da vacinação e até o momento não há antiviral disponível para tratamento dos pacientes Vários estudos relatam a utilização de produtos naturais com atividade antiviral, incluindo os polissacarídeos O presente trabalho avaliou o efeito antiviral do polissacarídeo de Inga spp (PDT-S) sobre HSV-1 e PV, em células HEp-2 e do polissacarídeo de Myrciaria dubia na forma in natura (AO) e sulfatada (AOS) contra as cepas KOS (sensível ao aciclovir) e AR (resistente ao aciclovir) de HSV-1, em células Vero A citotoxicidade dos polissacarídeos foi analisada pelo método do MTT e a atividade antiviral pelo ensaio de redução de plaque (PRA), utilizando diferentes protocolos de tratamento O valor de CC5 foi de 87 µg/mL para PDT-S, > 5 µg/mL para o AO e 386 µg/mL para o AOS O melhor efeito antiviral, determinado por ensaio de plaque para todos os polissacarídeos e vírus, foi encontrado no tempo horas Para o PDT-S o IC5 foi de 179 µg/mL e 58 µg/mL e índice de seletividade de 5,86 e 15 para o HSV-1 e PV, respectivamente, sugerindo que o PDT-S atua nos estágios iniciais da replicação viral Para o AO o IC5 foi de 32,6 µg/mL e 87 µg/mL e índice de seletividade de 15,34 e 5,74 para as cepas KOS e AR, respectivamente Para o AOS o IC5 foi de 2,6 µg/mL e ,46 µg/mL e índice de seletividade de 187,38 e 839,13 para as cepas KOS e AR Os resultados encontrados para AO e AOS mostraram que a sulfatação melhora a atividade antiviral do polissacarídeo e que não houve diferença significativa entre as cepas utilizadas, e assim como o PDT-S, o AOS atua nas fases iniciais da replicação viral Em conclusão esse trabalho sugere que o PDT-S e AOS são substâncias com atividade antiviral promissora, podendo ser utilizados para o desenvolvimento de novos antiviraisItem Avaliação da atividade antifúngica de produtos do metabolismo secundário de Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia metallica sobre a germinação carpogênica e infecção em feijoeiro por Sclerotinia sclerotiorumEmiliano, Janaina; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Tavares, Eliandro Reis; Pileggi, Marcos; Celligoi, Maria Pedrine Colabone; Cely, Martha Viviana TorresResumo: Sclerotinia sclerotiorum (Lib) De Bary é um fungo fitopatogênico filamentoso conhecido como mofo branco O fungo produz estruturas de resistência chamadas escleródios, que podem permanecer viáveis no solo por anos O manejo da doença é baseado na rotação de culturas e no uso de fungicidas, os quais contaminam o meio ambiente e selecionam isolados resistentes Portanto, o desenvolvimento de novos produtos de origem natural para o controle desse fitopatógeno é importante Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito antifúngico de moléculas bioativas produzidas por Pseudomonas aeruginosa cepa LV e Burkholderia metallica cepa RV7S3 sobre a germinação carpogênica de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum e seu potencial para o controle da infecção em feijoeiro A fração com atividade antifúngica produzida pela cepa LV foi denominada F4A, e as frações produzidas pela cepa RV7S3 foram denominadas FD e FRV7 Esta última é uma fração semi-purificada a partir de FD, e apesar de ter efeito antifúngico com baixas concentrações em testes in vitro de ágar difusão, apresenta baixo rendimento, portanto não foi utilizada em testes com gerbox e casa de vegetação Escleródios produzidos em substrato à base de cenoura foram inoculados em gerbox e tratados com F4A e FD separadamente Ao final de 55 dias de incubação, foi possível observar inibição crescente da germinação carpogênica dos escleródios, com 1% de inibição nos gerbox tratados com as frações Folhas destacadas de feijoeiro foram infectadas com S sclerotiorum e tratadas com as moléculas bioativas Ambas as frações controlaram o desenvolvimento do fungo, no entanto, F4A a pesar de impedir a infecção fúngica, apresentou fitotoxicidade nas folhas tratadas, portanto os testes em casa de vegetação foram realizados apenas com a fração FD produzida por B metallica cepa RV7S3 Plantas de feijão foram infectadas com mofo branco e realizado tratamento preventivo+curativo com a aplicação de FD, mantendo 4% das plantas viáveis sem causar fitotoxicidade e impedindo o desenvolvimento fúngico A fração F4A apresenta potencial para o controle de S sclerotiorum, no entanto novas estratégias para diminuir a fitotoxicidade devem ser consideradas O tratamento com os metabólitos secundários produzidos pela cepa RV7S3 apresentaram efeito antifúngico sem causar danos na planta, no entanto estudos futuros precisam ser realizados para otimizar a produção e