02 - Mestrado - Patologia Experimental

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Efeitos do tratamento isolado e combinado de aspirina e benznidazol sobre lesões neuronais mioentéricas observadas no modelo murino da doença de Chagas
(2020-04-27) Dionisio, Joyce Hellen Ribeiro; Araújo, Eduardo José de Almeida; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Ceravolo, Graziela Scalianti
A Doença de Chagas (DC) é a manifestação clínica causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. As manifestações clínicas da DC são características da fase crônica. Dos indivíduos infectados pelo T.cruzi, de 30- 40% evoluem para a fase crônica, podendo apresentar manifestações cardíacas ou digestivas. O megaesôfago e o megacólon são as maiores causas de morbidade na forma clínica digestiva da DC crônica. A forma digestiva da DC é caracterizada por alterações na função motora, secretória e absortiva do trato gastrointestinal, resultante de lesões no plexo mioentérico, um dos principais componentes do Sistema Nervoso Entérico (SNE). Para que ocorram as lesões no plexo mioentérico e desenvolvimento das manifestações digestivas, estudos indicam a existência de mecanismos mistos, com participação direta do parasita e reações autoimunes. Existem no mercado dois fármacos para o tratamento da DC: Benznidazol (BZN) e Nifurtimox. O BZN é o fármaco de primeira escolha para o tratamento da DC. Esse medicamento apresenta eficácia limitada dependendo da fase da doença, além de apresentar efeitos adversos, que muito frequentemente, levam à interrupção do tratamento pelo paciente. A ação desse fármaco está relacionada a danos em macromoléculas do parasito, como o DNA. Durante a fase crônica da DC, os danos teciduais observados no hospedeiro são decorrentes da resposta inflamatória, e não da presença do parasito nas lesões, sendo a utilização de anti-inflamatórios uma estratégia para controle das alterações crônicas na DC. Neste sentido, estudos têm demonstrado que a utilização de baixas doses de anti-inflamatórios, como a aspirina (ASA), tem apresentado bons resultados no controle do parasito, além de neuropreservação. O objetivo desse estudo foi avaliar a eficácia do tratamento isolado e combinado do BZN e ASA sobre neurônios do plexo mioentérico de camundongos infectados com T. cruzi. Para isso, camundongos machos BALB/c foram distribuídos em cinco grupos (n=5): controle, infectado sem tratamento, infectado+ASA, infectado+BZN e infectado+ASA+BZN. Os camundongos foram infectados por via intraperitoneal, com 5x102 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y de T. cruzi (CEUA/UEL nº03/2019). Quarenta e oito horas após a infecção, os tratamentos foram iniciados e tiveram duração de trinta dias. A dose de ASA e BZN foi de 25mg/kg/dia via gavagem. A parasitemia foi avaliada em dias alternados a partir 2º dia pós infecção, por um período de 31 dias. Os animais foram submetidos a eutanásia 180 dias após a infecção e, durante esse período, a taxa de sobrevida foi avaliada. Foram avaliados o comprimento e largura do cólon dos camundongos, para posterior cálculo da área do órgão. As amostras de cólon foram submetidas a técnica de imunofluorescência para marcação da população neuronal mioentérica geral (PGP9.5+), colinérgica (ChAT+) e nitrérgica (nNOS+). Contou-se o número total de células presentes em 32 imagens microscópicas advindas de cada animal. A área do cólon de todos os animais infectados pelo T.cruzi encontrava-se maior quando comparada a de camundongos não infectados. A parasitemia comprova a infecção pelo T.cruzi. A ASA administrada de forma isolada não foi capaz de controlar de forma eficiente a parasitemia, pois apresentou comportamento semelhante aos animais infectados sem tratamento. O grupo infectado+BZN e infectado+ASA+BZN apresentaram parasitemia semelhante, com baixo pico parasitêmico ao 7º dia pós infecção. Os animais dos grupos infectados+BZN