01 - Doutorado - Patologia Experimental
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Navegando 01 - Doutorado - Patologia Experimental por Autor "Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]"
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Item Efeito da metformina em parâmetros oxidativos e imunológicos em modelo murino de irradiação aguda por UVBSouza Neto, Fernando Pinheiro de; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Luiz, Rodrigo Cabral; Marinello, Poliana Camila; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Leiria, Luiz OsórioResumo: As radiações ultravioletas (UV) são as principais responsáveis pelo desenvolvimento de lesões pré-malignas e malignas cutâneas As duas principais radiações que atingem a superfície terrestre, responsáveis por danos ao DNA, são do tipo UVA (315 - 4nm) e UVB (28 – 315nm) Esta última induz a um ambiente pró-inflamatório quando da exposição aguda e imunossupressor quando crônico Esta ambiguidade de evento a longo prazo induz ao tipo mais incidente de câncer, o de pele A irradiação UVB atinge principalmente a camada epidérmica da pele, apresentando dois principais mecanismos de dano Dano de maneira direta através da formação de dímeros de pirimidina, e a indireta, através de danos oxidativos, que se relacionam por produzir um microambiente inflamatório com oxidação de lipídeos, proteínas e mutação gênica A imunossupressão também faz parte deste quadro caracterizando, assim, a fotocarcinogênese Apesar da pele possuir um sistema antioxidante eficiente que controla, em parte, o excesso de espécies reativas de oxigênio produzida pela irradiação, a procura por substâncias que reduzam os efeitos danosos da UVB na pele tem sido intensa Dentre as substâncias tem-se a selenocisteína, N-acetil-cisteína, metformina A vitamina E, uma das mais estudadas até o momento, busca reduzir os efeitos oxidativos e imunossupressores causados pela irradiação A metformina, um medicamento vastamente utilizado no tratamento do diabetes do tipo 2, mostrou diminuir a incidência de câncer de mama em mulheres diabéticas que fazem o seu uso Entretanto, outros estudos conduzidos em pacientes com outros tipos de câncer não encontram a mesma resposta Em virtude da pouca informação sobre os possíveis mecanismos envolvidos na redução da proliferação celular ou mesmo inibição do desenvolvimento do câncer quando do uso da metformina, o objetivo do presente trabalho foi trazer novas informações sobre os mecanismos desta droga sobre os efeitos inflamatórios, imunológicos e oxidativos causados pela irradiação UVB Foi utilizado o modelo experimental murino com irradiação aguda UVB (4mJ/cm2) pré-tratado com metformina (9mg/Kg via ip) por 11 dias Os grupos foram divididos em: tratados com tampão fosfato salina (C+PBS); pré-tratados com metformina (C+MET); irradiado tratado com PBS (IRR+PBS); e irradiado pré-tratado com metformina (IRR+MET) Após 24h da irradiação o sangue e a pele foram removidos, o perfil redox e a quantificação de algumas citocinas epidérmicas imunomodulatórias foram quantificados A epiderme foi separada da derme onde foram analisados a atividade metabólica mitocondrial, os níveis de ânion radical superóxido e a quantidade de células de Langerhans Dentro das análises oxidativas sistêmicas, o malondialdeído (MDA) apresentou-se elevado (p<5) no grupo que recebeu irradiação quando comparado ao grupo irradiado tratado com metformina A análise do perfil oxidativo sistêmico mostrou que apesar da lipoperoxidação eritrocitária não ter sido diferente entre os grupos, o nível de tiol total, no grupo IRR+MET se manteve semelhante ao não irradiado O contrário ocorreu no grupo IRR+PBS, cujos níveis reduzem significativamente comparado ao seu controle C+PBS (p<5) A atividade da catalase está elevada no grupo IRR+PBS quando comparada ao grupo C+PBS e ao grupo IRR+MET (p<5) A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) é reduzida pela irradiação UVB, em ambos os grupos IRR+PBS e IRR+MET quando comparada aos respectivos controles (p<5), o tratamento com metformina no grupo IRR+MET não reverteu esta redução Na pele foi quantificado a lipoperoxidação de membrana, TRAP, atividade da catalase e tiol total Os níveis de lipoperóxidos do grupo IRR+PBS teve uma redução significativa (p<,5) comparado aos demais grupos Os lipoperóxidos do grupo IRR+MET não difere dos grupos não irradiados O tratamento com metformina foi eficaz em aumentar as defesas antioxidantes como TRAP, atividade da catalase e tiol total O grupo IRR+PBS apresenta uma queda significativa nas defesas antioxidantes comparada ao seu controle C+PBS (p<,5) A atividade metabólica mitocondrial da epiderme foi avaliada, por citometria de fluxo com a sonda DIOC6 (Iodeto 3-3 dihexiloxacarbocianina) Para a medida da produção de ânions superóxido foi utilizado a sonda MitoSox red Com o uso das duas sondas foi possível observar que nos grupos tratados a metformina não reverteu a queda de células metabolicamente ativas nem o aumento da produção de ânions superóxido das mitocôndrias nestes grupos As citocinas imunomodulatórias epidérmicas foram quantificadas e observou-se um aumento da interleucina 1 (IL-1) nos grupos irradiados Demonstrando o efeito da irradiação como imunossupressor, e a metformina não foi capaz de reverter este quadro A quantificação das células de Langerhans epidérmicas, por citometria de fluxo, mostrou que a irradiação levou a uma diminuição significativa do número destas células quando comparada ao grupo controle (p<,5) A metformina não alterou este perfil A análise por hematoxilina e eosina (HE) da pele, no grupo IRR+PBS mostra perda da integridade da epiderme quase que na sua totalidade, diferindo do grupo IRR+MET, onde houve uma recuperação parcial da epiderme Através do marcador específico para estresse oxidativo, o 4-hidroxinonenal (4-HNE), pode-se observar que o grupo IRR+PBS tem sua marcação mais significativa em nível de epiderme e o grupo IRR+MET apresentou uma marcação mais ao nível de derme, como em folículos pilosos e glândulas exócrinas O estresse nitrosativo foi avaliado utilizando-se marcação imuno-histoquímica por nitrotirosina (NT) O grupo IRR+PBS apresentou um aumento significativo (p<,5) para NT em áreas em que a epiderme está intacta comparada ao grupo IRR+MET A marcação para a proteína p53 demonstrou diferença entre os grupos irradiados Houve uma marcação mais proeminente em áreas onde a epiderme ainda está intacta no grupo IRR+PBS No grupo IRR+MET sua marcação é mais restrita em áreas mais profundas como folículo piloso e glândulas exócrinas Para reportar a imunossupressão induzida por UVB, utilizou-se o teste de hipersensibilidade por contato (CHS), onde avalia-se a resposta dos linfócitos T frente ao sensibilizante chamado oxazolona A metformina influenciou na melhora da resposta imune pelo teste de CHS Conclui-se que a metformina diminui o status oxidativo sistemicamente e na pele dos animais irradiados, através do aumento das defesas antioxidantes e redução das moléculas oxidadas A metformina também diminui a imunossupressão induzida pela irradiação UVB, podendo possuir uma participação ativa na diminuição das lesões na pele que poderiam evoluir para uma neoplasia malignaItem Estresse oxidativo e biomarcadores do metabolismo do ferro em pacientes com melanoma cutâneo e melanoma recidivadoPrado, Sara Santos Bernardes Real; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Landman, Gilles; Ramalho, Leandra Náira Zambelli; Luiz, Rodrigo Cabral; Guarnier, Flávia AlessandraResumo: Uma das correlações mais aceitas no prognóstico do melanoma cutâneo é a medida da espessura de Breslow, onde tumores mais espessos se relacionam fortemente com o risco de disseminação da doença e morte O estresse oxidativo sistêmico