aumentar o rendimento da fração FRV7, pois esta possivelmente apresentaria maior porcentagem de sobrevivência de plantas em concentrações menores de produtoItem Avaliação da reativação do citomegalovírus em pacientes com sepseSilva, Taylon Felipe; Conchon-Costa, Ivete [Orientador]; Simão, Andréa Name Colado; Tavares, Eliandro ReisResumo: A sepse é uma síndrome patológica com anormalidades bioquímicas induzida por infecção É definida como uma disfunção orgânica com ameaça iminente a vida desencadeada por uma resposta do hospedeiro desregulada frente a uma infecção É caracterizada por uma reposta heterogênea do hospedeiro frente a um patógeno, amplificada por diversos fatores endógenos que ativam precocemente respostas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias de forma compensatória O Citomegalovírus Humano (CMV)ou Betaherpesvirus Humano tipo 5, pode ser transmitido por diversassecreções corporais A infecção pelo CMV acomete ,5 a 1,% de todos os recém-nascidos e a soroprevalência em algumas regiões desenvolvidas, como França eAlemanha, variam de 4 a 6%, enquanto as populações em desenvolvimento podemvariar de 8 a 1% A reativação do CMV tem sido amplamente associada à sepsebacteriana, e provavelmente resulta do processo inflamatório característico dessequadro A reativação ocorre em aproximadamente 3%dos indivíduos com sepse semimunossupressão Está associada com uma maior permanência de pacientes nasUTIs, prolongamento da necessidade de ventilação mecânica e aumento de mais de8% da taxa de mortalidade Além disso, a reativação de CMV em pacientes comquadro de sepse já foi descrita como sendo fator de pior prognóstico clínico, comaumento significativo de morbimortalidade, estando diretamente associado comdisfunção orgânica severa e desequilíbrio hemodinâmico Os objetivos deste trabalhoforam identificar quais fatores imunobiológicos e clínicos relacionados a reativação docitomegalovírus que poderiam estar envolvidos na disfunção orgânica presente nasepse e sua relação com o prognóstico e desfecho clínico destes pacientes Este éum estudo de coorte prospectivo observacional realizado no Hospital Universitário deLondrina, Paraná, Brasil (HU-UEL) entre maio e outubro de 217, que avalia areativação do CMV em pacientes diagnosticados com sepse Os pacientesdiagnosticados com sepse a no máximo sete dias e que eram sorologicamentepositivos para IgG anti-CMV foram incluídos para participarem do estudo No períododo estudo 168 pacientes foram diagnosticados com sepse e avaliados quanto aoscritérios de inclusão e exclusão, 56 fizeram parte deste estudo e destes 1 (17,58%) apresentavam carga viral condizente com o processo de reativação do CMVVerificamos aumento nos níveis plasmáticos de oxido nítrico e interleucina 1(p<,1) no grupo reativado Houve ainda aumento significativo de creatinina séricae redução do débito urinário de 24 horas correlacionados com IL-1 e carga viral doCMV, demonstrando uma associação entre o processo de reativação e insuficiênciarenal presente na sepse O grupo reativado ainda apresentou 2,1 vezes mais risco dedesenvolver choque séptico e até 2,5 vezes mais risco em 28 dias de mortalidade Areativação do CMV pode aumentar as taxas de mortalidade entre pacientes com sepsee nossos dados sugerem que IL-1 e NO possam estar envolvidos neste processoItem Caracterização de Staphylococcus aureus isolados de infecções invasivas em um hospital universitário do Sul do BrasilSilva, Raquel Soares da; Yamada-Ogatta, Sueli Fumie [Orientador]; Tavares, Eliandro Reis; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Perugini, Marcia Regina Eches [Coorientadora]Resumo: Introdução: Staphylococcus aureus é um importante agente colonizador de mucosas em humanos e animais Em condições predisponentes pode causar infecções leves e graves A presença de alguns fatores de virulência colabora para que seja uma bactéria potencialmente letal A Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) é um importante fator de virulência por causar a pneumonia necrotizante em infecções adquiridas na comunidade Com a mistura de nichos, microrganismos de hospital e comunidade, não tem mais um perfil bem definido, portanto a troca genes de resistência e virulência tem tornado os microrganismos cada dia mais resistentes e mais virulentos Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de S aureus isolados de materiais clínicos provenientes de infecções invasivas Materiais e métodos: Foram avaliados isolados de S aureus provenientes de amostras clínicas de infecções invasivas Por metodologia automatizada foi determinado o