e infectados+ASA+BZN apresentaram taxa de sobrevida semelhantes ao grupo sem infecção. A densidade populacional de neurônios gerais e colinérgicos estava diminuída nos animais infectados sem tratamento, mesmo após aplicar fator de correção devido ao aumento da área colônica. Essa mesma redução foi observada nos grupos infectados+ASA e infectados+BZN, quando comparados ao grupo controle. Os animais infectados+ASA+BZN apresentaram preservação para população neuronal geral e subpopulação colinérgica. A subpopulação nitrérgica apresentou redução numérica nos animais infectados sem tratamento e infectados+BZN, quando consideradas as amostras avaliadas. Os grupos infectados+ASA e infectados+ASA+BZN se mostrou preservada nessas amostras. Porém quando aplicamos o fator de correção para a área do órgão, observou-se que a subpopulação nitrérgica não foi alterada em nenhum dos grupos avaliados. Durante a infecção ocorreu alteração morfológica nos corpos celulares dos neurônios. A subpopulação neuronal nitrérgica dos camundongos pertencentes aos grupos infectados sem tratamento, infectados+ASA e infectados+ASA+BZN encontrava-se hipertrofiada quando comparada a do grupo controle. Já nos camundongos infectados tratados com BZN, observou-se atrofia do corpo celular. Em relação aos neurônios colinérgicos, somente o grupo infectado+ASA apresentou alteração morfométrica (hipertrofia) do corpo celular. A neuropreservação promovida pela combinação ASA+BZN se mostrou superior aos tratamentos administrados de forma isolada, também sendo capaz de promover sobrevida dos camundongos BALB/c infectados com T. cruzi.
Envolvimento do estresse nitro-oxidativo durante a progressão da metástase pulmonar experimental de melanoma murino
Melo, Gabriella Pasqual; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Araújo, Eduardo José de Almeida; Prado, Sara Santos Bernardes Real
Resumo: O melanoma é o mais grave dos cânceres de pele devido a sua alta capacidade invasiva Uma vez que o desequilíbrio redox pode modular o comportamento celular, influenciando a resposta do hospedeiro, bem como o crescimento tumoral e sabendo que o melanoma é um câncer altamente sensível a essas mudanças a nível sistêmico e no microambiente tumoral, se torna importante conhecer os fenômenos nitoro-oxidativos envolvidos na instalação e progressão da metástase do melanoma Células de melanoma murino B16F1 foram cultivadas em DMEM 1%SFB e inoculadas 15 células viáveis em 5 ?L de DMEM sem soro em camundongos C57BL/6 machos (8-12 semanas), via endovenosa pelo plexo oftálmico O grupo controle recebeu 5 ?L de DMEM sem soro Os camundongos foram submetidos à eutanasia após 3, 7, 14 ou 21 dias, e os grupos denominados M3, M7, M14 e M21 respectivamente, com n=8 O pulmão foi retirado e feita a contagem de nódulos metastáticos O lobo médio do pulmão direito foi separado para inclusão em parafina e posterior análise imunohistoquímica (VEGF, PCNA e 3-NT), o restante foi armazenado a -8ºC O sangue total foi coletado por punção cardíaca e separados plasma e eritrócitos, o primeiro foi armazenado a -2ºC e o segundo em tampão alsever a 8ºC Foram feitas análises sistêmicas e no pulmão, de parâmetros pró oxidantes (QL e MDA) e antioxidantes (Catalase, GSH e TRAP) e avaliados estatisticamente por One-Way ANOVA e Tukey como pós teste Para analisar a célula tumoral livre de interferência sistêmica ou de outras células, avaliamos parâmetros oxidativos in vitro (MDA, Catalase, GSH e TRAP) em células B16F1 e as mesmas com estímulo da produção de melanina (L-tirosina 17µM/L e NH4Cl 1mM/L, em DMEM 1%SFB) Foi feita uma curva de proliferção após 24 e 48 horas de cultivo e as análises de estresse oxidativo após 48 horas A análise estatística foi realizada com Two-Way ANOVA e Tukey como pós teste, para avaliar proliferação e teste t de estudent não pareado para os parâmetros antioxidantes (p<,5 considerado significativo) Existe um aumento