em pacientes com câncer é reportado na literatura, porém seu papel no prognóstico de doenças malignas ainda é controverso As ferritinas de cadeia pesada (FCP) e leve (FCL) são proteínas envolvidas no metabolismo do ferro, relacionadas a um pior prognóstico no câncer O fator de crescimento tumoral beta-1 (TGF-ß1) está intimamente relacionado com a iniciação, progressão e metástase tumoral, sendo os radicais livres capazes de regular sua atividade A relação entre o estresse oxidativo e moléculas relacionadas, como as envolvidas no metabolismo do ferro e na resposta inflamatória, ainda não é bem caracterizado no melanoma O objetivo deste trabalho foi caracterizar esses parâmetros em pacientes em diferentes estadiamentos dessa doença A medida de espessura de Breslow e a presença ou não de recidivas foram utilizadas como parâmetros na divisão dos grupos Um total de 83 pacientes foram recrutados no Hospital do Câncer de Londrina entre abril de 211 e novembro de 212 O grupo controle compreendeu 65 indivíduos saudáveis O sangue venoso foi coletado e usado nas análises sistêmicas Também foram selecionados aleatoriamente 7 blocos parafinizados de tumores de melanoma analisados no Departamento de Patologia do Hospital do Câncer de Londrina, a fim de estudar o estresse oxidativo e moléculas relacionadas no tecido tumoral por imuno-histoquímica Quanto maior a espessura de Breslow e agressividade da doença (recidiva), mais evidentes foram as modificações oxidativas e inflamatórias sistêmicas, caracterizadas principalmente pelo aumento dos níveis de malondialdeído (MDA) e proteína C reativa (PCR) Além disso, tumores cutâneos com maior espessura de Breslow apresentaram maior concentração do produto de oxidação de proteínas 3-nitrotirosina nas análises de imunohistoquímica de células de melanoma e no tecido peritumoral quando comparados a tumores menores Pacientes com recidiva e alto risco de recidiva, apresentaram aumento de FCP sistêmica, enquanto todos os pacientes com melanoma apresentaram aumento da relação FCP:FCL quando comparados a indivíduos saudáveis O aumento dos níveis de FCP foi acompanhado do aumento do estresse oxidativo sistêmico, avaliado pela lipoperoxidação de hemácias Células de melanoma apresentam aumento na marcação de FCP por imunohistoquímica porém em níveis iguais entre as diferentes classificações do tumor A p53, proteína envolvida na proliferação celular, apresentou-se aumentada em tumores metastáticos quando comparados a tumores cutâneos com menores espessuras de Breslow Pacientes com recidiva apresentaram baixos níveis sistêmicos de TGF-ß1, acompanhados de altos níveis de MDA, lipoperoxidação de hemácias e de 3-nitrotirosina Os resultados mostram o estresse oxidativo e moléculas relacionadas possuem perfis característicos nos diferentes estadiamentos do melanoma, acrescentando uma nova perspectiva sobre o estado redox e seu possível envolvimento com a evolução da doençaItem Mecanismos de ação do óxido nítrico em modelo experimental de irradiação UVB na pele de murinosMalachias, Vânia Aparecida Terra; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Ramalho, Leandra Náira Zambelli; Frade, Marco Andrey Cipriani; Luiz, Rodrigo Cabral; Cecchini, RubensResumo: A irradiação UVB estimula a produção de radicais livres causando lesões oxidativas na pele que podem resultar na aceleração do envelhecimento e o desenvolvimento de doenças cutâneas malignas O presente estudo avaliou o estresse oxidativo e nitrosativo na pele de camundongos após a irradiação UVB e determinou as espécies reativas formadas imediatamente, 6hs e 24hs após a radiação UVB Além disso, demonstrou o mecanismo de ação do óxido nítrico (NO) na lesão cutânea e na modulação da proliferação celular Ainda com o objetivo de estabelecer o modelo experimental de irradiação aguda por UVB eficiente para testes com antioxidantes avaliamos o mecanismo protetor