perfil de sensibilidade dos isolados Por PCR foi determinada a presença dos genes mecA, tst, LukS-PV e LukF-PV além da tipagem SCCmec para isolados mecA positivos Resultados: Pode-se observar resistência à penicilina (98,%), eritromicina (72,4%), oxacilina (69,4%), clindamicina (69,4%), ciprofloxacina (57,1%), gentamicina (8,2%), sulfametoxazol+trimetoprim (6,1%) e rifampicina (5,1%) Todos isolados foram sensíveis à linezolida e à tigeciclina e um isolado foi susceptível a todos antimicrobianos A presença do gene mecA foi observada em 64 isolados (65,3%), destes a prevalência de SCCmec foi: I (6,3%), II (62,5%), III (6,3%), IV (18,6%), V (3,1%), VI (1,6%) e Não Tipável (1,6%) A presença dos genes de virulência foi de 99% para icaA, 5% para lukS-PV/lukF-PV e 27,6% para tst Conclusão: Este estudo encontrou uma alta prevalência de S aureus multirresistente com a presença dos genes de virulência da Leucocidina de Paton-Valentine (PVL) e da toxina da Síndrome do Choque Tóxico (TSST)Item Caracterização do biofilme formado por Cryptococcus gattii utilizando abordagens fenotípicas e molecularesTavares, Eliandro Reis; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Ishida, Kelly; Lopes, Fabrício Martins; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, pertencentes aos complexos C gattii sensu lato (sl) e C neoformans sensu lato (sl) Esta enfermidade constitui-se em uma das principais causas de morbidade e mortalidade de indivíduos imunocomprometidos, principalmente aqueles portadores de HIV/AIDS Entretanto, esses patógenos também são agentes oportunistas importantes em pacientes com câncer e naqueles que se submetem às terapias imunossupressoras, procedimentos médicos invasivos ou utilizam antibióticos de amplo espectro Além disso, relatos de criptococoses em indivíduos imunocompetentes têm emergido mundialmente Embora não seja um fator de virulência clássico, a capacidade de formar biofilme tem contribuído consideravelmente na virulência de muitas espécies de fungos, sendo relacionado com a persistência de infecções e diminuição da sensibilidade aos agentes antimicrobianos Apesar da importância de C gattii sl na perspectiva clínica, o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na formação de biofilme por este complexo é escasso Diante disso, este trabalho teve como objetivo determinar a capacidade de formação de biofilme por C gattii sl, a caracterização fenotípica e a identificação de possíveis genes envolvidos no seu desenvolvimento A capacidade de formação do biofilme foi avaliada em superfície de poliestireno a 37 ºC por 48 horas em isolados clínicos e ambientais de C gattii sl, e a biomassa foi determinada por coloração com cristal violeta A cinética do desenvolvimento do biofilme foi determinada em superfície de poliestireno e vidro nos tempos de 6, 12, 48, 72 e 96 horas por C gattii ATCC 2465, determinada pela quantificação da biomassa e da atividade metabólica, por cristal violeta e redução do XTT, respectivamente A estrutura do biofilme foi determinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de varredura confocal a laser (MVCL) Para a identificação de genes envolvidos na formação do biofilme, C gattii ATCC 2465 foi incubado a 37 ºC por 48 horas, e utilizado para obtenção do RNA para determinar o perfil transcricional durante o desenvolvimento do biofilme por sequenciamento de RNA (RNA-seq) Nossos resultados mostraram que C gattii sl apresenta a capacidade de formar biofilme em diferentes superfícies; além disso, a cinética da formação apresentou um aumento exponencial da biomassa entre os tempos de incubação de 24 e 96 horas, enquanto que a atividade metabólica teve o seu aumento entre 24 e 72 horas Os resultados de MEV mostraram que entre e 12 horas as células leveduriformes encontraram-se aderidas à superfície, com aumento gradativo de densidade celular; em 24 horas houve o início da formação de matriz exopolissacarídica (EPS); e em 96 horas o biofilme apresentou-se como agregado celular embebidos na EPS Imagens de MCLV, em 72 horas de incubação, mostraram o biofilme como uma monocamada de 8 micrômetros de espessura, composto por células metabolicamente ativas envoltas pela EPS A avaliação do perfil transcricional, após o tratamento estatístico, mostrou um total de 321 genes diferencialmente expressos durante a formação do biofilme Destes, 98 genes apresentaram-se como hiperexpressos, enquanto 223 estavam subexpresso Dos 98 genes, com expressão aumentada, após análise das possíveis funções, 38 corresponderam a proteínas não caracterizadas, 35 corresponderam a proteínas