02 - Mestrado - Ciência de Alimentos
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Navegando 02 - Mestrado - Ciência de Alimentos por Assunto "Aflatoxins"
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Item Aflatoxina B1 na avicultura de postura - ovo, ração e milho - na região norte do Paraná, BrasilSilva, Fernando de Godoi; Hirooka, Elisa Yoko [Orientador]; Ribeiro Junior, José Carlos; Oliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de; Lopes, Daiane Dias; Itano, Eiko NakagawaResumo: A avicultura de postura no país segue a tendência de fortalecimento do agronegócio, com aumento da produtividade, do consumo interno, e expansão das exportações Para alcançar maior destaque no mercado internacional é necessário romper barreiras sanitárias e garantir a qualidade e segurança do produto A avaliação de resíduos e contaminantes deve ser parte dos programas de biosseguridade aplicados à avicultura Alguns contaminantes, como as aflatoxinas, chegam às aves de postura através da alimentação, principalmente, milho contaminado Estes compostos são produzidos por Aspergillus spp no campo ou durante o armazenamento dos grãos A aflatoxina B1 é o análogo mais tóxico deste grupo, afetando a saúde e reduzindo a produtividade animal Além do risco às aves, a transmissão de AFB1 aos ovos alerta para o consumo humano desta toxina e seus efeitos crônicos, como mutagênese e carcinogênese A detecção de AFB1 pode ser realizada por métodos imunoenzimáticos, que são práticos, pouco laboriosos e de menor custo que os métodos convencionais A fim de definir o grau de contaminação por AFB1 na avicultura de postura, este trabalho padronizou e realizou a validação intralaboratorial de um método de ELISA competitivo indireto, e o aplicou para análise de amostras de milho (n=39), ração (n=4) e ovos (n=4) produzidos por duas granjas do Norte do Paraná Os parâmetros avaliados demonstraram que o método é válido para a detecção e quantificação de AFB1 Medidas de linearidade (R2>,99), precisão (CV<5%) e exatidão (recuperação entre 72,7% e 14,9%) foram adequados aos regulamentos para validação de métodos químicos Limites de detecção e quantificação foram estabelecidos em ,17ngg-1 e ,27ngg-1, respectivamente Não houve diferença estatística entre as granjas avaliadas, porém a análise das medianas sugere que a alimentação utilizada não possui o mesmo nível de contaminação Do total de amostras de milho, 56,4% foram positivas para AFB1 com contaminação média de 1,51±,94ngg-1 e variação entre ,11ngg-1 e 3,91ngg-1 Em ração, 87,5% foram positivas com média de 1,22±,97ngg-1, variando de ,4ngg-1 a 3,58ngg-1 Das amostras de ovo, 48,3% foram positivas com média de 1,±,77ngg-1 e variação entre ,3ngg-1 e 3,85ngg-1 Nenhuma das amostras de milho, ração ou ovo superou os limites estabelecidos para aflatoxinas Os resultados deste trabalho demostram que há elevada prevalência de AFB1 na avicultura de postura, no entanto as concentrações encontradas são baixas A análise deste contaminante deve ser frequente a fim de garantir a qualidade da alimentação animal e a segurança do produto finalItem Anticorpo monoclonal anti-AFB1 : coluna de imunoafinidade e espectrofluorimetria para controle de qualidade de alimentosHayashi, Luciana; Hirooka, Elisa Yoko [Orientador]; Itano, Eiko Nakagawa; Sabino, MyrnaResumo: A freqüente ocorrência de aflatoxina em produtos agrícolas causa impacto negativo no agronegócio brasileiro A aflatoxina tem sido classificada em grupo 1 por International Association in Research on Cancer A produção de imunorreagentes aliada ao desenvolvimento de métodos imunoquímicos possibilitariam o controle de qualidade acessível e de baixo custo, visando prevenção de contaminação e fornecimento de alimentos seguros ao consumidor Considerando a necessidade em minimizar a dependência de importação de kits imunoquímicos para análise avançada de resíduos tóxicos na rotina laboratorial, introduziu-se a tecnologia de produção de anticorpo monoclonal (AcM) empregando hibridoma linhagem AF4, secretor de IgG específico para aflatoxina B1 (AFB1) O cultivo celular em meio sintético resultou em 632,63 mg de IgG purificada (82,18 mg/mL), superando a expectativa da obtenção de AcM descrito na literatura (5, mg/mL), sendo este atingido devido ao uso de L-glutamina e cultivo até morte celular O AcM anti-AFB1 semi-purificado e liofilizado foi utilizado na confecção da coluna de imunoafinidade (CIA) empregando suporte gel ativado Affi-Gel 1 A CIA Affi-Gel 1 de ,5 mL apresentou capacidade de