da genisteína, neste modelo experimental Neste estudo para que os níveis de NO fossem avaliados foi necessário adaptar e validar uma técnica por quimiluminescência (QL) utilizada anteriormente por outros autores em tempo real em rim e coração para amostras congeladas e a fresco de pele de murinos A técnica descreve a reação entre o NO e H2O2-luminol Durante a validação, utilizamos além da pele, músculo gastrocnêmio de ratos e dois sistemas químicos geradores de NO (Nitroprussiato de sódio- NPS e iodeto de potássio em meio ácido) Através do uso de cPTIO (inibidor de NO), foi confirmado que o NO é de fato a molécula que reage com H2O2-luminol durante a reação de QL, observado pela inibição da emissão de fótons em todos os sistemas estudados Durante a reação do NO e H2O2-luminol, utilizamos também os inibidores histidina, manitol e superóxido dismutase (SOD), específico para 1O2, radical hidroxil (OH) e ânion superóxido (O2 •), respectivamente e observamos que os resultados obtidos nos sistemas químicos e biológicos foram semelhantes aos descritos por outros autores Conforme descrito as espécies emissoras de fótons, resultantes da reação entre o NO e H2O2-luminol, são o peroxinitrito (ONOO-) ou oxigênio singlet (1O2) Concluímos que a reação rápida, sensível e específica do NO com H2O2-luminol por QL, acontece em sistema químico e biológico e pode ser utilizado para examinar o papel do NO em processos fisiopatológicos, ampliando a utilização deste método para diferentes amostras à fresco e congeladas Ainda neste estudo utilizamos outras metodologias descritas anteriormente através da reação de QL avaliamos o estresse oxidativo ou nitrosativo após a radiação aguda por UVB na pele pela formação de lipoperóxidos de membrana resultante da reação lipoperoxidativa iniciada por radicais livres e a capacidade antioxidante total (TRAP) do tecido A atividade da enzima catalase (CAT) e níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) foram analisadas por espectrofotometria O estudo da modulação na proliferação celular foi realizado por imunohistoquímica através dos marcadores, PCNA, VEGF, Ki67, p53 e marcação da apoptose (Tunel) Os resultados mostraram a formação de lipoperóxidos de membrana na pele imediatamente após a radiação UVB, com níveis superiores após 24hs sendo que após 6hs não ocorreu lesão lipoperoxidativa A redução da capacidade antioxidante total da pele foi observada somente imediatamente após a radiação UVB Quando os animais swiss foram tratados com desferroxamina (DFX, quelante de ferro inibindo formação?OH), histidina (inibidor 1O2), AG e L-Name (inibidores de iNOS e cNOS, respectivamente), houve diminuição da formação de lipoperóxidos de membrana imediatamente após a radiação UVB A redução da capacidade antioxidante total só não foi revertida com o tratamento com inibidores de NOS Concluímos que imediatamente após a radiação UVB, diferentes espécies reativas, como o ?OH, 1O2 e NO participam do estresse oxidativo e nitrosativo na pele de camundongos swiss A intensa lesão lipoperoxidativa após 24hs da UVB foi acompanhada por altos níveis de NO Ainda neste tempo, houve redução da atividade da CAT e dos níveis de GSH, com aumento da GSSG, sugerindo acúmulo de H2O2 Este acúmulo resultou na reação entre H2O2 e NO gerando ONOO-, que é a espécie reativa responsável pela nitração de proteínas, conforme observado pela intensa marcação de nitrotirosina neste tempo A análise histológica dos camundongos hairless tratados com AG e L-Name mostrou preservação tecidual que pode ser confirmada pela diminuição dos lipoperóxidos de membrana, na marcação da nitrotirosina assim como nos níveis de NO e proporcionou o aumento da proliferação celular avaliada pelo aumento dos marcadores PCNA e VEGF Concluímos que após 24hs da radiação UVB, o NO é principal responsável pelo estresse nitrosativo na pele de camundongos hairless e