ribossomais e proteínas componentes da estrutura do ribossomo e 25 corresponderam a proteínas caracterizadas Sendo assim, nossos resultados mostraram que, além da capacidade de formar biofilme, o complexo C gattii sl apresenta um aparato de regulação consistente, indicando centenas de genes envolvidos no desenvolvimento desta estruturaItem Colonização por Streptococcus agalactiae em gestantes e formulação de hidrogel para controle de infecção neonatalMorguette, Ana Elisa Belotto; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Tavares, Eliandro ReisResumo: Streptococcus agalactiae (Estreptococo do Grupo B - EGB), é uma bactéria Gram-positiva e ß-hemolítica que pode estar presente na microbiota do trato gastrintestinal e genital dos seres humanos A colonização da mucosa vaginal de gestantes é um fator de risco importante para o desenvolvimento de infecções neonatais por EGB A implantação da antibioticoterapia intraparto (API) para mulheres colonizadas contribuiu para a redução dessas infecções Entretanto, houve aumento de isolados resistentes aos antimicrobianos de escolha para API Assim, o monitoramento da colonização de gestantes por EGB, bem como estudos de novas substâncias antimicrobianas com potencial para prevenção da transmissão da bactéria são medidas importantes para o controle das infecções por EGB O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de EGB isolados de gestantes atendidas no Hospital Universitário de Londrina (HUL) e desenvolver um hidrogel enriquecido com óleo extraído da planta Copaifera officinalis (óleo de copaíba) com atividade antimicrobiana contra EGB Foi realizado um estudo retrospectivo com 291 gestantes atendidas no HUL para determinar a prevalência de colonização vaginal-retal e o perfil de sensibilidade de EGB aos antimicrobianos utilizados na API A prevalência de colonização por EGB foi de 18,2%, e ,4%, 1,2% e 1% dos isolados foram resistentes à penicilina, eritromicina e clindamicina, respectivamente Estes resultados destacam a importância de vigilância contínua da colonização por EGB em gestantes para a prevenção de infecções em neonatos Para avaliar a atividade antimicrobiana do óleo de copaíba sobre EGB, a Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada pelo método de microdiluição em caldo de acordo com as recomendações do CLSI e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) foi considerada aquela que apresentou 99,9% de inibição na contagem de unidades formadoras de colônia (UFC), comparado com um controle de crescimento não tratado Foram desenvolvidas seis formulações de hidrogel com três diferentes polímeros, contendo ,5% (p/p) e 1,% (p/p) de óleo de copaíba, e todas foram testadas sobre as células planctônicas de EGB sensíveis e resistentes à eritromicina e/ou clindamicina Testes físico-químicos para determinação do pH, densidade e viscosidade também foram realizados A cinética do tempo de morte foi avaliada durante o tratamento das células planctônicas com as concentrações CIM e CBM; na presença da formulação base; e na presença da formulação acrescida de óleo de copaíba durante 24 horas Após o tratamento com óleo de copaíba e com o hidrogel, alterações morfológicas de células planctônicas de EGB foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura A toxicidade da formulação foi avaliada em mucosa cervicovaginal de camundongos BALB/c fêmeas após 24 horas de tratamento com a formulação base e com o hidrogel de óleo de copaíba Os valores da CIM e CBM para o óleo de copaíba variaram de ,3 a ,6 mg/mL e ,6 a ,12 mg/mL, respectivamente; e apenas o hidrogel contendo carbômero 94® com 1,% (p/p) de óleo de copaíba foi capaz de inibir o crescimento de todos os isolados Após 12 e 8 horas de incubação, nenhuma UFC foi detectada na presença da CBM do óleo de copaíba e do hidrogel, respectivamente Ambos os tratamentos promoveram alterações morfológicas, como lise da parede celular e liberação de conteúdo citoplasmático, comparado com controle não tratado e tratado com a formulação base Nenhum dano à estrutura ou infiltrado inflamatório na mucosa cervicovaginal dos animais foram observados após tratamento com o hidrogel e com a formulação base Os resultados mostram a atividade antimicrobiana do óleo de C officinalis contra EGB e essa atividade é mantida em formulação a base de carbômero, indicando seu potencial para a utilização na prevenção da transmissão de EGB aos recém-nascidosItem Diferenciação entre Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans utilizando a região do espaço intergênico 1 (IGS1) do DNA ribossomal por PCR em tempo