retenção de 25,32 ng de AFB1, sendo a toxina eluída com 15 mL de metanol Para quantificação empregou-se a espectrofluorimetria, padronizando o comprimento de onda para 36nm de excitação e 42 nm de emissão, baseado na maior sensibilidade e estabilidade entre leituras consecutivas de AFB1 pura A CIA Affi-Gel 1 desenvolvida não foi totalmente eficaz na limpeza de milho artificialmente contaminado com AFB1 O capeamento da coluna ainda deve prosseguir com ensaios de melhoria, para atingir a eficácia equivalente à da CIA comercial Aflatest-P (VICAM) (recuperação de AFB1 de 72,4 a 79,77 %) Outrossim, considerando a especificidade comprovada de AcM anti-AFB1 produzido por meio do teste de capacidade de retenção, deve-se prosseguir estudo inserindo novas condições de capeamento de coluna e ensaios de padronização Quanto à reutilização de CIA comercial Aflatest-P, após regeneração de coluna, os resultados mostraram-se variáveis, com 34,15 a 82,88 % de recuperação de AFB1 O fato indicou que as colunas comerciais podem inferir erro de análise se reutilizadas, contra-indicando o reuso Em suma, a produção de AcM IgG anti-AFB1 foi atingida com sucesso, sendo aconselhável proceder ultrafiltração na etapa de concentração e manutenção a 4º C para conservar a integridade e atividade biológica do anticorpo Assim, a disponibilidade de AcM específico, limpeza de extrato alimentar em única etapa cromatográfica, uso reduzido de solventes tóxicos e possibilidade de reutilização, justificam o desenvolvimento de CIA, visando minimizar o custo referente à aquisição e aplicação no controle de qualidadeItem Anticorpo monoclonal anti-aflatoxina B1 : aplicação em imunoensaio enzimático, imunofluorescência in situ e estudo da toxicidade em embrião de frangoMédici, Lívia Montanheiro; Hirooka, Elisa Yoko [Orientador]; Garda-Buffon, Jaqueline; Itano, Eiko NakagawaResumo: O Brasil é líder mundial em exportação de carne de frango e o segundo maior produtor, a garantia da saúde e produção animal é essencial na manutenção de posição destaque perante economia nacional e mundial As aflatoxinas (AF), metabólitos secundários produzidos por fungos do gênero Aspergillus, constituem ameaça por contaminar alimentos e rações e causar efeitos tóxicos e carcinogênicos em humanos e animais A imunoquímica se destaca na análise de micotoxinas pela sensibilidade, confiabilidade e simplicidade, a exemplo de ensaio imunoenzimático ic-ELISA para quantificação e imunofluorescência na detecção tecidual Com enfoque no desenvolvimento de métodos imunoquímicos, anticorpo monoclonal (AcM) antiaflatoxina foi produzido in vitro, cultivando hibridoma linhagem AF4 em meio RPMI + 5% de soro fetal bovino (SFB), seguido de adaptação gradual ao meio H-SFM, obtendo-se total de 58,6 mg de anticorpo purificado O AcM diluído ao título de 1:1 permitiu quantificação de AFB1 em fígado de frango por ic-ELISA Na validação intralaboratorial do ic-ELISA, a interferência de matriz não contaminada (fígado), foi avaliada no fator de diluição entre 2 a 15, sendo a diluição 5x escolhida pelo menor CV (14%) e melhor recuperação (1%) Em seguida, as curvas padrão na ausência e presença da matriz foram comparadas pela porcentagem de ligação de cinco pontos (,5 ng/mL a 5, ng/mL), não obtendo diferença significativa (p > ,5) A curva padrão de AFB1 demonstrou linearidade adequada, expressa pela equação de regressão y = -1334 ln(x) + 5352 e R2 de ,9917 (p < 5) As taxas de recuperação foram 9,5; 91,3 e 81,3% para 1,5; 3, e 5, ng/g, respectivamente A precisão do método foi avaliada por repetibilidade (CV de 3,8; 4,6 e 4,% para 1,5; 3, e 5, ng/g) e precisão intermediária (CV de 4,7; 7, e 5,% para 1,5; 3, e 5, ng/g), estando todos os valores dentro dos limites preconizados pelas agências reguladoras A robustez foi avaliada pela troca de analistas, instrumento (micropipeta) e tempo de sensibilização (18 e 24 h) da placa; o CV foi de 4 a 8% para sete curvas padrão realizadas por analistas diferentes, o CV médio obtido pela troca de instrumento e tempo de sensibilização foi de 5,2%, garantindo robustez para as três variáveis testadas O limite de detecção foi de 1,2 ng/g e limite de quantificação de 1,5 ng/g O AcM, ao título de 1:1, foi também aplicado na detecção direta de AFB1 em tecido hepático de embrião de frango por imunohistoquímica colorimética (DAB-diaminobenzidina) e imunofluorescência (FICT-Fluorescein Isothiocyanate) Análise macroscópica, histológica e imuno-histoquímica foram conduzidas em quatro grupos experimentais, sendo