swiss, bem como pela modulação da proliferação celular O tratamento com genisteína (1 mg/kg) antes da radiação UVB mostrou pela análise histopatológica preservação tecidual sendo que a superfície epitelial permaneceu intacta A ação protetora da Genisteína contra a lesão na pele após 24hs da radiação UVB, foi confirmada pela redução na formação de lipoperóxidos de membrana e na marcação da nitrotirosina embora os níveis de NO permanecessem elevados Houve estimulação na proliferação celular avaliada pelo PCNA, VEGF, Ki67, p53 e diminui a apoptose Estes resultados revelaram que a genisteína possui ação protetora contra o estresse nitrosativo na pele após 24hs da radiação UVB, provavelmente pela sua ação scavenger de H2O2 evitando a formação de ONOO- Neste estudo mostramos a importante participação do NO na patogenia da pele provocada pela radiação UVB e sugerimos este modelo experimental para a avaliação dos mecanismos protetores de substâncias antioxidantesItem Participação do estresse oxidativo no mecanismo de ação da metformina na citotoxicidade e nos processos de indução experimental de resistência à quimioterapia com doxorrubicina em células de adenocarcinoma mamário humanoMarinello, Poliana Camila; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Oliveira, Karen Brajão de; Dichi, Isaías; Panis, Carolina; Fernandes, Karen Barros ParronResumo: O câncer de mama é o segundo tipo de neoplasia mais frequente entre as mulheres no mundo todo A metformina é uma droga antihiperglicemiante segura e eficaz, amplamente utilizada no tratamento do diabetes tipo 2 Nos últimos anos, o seu uso tem sido associado a menor incidência de câncer e, por esses motivos, os seus efeitos na proliferação de células de câncer de mama e na sensibilização dessas células ao tratamento têm sido investigados Pesquisas recentes demonstram que a metformina reduz a proliferação de células de câncer de mama sensíveis e é capaz de ressensibilizar células com múltipla resistência a drogas Entretanto, os mecanismos de ação da metformina ainda não foram totalmente esclarecidos, e a sua capacidade de sensibilizar as células tumorais ao tratamento nunca foi descrita Portanto, o objetivo desse trabalho foi investigar a participação do estresse oxidativo (EO) nos mecanismos de citotoxicidade da metformina em células de adenocarcinoma mamário humano positivas para receptores hormonais e triplo negativas, MCF-7 e MDA-MB- 231, respectivamente, e investigar os efeitos da metformina no processo de indução experimental de resistência à doxorrubicina Para a análise da participação do EO nos mecanismos de citotoxicidade da droga, avaliou-se o padrão de morte celular, a presença de danos oxidativo ao DNA, parâmetros de estresse oxidativo e efeito da metformina sobre algumas proteínas de sinalização importantes no controle do crescimento e proliferação celular (ERK1/2, AKT, TGF – ß1 e p53) Para isso, quatro concentrações diferentes da droga foram utilizadas: duas clinicamente relevantes, que correspondem às concentrações plasmáticas encontradas em indivíduos após tratamento (6 e 3 µM), e duas experimentais (1 e 5 µM) Para a investigação dos efeitos da metformina no processo de indução de resistência à doxorrubicina, as células foram expostas a concentrações crescentes do quimioterápico e a metformina foi associada em diferentes momentos, simultaneamente e através de um prétratamento Foram analisados o estado oxidativo celular ao longo do processo de indução da quimiorresistência, os níveis de óxido nítrico (NO) e os efeitos da droga em vias que poderiam relacionar-se com a quimiorresistência, como a p53, NF-kB, Nrf2 e TGF-ß1 Com base nos primeiros resultados (em células sensíveis), escolhemos uma concentração de metformina que identificamos como não citotóxica (6 µM) para ser estudada no modelo de indução de resistência à doxorrubicina Os resultados demonstraram que a