realTavares, Eliandro Reis; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]; Barros, Tânia Fraga de; Venâncio, Emerson JoséResumo: A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado principalmente entre pacientes portadores de HIV A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo C neoformans e C gattii as espécies clinicamente mais importantes Estas acometem principalmente pacientes imunossuprimidos, entretanto C gattii pode causar doença também em indivíduos imunocompetentes Neste trabalho foi padronizada uma reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para a identificação de C neoformans e C gattii tendo como alvo a região IGS1 (intergenic spacer 1) do rDNA Sequências correspondentes à região IGS1 de C gatti e C neoformans foram buscadas no GenBank e, após a análise, foi deduzida as sequências consensos, utilizadas para a síntese dos oligonucleotídeos iniciadores CnIGS1-F e CnIGS1-R, e CgIGS1-F e CgIGS1-R específicos para C neoformans e C gattii, respectivamente As cepas C neoformans ATCC 6631 e C gattii ATCC 5699 foram utilizadas como referência para os ensaios Inicialmente, o DNA genômico foi obtido de céluas em fase de crescimento exponencial, e quantificado por espectrometria a 26/28 nm A reação foi realizada usando 1 ng de DNA como molde, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, oligonucleotídeos iniciadores; as amostras foram corridas em um termociclador Rotor Gene 6 As curvas de dissociação (melting curve) foram geradas em ambas as corridas, entre 6° C e 95° C, com um aumento de ,5 °/segundo, para observação dos picos de dissociação Os resultados mostraram dois diferentes picos de dissociação: 82,8 °C e 84,2 °C para C gattii e C neoformans, respectivamente Não foi observada amplificação quando DNA total, de C albicans, C tropicalis, C dubliniensis, H capsulatum, T rubrum, S schenckii, P brasiliensis ou H sapiens foi utilizada na PCR Em conclusão, a amplificação por PCR em tempo real foi específica, permitindo a identificação de ambos os fungos, mostrando que a região IGS1 apresenta polimorfismo, podendo ser usada como um marcador molecular Assim, os oligonucleotídeos iniciadores desenhados podem ser utilizados na identificação de C neoformans e C gattiiItem Efeito antifúngico da casca de Poincianella pluviosa e fluconazol sobre células planctônicas e sésseis de Candida sppSantos, Pollyana Myrella Capela dos; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]; Botelho, Natália de Souza; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Morey, Alexandre Tadachi; Tavares, Eliandro ReisResumo: Candida spp são leveduras comensais que em situações de imunossupressão podem causar desde infecções superficiais até quadros sistêmicos graves O fluconazol age inibindo a via de biossíntese do ergosterol e é considerado o fármaco de escolha para o tratamento de candidíases, entretanto, a frequente seleção de cepas dose-dependentes ou resistentes é uma limitação que necessita ainda ser superada Nesse sentido, estudos de compostos obtidos a partir de plantas apresentam-se promissores devido à sua ampla disponibilidade e fácil acesso Poincianella pluviosa são leguminosas amplamente distribuídas na Caatinga e detentoras de inúmeras propriedades terapêuticas, como atividade anti-inflamatória e antioxidante Tendo em vista a urgência na busca de novas substâncias antimicrobianas, atrelada à necessidade de redução da probabilidade de seleção de cepas resistentes, esse trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antifúngico do extrato da casca de P pluviosa (sibipiruna), isolado e em combinação com fluconazol, sobre células planctônicas e sésseis de diferentes espécies de Candida spp Inicialmente, os perfis de sensibilidade de diferentes frações do extrato foram determinados para as células planctônicas de 5 cepas ATCC e 16 isolados clínicos obtidos a partir de múltiplos sítios anatômicos A concentração inibitória mínima foi determinada pelo teste de microdiluição em caldo e variou entre <1,9 e >1 µg/mL para o extrato bruto e entre <1,9 a 5 µg/mL para a fração acetato de etila (FAE), que, por exibir melhor perfil de sensibilidade, foi selecionada para as análises subsequentes O extrato exibiu ação fungistática para todas as espécies, alterando a curva de crescimento das células planctônicas em comparação ao grupo controle nas concentrações de CIM e 2X CIM durante 24 horas de tratamento Para o ensaio de adesão, as leveduras foram cultivadas na presença do extrato nos valores de ½ CIM, CIM e 2X CIM, e a biomassa das células aderidas determinada através da coloração