na lipoperoxidação plasmática no estágio mais inicial da doença, com progressiva diminuição do dano oxidativo e aumento de defesas antioxidantes Ao contrário, observamos no microambiente tumoral um aumento da lipoperoxidação e marcação para 3-NT a medida que aumentam os nódulos metastáticos, com diminuição de antioxidantes e aumento progressivo de VEGF como sinalização anigiogenica e PCNA como sinal de proliferação In vitro, houve aumento de proliferação após 48 horas nas células produtoras de melanina com aumento dos antioxidates TRAP, Catalase e GSH, no mesmo grupo Logo, podemos concluir que o aumento do equilíbrio redox na corrente sanguínea favorece a progressão tumoral, enquanto a redução do equilíbrio redox no tecido, causada em parte pela produção de melanina, favorece a sinalização para a proliferação de células de melanoma e crescimento do tumor, ao mesmo tempo em que o aumento de melanina fornece proteção antioxidante para a célula tumoral
Exposição a baixas doses de Malation durante os períodos juvenil e peripuberal altera parâmetros testiculares, epididimários e espermáticos de ratos
Erthal, Rafaela Pires; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves [Orientador]; Ferrari, Larissa Staurengo; Araújo, Eduardo José de Almeida
Resumo: O malation é um inseticida organofosforado amplamente utilizado para controle de insetos em culturas agrícolas ou do mosquito Aedes aegypt, vetor de doenças causadas pelos vírus da dengue, zica e chikungunya A população fica exposta ao inseticida através de alimentos ou ar contaminados durante o processo de pulverização Os períodos juvenil e peripuberal compreendem uma fase complexa do desenvolvimento testicular e epididimário, sendo crítica para obtenção da capacidade reprodutiva O objetivo do presente estudo foi avaliar se a exposição a baixas doses de malation durante os períodos juvenil e peripuberal pode prejudicar o desenvolvimento pós-natal testicular e epididimário de ratos Para isso, foram utilizados 45 ratos machos Wistar organizados em três grupos experimentais: dois grupos tratados com malation 1 mg/kg (M1) ou 5 mg/kg (M5) O grupo controle recebeu apenas o veículo (solução salina ,9%) Os animais foram tratados diariamente do dia pós natal (DPN) 25 ao 65 via gavage No DPN65, os ratos foram pesados, anestesiados e submetidos à eutanásia por punção cardíaca O sangue coletado foi destinado à determinação de nível plasmático de testosterona Os testículos e epidídimos foram retirados, pesados e utilizados para contagem espermática, avaliação de peroxidação lipídica, avaliação de parâmetros histológicos, estereológicos ou morfométricos, bem como avaliação de perfil inflamatório através da atividade de MPO e NAG e níveis de citocinas (TNF-a , IL-1ß, IL-6, e IL-1) Espermatozoides do ducto deferente foram utilizados para avalição da morfologia e motilidade espermática Os pesos corporal, testicular e epididimário foram semelhantes entre os grupos experimentais Nos testículos, a exposição ao malation 5 mg/kg levou à diminuição em níveis plasmáticos de testosterona e aumento em níveis de peroxidação lipídica comparados ao grupo controle Além disso, animais expostos a ambas as doses de malation apresentaram diminuição na contagem espermática, número de células de Sertoli e de Leydig, aumento de túbulos seminíferos anormais, alteração da dinâmica espermatogênica e aumento de espermatozoides anormais em relação ao grupo controle Apenas a menor dose do inseticida levou ao aumento de níveis de IL-1 em relação ao grupo controle A morfometria testicular e a avaliação de migração de células inflamatórias permaneceu inalterada após exposição ao malation Em relação aos epidídimos, foi observada a presença de anormalidades na cabeça do órgão após exposição ao malation 1 ou 5 mg/kg quando comparado ao grupo controle As contagens espermáticas tanto na cabeça quanto na cauda epididimária não diferiram do grupo controle, assim como os níveis de peroxidação lipídica Em contrapartida, a maior dose levou ao remodelamento do tecido epididimário, aumento de migração de neutrófilos e macrófagos da cabeça do órgão e diminuição em níveis de IL-1ß na mesma região epididimária em relação ao grupo controle Além de diminuir os níveis de IL-1ß, a dose menor reduziu níveis de IL-6 e levou à diminuição da motilidade espermática De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que o malathion, mesmo em baixas doses, afeta o desenvolvimento testicular e epididimário de ratos juvenis e peripuberais