metformina, nas células de câncer de mama sensíveis, é citotóxica a partir de concentrações clinicamente relevantes (3 µM) e que esse efeito ocorre através da indução simultânea de estresse oxidativo, dano de DNA e aumento dos níveis citoplasmáticos de TGF-ß1 Além disso, a droga, em concentrações mais elevadas (1 e 5 µM), induz apoptose celular, diminui a ERK1/2 e a Akt (5 µM), e aumenta os níveis nucleares de p53 (1 e 5 µM) No processo de indução de quimiorresistência, o pré-tratamento com metformina preveniu a resistência à doxorrubicina nas duas linhagens celulares estudadas, além de sensibilizar as células MCF-7 ao quimioterápico Essa prevenção ocorreu através da geração de estresse oxidativo, redução nos níveis de NO, aumento de p53 nuclear e de TGF-ß1 citoplasmático, e redução de Nrf2 nuclear Esses resultados ajudam a entender os mecanismos de ação da metformina em células MCF-7 e MDA-MB-231 e sugerem que o tratamento com a droga pode exercer efeito benéfico na prevenção da resistência à doxorrubicina, ressaltando a potencial utilidade clínica da metformina como adjuvante na terapia do câncer de mamaItem Perfil da recuperação do pâncreas e rins de ratos wistar diabéticos tratados com fração acetato de etila de Trichilia catigua : análise bioquímica, morfologia tecidual e estado redoxPaulo, Luis Fernando de; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Araújo, Eduardo José de Almeida; Tonon, Jair; Perles, Juliana Vanessa Colombo Martins; Luiz, Rodrigo Cabral; Zanoni, Jacqueline Nelisis [Coorientador]Resumo: O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica de distribuição mundial, e caracteriza-se pela deficiência ou não produção de insulina pelas células ß pancreáticas Essa deficiência apresenta como principal resultado a hiperglicemia crônica, que por sua vez produz alterações metabólicas e sistêmicas O diabetes apresenta 4 tipos básicos: o DM Tipo 1, DM Tipo 2, Diabetes Gestacional e outros tipos de DM Dentre as principais complicações do DM temos alterações bruscas nos níveis da glicose (hiperglicemia e hipoglicemia) e o desenvolvimento de doenças secundárias ao estado diabético, como a retinopatia, complicações cardiovasculares, neuropatia e nefropatia A nefropatia diabética caracteriza-se por alterações histopatológicas no tecido renal, que levam a lesão dos glomérulos e túbulos distais muitas vezes por mecanismos de estresse oxidativo, e juntamente com lesões pancreáticas criam um ambiente favorável para o desenvolvimento das complicações do DM A utilização de compostos naturais no tratamento de doenças crônicas tem sido bastante estudado A Catuaba (Trichilia catigua) é popularmente utilizada no tratamento de estresse, impotência, déficit de memória e fadigas, e estudos recentes mostram resultados promissores apresentando efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Fração de Acetato de Etila de Trichilia catigua (EAF) possui algum efeito atenuador ou farmacológico sobre as complicações decorrentes do DM Para isso, utilizou-se Ratos Wistar divididos em 4 grupos: N - normoglicêmico, N-EAF – normoglicêmico tratado com EAF (2 mg / kg); D: diabéticos e D-EAF: diabético tratado com EAF (2 mg / kg) O diabetes foi induzido por uma única injecção de estreptozotocina (STZ) (35 mg / kg) na veia peniana Dois dias após a injecção de STZ, o EAF foi administrado por gavagem, 7 dias por semana, durante 8 semanas Durante o período do experimento os animais foram analisados quanto a parâmetros metabólicos: peso, ingestão de água e ingestão de ração Após esse período foram coletados o sangue total dos animais para análises bioquímicas (glicemia, função renal, função hepática e função pancreática) e análises hematológicas O pâncreas e os rins foram coletados para análises morfométricas e histopatológicas Os ratos do grupo D apresentaram redução de peso corporal, tecido adiposo e massa muscular (p <,5) Estes