com cristal violeta O tratamento promoveu a redução na capacidade de adesão de todos isolados com valores que variaram entre 14 e 64,7%, sendo estatisticamente significantes em todas as concentrações para as espécies C albicans e C parapsilosis O efeito sobre as células sésseis foi avaliado durante a fase de formação e sobre o biofilme maduro A porcentagem de redução das células metabolicamente ativas variou entre 33,7 e 84,7% para a fase inicial de formação, e entre 2,1 e 79% para o biofilme formado, sendo os melhores resultados observados para C krusei e C albicans, respectivamente O efeito da combinação entre a FAE e o fluconazol foi realizado pelo método de checkerboard e mostrou efeito sinérgico para células planctônicas de C albicans, C glabrata, C krusei e C parapsilosis O mesmo tratamento resultou em efeito sinérgico sobre a fase de formação do biofilme das espécies C albicans, C glabrata e C krusei, mas apenas sobre C glabrata quando analisada sobre o biofilme já formado Esses resultados indicam o potencial antifúngico da fração acetato do extrato da casca de P pluviosa e da sua combinação com o fluconazol, apresentam-se como uma promissora fonte de pesquisa para novas moléculas e tratamentos alternativos de candidíasesItem Efeito antifúngico do extrato da casca de Poincianella pluviosa e sinergismo com anfotericina B sobre Cryptococcus sppAndriani, Gabriella Maria; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Tavares, Eliandro Reis; Santos, Pollyana Myrella Capela dos; Faccin-Galhardi, Ligia Carla; Tavares, Eliandro Reis [Coorientador]Resumo: As leveduras dos complexos Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são agentes etiológicos da criptococose, doença invasiva e potencialmente fatal em indivíduos imunossuprimidos e imunocompetentes A anfotericina B é o fármaco de escolha, no entanto, seu caráter tóxico dificulta a sua utilização em períodos prolongados, enquanto que outros antifúngicos disponíveis mostram-se menos efetivos Além disso, sabe-se que há um progressivo relato de cepas resistentes às terapias consolidadas Neste contexto, os produtos naturais constituem-se em fontes promissoras para o isolamento de novas moléculas antimicrobianas Estudos com as leguminosas do gênero Poincianella mostraram inúmeras propriedades biológicas, como atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antifúngico do extrato da casca de P pluviosa (sibipiruna) e sua combinação com antifúngicos comerciais sobre células planctônicas e sésseis de cepas de referência e isolados clínicos dos complexos C gattii e C neoformans A concentração inibitória mínima (CIM) do extrato bruto (EB), fração etil acetato (FAc) e fração FC (FC) foi determinada pelo método de microdiluição em caldo e a concentração fungicida mínima (CFM) considerada aquela capaz de inibir 1% a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC), comparado com um controle de crescimento não tratado A CIM para EB variou de 62,25 a >1 µg/mL, FC 15,62 a >1 µg/mL e FAc 31,25 a >1 µg/mL, que, por exibir melhor perfil de sensibilidade, foi selecionada para as análises subsequentes O efeito da combinação entre a FAc e os antifúngicos comerciais fluconazol e anfotericina B foi realizado pelo método de checkerboard e os resultados interpretados utilizando o Índice da Concentração Inibitória Fracionária (FICI) A combinação entre fluconazol e FAc foi considerada sinérgica somente para C neoformans ATCC 6631 e C neoformans IV A combinação entre anfotericina B e FAc mostrou-se sinérgica para todas as cepas testadas, C gattii ATCC 2465, C gattii II, C neoformans ATCC 6631 e C neoformans IV, com FICI de ,34; ,125, ,69 e ,34 respectivamente e por esse motivo foi escolhida para os demais experimentos A cinética do tempo de morte das células planctônicas em presença da CIM de FAc sozinha e em combinação com o antifúngico foi analisada durante 72 horas, exibindo ação fungistática para todos os isolados testados O efeito inibitório de FAc sozinha e em combinação com anfotericina B foi também avaliado durante a fase de formação e sobre o biofilme maduro, resultando em inibição significativa da atividade metabólica A maior porcentagem de inibição foi observada para C gattii ATCC 2465 na fase inicial de formação (57,93%) e sobre o biofilme formado (68,1%), seguido por C neoformans ATCC 6631 (24,3 – 36,2%) A combinação com anfotericina B teve efeito sinérgico sobre as duas cepas somente na fase de formação do biofilme, com redução dos valores de SCIM superior a 16 vezes Esses resultados indicam o potencial antifúngico da FAc da casca de P