Exposição ao cloreto de alumínio prejudica a morfologia testicular e prostática de ratos durante o período peripuberal
Leal, Franciely Aparecida Vaz Dantas; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves [Orientador]; Araújo, Eduardo José de Almeida; Guerra, Marina Trevizan
Resumo: Os metais podem apresentar graves consequências sobre o desenvolvimento do sistema reprodutivo masculino, diretamente, quando prejudicam órgãos reprodutivos específicos, ou indiretamente, quando provocam uma reação no sistema neuroendócrino Entre eles, o alumínio (Al) é o metal mais amplamente distribuído no ambiente sendo o terceiro elemento mais abundante na crosta terrestre A puberdade compreende um período de complexo desenvolvimento sexual, envolvendo mudanças físicas, comportamentais e hormonais, através das quais ocorre a maturação sexual e a obtenção da capacidade reprodutiva As investigações em humanos e em animais experimentais tem encontrado associação entre a exposição ao Al e a toxicidade do sistema reprodutor masculino em adultos, porém, pouco se conhece sobre os efeitos desse metal durante o período peripuberal Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a exposição ao cloreto de alumínio (AlCl3), durante o período peripuberal, pode afetar o desenvolvimento testicular e prostático em ratos Ratos machos Wistar foram divididos em três grupos experimentais, sendo dois grupos tratados com AlCl3 (em solução salina estéril ,9%) nas doses de 7 mg/Kg (grupo AL7) ou 34 mg/Kg (grupo AL34) de peso corpóreo via intraperitoneal do dia pós natal (DPN) 36 ao 66 (período peripuberal) O terceiro grupo (controle) recebeu apenas o veículo Ao final do período experimental, os animais foram anestesiados, pesados e submetidos à eutanásia Foram avaliados peso dos órgãos reprodutivos: testículo, epidídimo, próstata, glândula seminal e ducto deferente; morfologia espermática e produção diária de espermatozoides (PDE); histopatologia e morfometria testicular e prostática, contagem de célula de Sertoli e marcação imunohistoquímica para receptor de andrógeno (AR) nos testículos; contagem de mastócitos na próstata; avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) e N-acetyl glicosidase (NAG) e determinação dos níveis de citocinas IL1-ß, IL-6, IL-1 and TNF-a nos testículos e IL-6 na próstata; dosagem de testosterona plasmática Não foram observadas diferenças no peso dos órgãos reprodutivos, dosagem de testosterona, e número de mastócitos Os animais do grupo AL34 apresentaram diminuição no peso corpóreo, contagem espermática e PDE em comparação aos demais grupos A morfologia espermática mostrou-se alterada nos animais do grupo AL7 comparado com os demais grupos experimentais Houve diminuição no número de células de Sertoli e no número de células de Sertoli imunomarcadas para AR nos testículos no grupo AL34 em relação aos demais grupos experimentais As análises histopatológicas dos testículos mostraram aumento significativo no número de túbulos seminíferos anormais nos animais do grupo AL34 A atividade de MPO foi elevada nos testículos e próstatas dos animais AL34 Nos testículo, houve aumento da citocina TNF-a no grupo AL34 e aumento de IL-1 no grupo AL7 Não houve diferença significativa na análise morfométrica dos testículos entre os grupos experimentais As análises estereológicas na próstata demonstraram aumento no estroma e diminuição no lúmen dos animais do grupo AL7 e AL34 Dessa forma, podemos concluir que o cloreto de alumínio, durante o período peripuberal, na doses de 7 mg/Kg e 34 mg/Kg prejudica os parâmetros espermáticos e o desenvolvimento testicular e prostático em ratos