animais apresentaram aumento na ingestão de alimentos e água e hiperglicemia com atrofia das ilhotas pancreáticas (p <,5) No entanto, a administração EAF no grupo D-EAF atenuou a perda de massa corporal e redução da ingestão de alimentos e de água (p<,5) Além disso, o tratamento EAF em ratos D-EAF promoveu um efeito hipoglicemiante com redução de 24% da glicose no sangue (P <,5) e melhora a outros parâmetros bioquímicos A análise da imuno-histoquímica para marcação da insulina mostra aumento do número de células ß e ilhotas tamanho significativo no grupo D-EAF por proliferação de células-ß marcado com PCNA Além disso, os nossos estudos histopatológicos mostraram que EAF promove redução nos danos do tecido renal (glomeruloesclerose, degeneração glicogênica e depósito de colágeno) em ratos com diabetes tratados com EAF as análises do estresse oxidativo aprsentaram a capacidade da T catigua proteger os rins da peroxidação lipídica O presente estudo mostrou que extrato de T catigua melhora a homeostase da glicose, protege o pâncreas das ações da STZ sobre as células ß, e protege os rins da peroxidação liídica inibindo o desenvolvimento da nefropatia diabética em ratos induzidos por STZItem Resposta oxidativa in vitro e in vivo do uso da metformina no tratamento do melanoma murino (B16F10)Sanches, Larissa Juliani; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, André; Costa, Idessania Nazareth; Andrade, Fábio Goulart de; Marinello, Poliana Camila [Coorientadora]Resumo: O melanoma, tem origem nos melanócitos e sua incidência vem crescendo nas últimas décadas, resultado da interação de fatores de risco genéticos (como mutação em BRAF) e ambientais (como exposição à radiação UV, por exemplo) Quando diagnosticado precocemente, o tratamento mais indicado é a remoção cirúrgica, porém quando encontra-se metastizado para linfonodos ou órgãos distantes é comum ser refratário aos tratamentos, levando a uma baixa sobrevida O melanoma é resistente a grande parte dos tratamentos disponíveis até o presente momento e alguns processos estão associados a essa resistência A resistência intrínseca envolve a regulação positiva de receptores tirosina quinase e a reativação de MAPK, enquanto a resistência adquirida tardiamente está relacionada com mutações concorrentes em RAS ou MEK, amplificação da forma mutante de BRAF ou splicing alternativo O estresse oxidativo está intimamente relacionado aos processos de iniciação, proliferação e metástase do câncer bem como na resistência à terapia Estudos com a metformina tem mostrado que esta pode exercer uma ação na inibição do desenvolvimento do câncer A metformina é atualmente o medicamento mais prescrito mundialmente para o tratamento do diabetes tipo 2 No câncer a metformina atua nas vias de sinalização LKB1 – AMPK e mTOR A inibição do mTOR perturba a síntese de proteínas, ocasionando uma ação antineoplásica direta nas células tumorais, através da inibição da progressão do ciclo celular e indução da apoptose e autofagia Outros estudos, mostram que a metformina desencadeia a apoptose através da regulação negativa de Bcl-2, ativando Bax, p53, desencadeando apoptose através de sinalização da ERK, dependentes e independentes de caspases, inibindo o proto-oncogene c-MYC e HIF-1a via AMPK Com base nos efeitos promissores da metformina e na resistência do melanoma aos tratamentos disponíveis, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da metformina em células de melanoma murino metastático B16F1 em dois modelos experimentais: in vitro e in vivo No modelo in vitro, analisamos a participação da metformina no processo de indução de resistência à dacarbazina (DTIC) Para isso um fenótipo de resistência à DTIC foi induzido em células B16F1 A indução da resistência foi feita através da exposição das células a concentrações crescentes de DTIC As células foram plaqueadas em garrafas de 25cm2 na