pluviosa sozinha e em combinação com anfotericina B Esta planta pode ser uma fonte importante de novas moléculas com atividade antifúngica para formulação de produtos e utilização em tratamentos da criptococoseItem Enterococcus faecium resistente à vancomicina isolado de infecção urinária : formação de biofilme e genomaSilva, Lucas Fernando da; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Kian, Danielle; Tavares, Eliandro Reis; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Botelho, Natália de Souza; Morey, Alexandre Tadachi [Coorientador]Resumo: Enterococcus são cocos Gram-positivos, comensais em humanos e animais, sendo também encontrados em solo, água e alimentos No entanto, algumas cepas possuem diferentes fatores de virulência e podem causar infecções Atualmente os enterococos estão entre as principais causas de infecções, especialmente em ambientes de assistência à saúde, comumente associadas ao uso de cateteres, à alta morbidade e mortalidade Enterococcus faecium destaca-se enquanto patógeno devido a sua resistência a vários antimicrobianos, inclusive à vancomicina (VREfm: Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium), além de sua capacidade de recombinações genéticas e de formar biofilme em superfícies bióticas e abióticas Neste trabalho foi analisado o perfil de formação de biofilme de um isolado clínico de VREfm, em poliestireno e vidro, e realizado o sequenciamento, montagem e anotação do seu genoma A produção de biomassa (coloração com cristal violeta) e a atividade metabólica (redução de XTT) sugerem que o isolado é capaz de aderir rapidamente à superfície de poliestireno e que o período entre 12 e 24 horas compreende a etapa de maior multiplicação microbiana e formação de biofilme As imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura revelaram aumento da densidade celular e alterações no agrupamento das células ao decorrer do tempo, de maneira semelhante em poliestireno e vidro O sequenciamento do genoma revelou a ocorrência de genes relacionados com: resistência a determinados antimicrobianos (eritromicina, estreptotricina, fluoroquinolonas, glicopeptídeos e quaternário de amônio), bombas de efluxo de múltiplos antimicrobianos, beta-lactamases, proteínas de ligação à penicilina, multi-resistência; adesão e formação de biofilme (acm, efafm e esp), autoindutores de quorum-sensing, promotores de agregação (agr); evasão do sistema imune (Leucine-rich protein), invasão de tecidos (hemolisina), capacidade de causar peritonite e endocardite (serina-protease e sortases), e outros associados com patogenicidade Os resultados correlacionaram os genótipos da cepa em relação à capacidade de adesão e formação de biofilme, além da presença de fatores relacionados com resistência e patogenicidade, reforçando a relevância deste clone do ponto de vista clínicoItem Estratégias para o controle de infecções causadas por Streptococcus agalactiaeOtaguiri, Eliane Saori; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Gionco, Bárbara; Tavares, Eliandro Reis; Kerbauy, Gilselena; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: Streptococcus agalactiae ou estreptococos do grupo B (EGB) de Lancefield continua sendo uma das principais causas de infecções invasivas e potencialmente fatais em recém-nascidos em todo o mundo, apesar da antibioticoterapia profilática intraparto (API) O objetivo principal deste estudo foi analisar estratégias alternativas para o controle de infecções neonatais por EGB Inicialmente, um ensaio de multiplex PCR em tempo real baseado em curva de melting foi padronizado para detecção simultânea de EGB e marcadores de resistência a macrolídeos e lincosamidas diretamente de swab vaginal-retal Oligonucleotídeos iniciadores específicos e complementares aos genes cfb (codifica para fator CAMP), erm(A) e erm(B) (codificam para metilases) e mef(A) (codifica para bomba de efluxo) foram desenhados a partir de sequências nucleotídicas de EGB depositadas em bancos de dados públicos O ensaio de multiplex PCR apresentou 1% de especificidade e um limite de detecção de 14 unidades formadoras de colônias equivalentes por reação A prevalência de colonização de EGB entre a população estudada foi de 157% (16/12) com base nos resultados de cultura positiva e do multiplex PCR em tempo real Entre os isolados de EGB, somente dois apresentaram resistência aos antimicrobianos, tanto pelo método fenotípico quanto molecular Também foi avaliado pela primeira vez o efeito do oleoresina obtido de Copaifera multijuga Hayne (óleo de copaíba) isoladamente ou em combinação com nanopartículas