Qualidade da perda de massa muscular e de parâmetros funcionais nos estágios precoce e avançado da caquexia induzida por carcinoma colorretal C26, em camundongos Balb/c
Bruno, Maria Isabel Faustinoni; Guarnier, Flávia Alessandra [Orientador]; Gonçalves, Dawit Albieiro Pinheiro; Araújo, Eduardo José de Almeida
Resumo: A Caquexia é uma síndrome multifatorial e complexa, presente em doenças inflamatórias crônicas, como diabetes, Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica e câncer É frequentemente associada ao declínio da função física e qualidade de vida, baixa tolerância às terapias, e à diminuição da sobrevida No câncer, é a causa direta da mortalidade em até 4% dos pacientes Diversos fenômenos estão envolvidos na fisiopatologia da caquexia, dentre eles fenômenos metabólicos, inflamatórios e oxidativos Sabe-se que a produção de citocinas pró-inflamatórias está relacionada com diminuição da ingestão alimentar, bem como com a formação de espécies reativas de oxigênio que regulam positivamente vias de degradação proteica e atrofia muscular O objetivo deste estudo foi diferenciar os efeitos da caquexia em diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas, em tempos experimentais distintos, bem como o envolvimento de alterações bioquímicas, oxidativas e funcionais em um modelo experimental de carcinoma colorretal - C26 em camundongos Foram coletados os músculos sóleo, extensor longo dos dedos, gastrocnêmio e tibial anterior para análise da perda de massa muscular Modificações oxidativas e lipídeos foram avaliadas por meio da quantificação de malondialdeído por TBARS e quimiluminescência estimulada por butil hidroperóxido, a oxidação de proteínas por ELISA, e western blotting foi a técnica escolhida para quantificação da proteína Retículo Sarcoplasmático Cálcio ATPase Nossos resultados apontam para perda de massa muscular oxidativa no estágio de caquexia, que foram coincidentes com os achados da carbonilação de proteínas, enquanto a análise de fibras mistas demonstrou lesão oxidativa de membranas nos estágios inicial e tardio da síndrome A avaliação de parâmetros funcionais de mobilidade e capacidade física mostrou que o comprometimento funcional atinge diferentes habilidades durante os estágios de desenvolvimento da caquexia, apontando para correlação nos distúrbios do cálcio Este trabalho sugere que, neste modelo experimental, diferentes tipos de fibras musculares respondem de maneiras diferentes, e que o comprometimento funcional também varia temporalmente, abrindo possibilidades para tratamento específico durante os diferentes estágios da síndrome
Tratamento com aspirina em camundongos e implicações para a invasão gástrica por Trypanosoma cruzi cepas CL 14 e G
Cossentini, Luana Aparecida; Pinge Filho, Phileno [Orientador]; Ceravolo, Graziela Scalianti; Araújo, Eduardo José de Almeida
Resumo: A infecção oral por Trypanosoma cruzi tem contribuído para o surgimento de novos casos da Doença de Chagas e se dá principalmente pela ingestão de formas tripomastigotas metacíclicas (TM) presentes em diferentes alimentos Fármacos que atuam sobre a inibição de enzimas catalizadoras como a ciclooxigenase (COX), predominantemente a COX-1, levam a um desequilíbrio da homeostasia gastrointestinal, que pode ocasionar lesões da mucosa gástrica Desta forma, foi utilizado ácido acetil salicílico/Aspirina (ASA) como modelo de lesão gástrica em camundongos BALB/c, por via oral, problematizando a entrada do parasito na mucosa gástrica lesionada e sua capacidade de desenvolver a infecção sistêmica Para tal, utilizamos TM de duas cepas do T cruzi, a CL14 e a G, obtidas a partir