concentração de 1x16 e expostas a DTIC (1µg / mL, 1µg / mL, 25µg / mL, 5µg / mL, 75µg / mL, 1 µg / mL e 125 µg / mL) As células foram consideradas resistentes quando a exposição a DTIC não causava sua morte Para analisar a interferência da metformina no processo de indução de resistência, as células foram pré-tratadas com metformina (6 µM) durante 7 passagens e então foram induzidas à resistência a DTIC, grupo denominado MET-DTIC As células foram coletadas em todas as passagens, para a análise de marcadores de estresse oxidativo 8-OH-DG, p53, Nrf2 e NF-kB Os resultados revelam que o fenótipo de resistência a DTIC nas células B16F1 foi induzido com o protocolo experimental utilizado e que a metformina é capaz de atenuar este processo de indução de resistência Além de prevenir a indução de resistência a metformina atua aumentando os níveis de antioxidantes celulares e modula vias de sinalização importantes para a quimiorresistência, aumentando a marcação nuclear de p53 e reduzindo a marcação nuclear de NF?B e Nrf2 Na avaliação do efeito da metformina no melanoma in vivo, dois objetivos distintos foram trabalhados: primeiramente foi avaliado o efeito da metformina no tratamento do melanoma metastático, bem como sua ação em conjunto com o quimioterápico DTIC, em um segundo momento, avaliamos a ação da metformina na implantação das células tumorais no pulmão Para responder o primeiro objetivo, os animais foram inoculados com células B16F1 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo (C+), onde os animais não foram tratados; grupo Metformina (MET), tratado com metformina na concentração de 2mg ip do 1o ao 14o dia; Grupo Dacarbazina (DTIC), tratado com dacarbazina concentração de 5mg/kg ip do 5º ao 1º dia; grupo Metformina + Dacarbazina (MET-DTIC), tratado com metformina e dacarbazina nas mesmas condições mencionadas acima; e grupo controle negativo (C-), em que os animais foram inoculados com meio de cultura (DMEM) sem soro e não receberam tratamento Para o segundo objetivo, todos os animais foram tratados com metformina na concentração de 2mg ip durante 5 dias, após esse período os animais foram inoculados com células B16F1 4x16 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo PTM (C+), PTM (MET), PTM (DTIC) e PTM (MET-DTIC), seguindo os mesmos protocolos de tratamento descritos para o primeiro objetivo Nos dois protocolos experimentais, os animais foram pesados durante todo o tempo experimental e o consumo de ração por animal em cada grupo foi calculado Após os 14 dias de experimento, os animais foram eutanásiados e foi realizada a punção cardiaca para a análise sistêmica e a retirada cuidadosa dos pulmões Foram realizadas as contagens de nódulos metástaticos em todos os pulmões Foram realizadas análises de estresse oxidativo no microambiente tumoral e sistêmico A arquitetura pulmonar e marcadores de vias de sinalização envolvidas com proliferação, estresse oxidativo e morte celular também foram analisados devido à sua relação com a resistência aos tratamentos disponíveis Os resultados demonstram que a metformina tem um importante papel na modulação de importantes vias de sinalização, como a p53, PCNA e Nrf2, interferindo assim no estresse oxidativo e culminando em uma ação antitumoral e antimetastática Diminuindo assim o número de nódulos metastáticos quando utilizada isoladamente e potencializando o efeito da DTIC, além de diminuir os efeitos colaterais do quimioterápico Dessa forma pode-se concluir que a metformina tem um potencial terapêutico por apresentar atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo de melanoma murino, estudados com as células B16F1 Essa atividade é acompanhada pela modulação de vias importantes para a viabilidade de células tumorais como, estresse oxidativo, crescimento e morte celular resposáveis, em parte, pela resistência do melanoma a quimioterápicos atualmente disponíveis