de prata produzidas metabólitos de Fusarium oxysporum (AgNPbio) contra célula planctônica e séssil de isolados de EGB O óleo de copaíba apresentou atividade bactericida dose-dependente em células planctônicas de EGB, incluindo aqueles resistentes à eritromicina ou clindamicina Análises de microscopia eletrônica de transmissão e varredura de células planctônicas tratadas com o óleo de copaíba apresentaram ruptura de parede celular com extravazamento de conteúdo citoplasmático Este composto também apresentou atividade antibacteriana sobre biofilmes de EGB, inibindo sua formação, bem como a viabilidade de biofilmes maduros Além disso, a combinação do óleo de copaíba com AgNPbio resultou em efeito sinérgico em células planctônicas e na formação de biofilme, reduzindo significativamente os valores de concentração inibitória mínima de ambos os compostos Os resultados obtidos neste estudo mostram que a multiplex PCR em tempo real é um ensaio rápido, acessível e sensível, adequado para detecção direta de EGB e marcadores de resistência à eritromicina ou clindamicina diretamente em swabs vaginal-retal Adicionalmente, revelam o potencial do óleo de copaíba, sozinho ou em combinação com AgNPbio, para o desenvolvimento de novas formulações farmacêuticas para o controle de colonização e infecções por EGBItem Potencial de virulência de leveduras dos complexos C. neoformans e C. gattii isoladas de excretas de aves da cidade de Londrina, ParanáAzevedo, Caroline Souza; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]; Panagio, Luciano Aparecido; Tavares, Eliandro ReisResumo: A cidade de Londrina, localizada no norte do Paraná, tem uma grande concentração de pombos no ambiente urbano, cuja presença está relacionada a transmissão de doenças, como a criptococose, infecção causada por leveduras do gênero Cryptococcus que podem estar presentes nas excretas de aves A fim de caracterizar os fungos presentes na cidade, este trabalho teve por objetivo isolar, identificar e caracterizar os perfis de virulência e sensibilidade aos antifúngicos de Cryptococcus spp isolados de excretas de aves da cidade de Londrina, PR Foram coletadas 1 amostras de excretas de aves, em quatro locais na cidade, que foram processadas, inoculadas em Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol e incubadas a 28 ºC por até 7 dias As colônias leveduriformes foram isoladas e identificadas como Cryptococcus spp por visualização da cápsula através da coloração negativa com tinta da China A identificação da espécie foi realizada através de testes fenotípicos e moleculares Foram realizadas a tipagem molecular dos isolados por PCR-RFLP do gene URA5 e identificação do mating type por PCR Foram realizados testes fenotípicos de avaliação das amostras produtoras de urease, fosfolipase, melanina e formação de biofilme Foi avaliado o perfil de sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e anfotericina B por microdiluição em caldo Foi avaliada a sobrevida de camundongos BALB/c após a infecção por quatro isolados de C neoformans Das cem amostras coletadas, 47% apresentaram crescimento de Cryptococcus spp De acordo com a identificação fenotípica, 68% dos isolados foram identificados como complexo C neoformans e 32% como complexo C gattii; já na identificação molecular foram 57,4% complexo C neoformans e 42,6% complexo C gattii Essa diferença deve-se a maior especificidade dos testes moleculares A tipagem molecular apresentou 31,9% dos isolados tipo VNI, 25,5% VNIII, 4,5% VGI e 2,1% VGII 82,9% dos isolados foram identificados como MATa e 17,1% MATa A produção de urease foi observada em 89,4% dos isolados e de melanina em 31,9% Os isolados apresentaram índice Pz médio de ,61±,11, classificados como produtores intermediários de fosfolipase Quanto a formação de biofilme, as leituras oscilaram entre ,2±,3 e 1,7±,28 A maioria dos isolados foram sensíveis ao fluconazol, 2,1% dos isolados foram resistentes (CIM > 8 µg/mL), enquanto 19,1% foram resistentes a anfotericina B (CIM > 1 µg/mL) Na avaliação da virulência, os animais foram acompanhados por 1 dias, e a infecção não foi letal Este trabalho demonstra que os isolados de Cryptococcus spp encontrados nas excretas de aves de Londrina têm capacidade de produzir diversos fatores de virulência, e alguns também apresentaram resistência à anfotericina B, um dado importante visto que essa resistência é pouco comum Este trabalho mostrou o isolamento, identificação e a caracterização de virulência e do perfil de sensibilidade de Cryptococcus spp isolados de excretas de aves da cidade de Londrina, Paraná, Brasil