de ensaios de metaciclogênese in vitro ASA foi administrada nos dias , 1, 2, 3 e 4 após restrição alimentar de 16 horas na dose de 1 mg/kg Os camundongos foram distribuídos em grupos para determinação da lesão (grupo sem tratamento e grupo tratado), e em grupos para avaliação da infecção (grupo infectado e grupo infectado e tratado) para ambas as cepas Os animais foram infectados por via oral com 4x15 para determinação de parasitemia e 5x17 para determinação do parasitismo no estômago e dosagens de óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral (TNF-a) Para o ensaio de parasitismo e dosagens, os animais foram submetidos a eutanásia no quarto dia pós infecção para a retirada do estômago Em outro ensaio, a partir do 13º dia pós-infecção, a carga parasitária no sangue foi determinada a cada dois dias Nossos resultados mostram que o tratamento com ASA 1 mg/kg produziu lesão na mucosa gástrica caracterizada por score de lesão em torno de 25, produção diminuída de NO e aumento de TNF-a Observamos ainda que camundongos previamente tratados apresentaram maior parasitemia para as cepas de T cruzi utilizadas (CL 14 e G), e maior parasitismo na mucosa gástrica para a cepa CL 14 Evidenciando claramente que a lesão na mucosa gástrica atua com porta de entrada para cepas de T cruzi pouco infectivas, podendo tornar indivíduos residentes em áreas endêmicas ainda mais susceptíveis a infecção
Treinamento físico modula a produção de óxido nítrico e de citocinas melhorando a resposta cardiovascular e resistência à infecção por Trypanosoma cruzi
Lucchetti, Bruno Fernando Cruz; Pinge, Marli Cardoso Martins [Orientador]; Araújo, Eduardo José de Almeida; Ceravolo, Graziela Scalianti; Pinge Filho, Phileno [Coorientador]
Resumo: A infecção por Trypanosoma cruzi provoca resposta imunológica inata iniciada na fase aguda responsável pela resistência do hospedeiro ao parasito Observa-se inflamação cardíaca progressiva, fibrose com modificações na arquitetura e funcionalidade do coração Recentes estudos têm mostrado que atividade física (AF) crônica de intensidade moderada pode atuar como um fator de resistência contra infecção por T cruzi em animais No entanto, os parâmetros cardiovasculares de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), e níveis de óxido nítrico (NO) que acompanham a fase aguda da infecção em animais previamente treinados, não estão esclarecidos O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do condicionamento físico prévio sobre aspectos inflamatórios, bioquímicos e cardiovasculares da resistência à infecção por Trypanosoma cruzi Camundongos Swiss foram distribuidos aleatoriamente em quatro grupos: Controle e sedentário (CS), controle e treinado (CT), sedentário e infectado (SI), e treinados e infectado (TI) A atividade física foi realizada em esteira por nove semanas Após a AF, os camundongos foram infectados com 5x1³ formas tripomastigotas de T cruzi (cepa Y) Observamos bradicardia de repouso e melhor desempenho nos animais treinados em comparação com os sedentários No 2º dia pós-infecção (dpi), encontramos uma diminuição da FC no SI comparado com animais TI (699,73 ± 42,37 vs 742,11 ± 25,35 bpm, p <,5) Observou-se também aumento da produção de NO, no tecido cardíaco no 2º dpi em SI, e normalizado no grupo TI (2,73 ± 2,74 vs 6,51 ± 1,19 mM) Um aumento da concentração plasmática de citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNF-a, IFN-?,) e MCP-1 foi encontrado no grupo SI, comparado com o TI Ocorreu um aumento da parasitemia nos dias 15 e 17 pós infecção no grupo SI, já no grupo TI esse aumento foi atenuado Além disso, animais TI mostraram aumento da sobrevivência em comparação com SI Nossos resultados sugerem que a AF prévia, desempenha um papel preventivo na resistência à infecção por T cruzi, modulando a resposta inflamatória e níveis de NO de camundongos infectados

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