G1: sem tratamento; G2: controle negativo da solução veículo (5% DMSO: 5% H2O); G3: 5 ng AFB1/ovo e G4: 1 µg AFB1/ovo, injetados via saco de gema Após 24 h de exposição, os embriões foram eutanaziados para análise (taxa de sobrevivência de 85,7%; 42,9%; 28,6% e % para os grupos G1, G2, G3 e G4, respectivamente) Não houve diferença significativa no tamanho dos órgãos entre os grupos (p > ,5) As lesões macroscópicas evidentes nos grupos tratados com AFB1 foram hemorragia no coração (42,9% no G4; 28,6% no G3; 14,3% no G2 e sem observações no G1) e pulmão (57,1% no G4; 42,9% no G3 e sem observações no G2 e G1) Fígado e rins hemorrágicos foram evidenciados com maior frequência nos grupos tratados e controle (71,4% no G4 e G3; 42,9% no G2 e 14,3% no G1, para fígado; e 57,1% no G4, G3 e G2 e 14,3% no G1, para rim), visto que o veículo DMSO também apresentou toxidez contra os embriões Órgãos friáveis, que caracterizam os primeiros sinais de aflatoxicose, foram evidenciados no G4 (57,1%) e G3 (42,8%), mas não nos grupos controle Na análise 7 histológica, não houve diferença significativa no escore lesional total hepático entre os grupos G2, G3 e G4 (escore de 13,9; 14,1 e 16,3, respectivamente; p > ,5), mas estes grupos diferiram em relação ao G1 (escore de 3,1; p < ,5) A presença de dissociação dos hepatócitos, necrose e inflamação aleatória foram expressivas nos grupos tratados com AFB1 e DMSO, não sendo detectadas no G1 Na imuno-histoquímica, ambas as técnicas colorimétrica e fluorescente foram capazes de detectar AFB1 no tecido, sendo que a imunofluorescência permitiu a visualização definida da marcação da toxina nos hepatócitos, se comparada à colorimétrica, que marcou toda a extenção dos hepatócitos com deposição do DAB A produção ilimitada de AcM permitiu desenvolver imunoensaio ic-ELISA com custo 16 vezes inferior aos kits comerciais, assim como permitiu a detecção direta de toxina no tecido, mostrando-se promissor para triagem de AFB1 em fígado de frango e no diagnóstico de aflatoxicosesItem Imunoensaio ic-elisa desenvolvido para aflatoxina : detecção de níveis residuais e qualidade de ovo da região norte do Paraná-BRAmorim, Thaís Marques; Hirooka, Elisa Yoko [Orientador]; Oba, Alexandre; Itano, Eiko Nakagawa; Yamashita, Cássia Reika Takabayashi [Coorientadora]Resumo: A cadeia de produção brasileira de ovos destina-se principalmente a fornecer ovos para consumo direto in natura, mas também um ingrediente importante para a indústria de alimentos, devido as propriedades físico-químicas, com seu papel estabelecido em emulsificação, aeração, ligação e estabilização Para evitar a contaminação por microorganismos patogênicos e níveis residuais de aflatoxina B1, deve haver um rigoroso controle de qualidade em toda a cadeia produtiva Amostras de ovo provenientes de duas granjas da região Norte do Paraná, no Brasil, foram avaliadas por meio de imunoensaio enzimático indireto competitivo (ic-ELISA), desenvolvido com anticorpo monoclonal (AcM) anti-aflatoxina B1 previamente produzidos por uma cultura de hibridoma AF4 diluída (título 1: 3) e aplicada a ic-ELISA A contaminação por aflatoxina AFB1 foi analisada em 3 amostras de ovo coletadas aleatoriamente (n = 2 para a granja A e n = 1 para a granja B) A validação intra-laboratorial apresentou linearidade adequada (R2 = ,9922), com limites de detecção e quantificação de ,38 µg/Kg e ,71 µg/Kg, respectivamente O ensaio desenvolvido apresentou baixa interferência de matriz (3,41 %), com taxas médias de recuperação 95,5; 11 e 99,2 % para os seguintes níveis de contaminação 1,; 2, e 5, ng/g (CV de 12,; 1,2 e 5,1 %), respectivamente A precisão, avaliada por meio da repetibilidade (CV= 12, %) e precisão intermediária (CV=14,8 %), apresentou valores de acordo com o preconizado pela ANVISA, do Ministério da Saúde do Brasil Do total de amostras analisadas na granja A, 7,5 % obtiveram nível de aflatoxina > LQ, com variação de ,72 a 1,12 ug/Kg A contaminação na granja B variou de ,71 a 1,29 ug/Kg, com 14 % das amostras > LQ Em relação ao perfil de qualidade do ovo, o peso médio do inteiro foi de 56,24 g ± 3,33 e 58,85 g ± 3,4 para as granjas A e B, respectivamente; o peso médio da gema foi de 16, 72 g ± 1,41 para a granja A e 17,85 g ± 1,42 para a granja B; o peso da clara foi de 33,68 g ± 2,35 para a granja A e 34,98 g ± 2,93 para a granja B A casca apresentou características macroscópicamente normais, com percentual de 1,4 % ± ,86 para granja A, e para granja B o valor obtido foi de 1,24 % ± ,71 E espessura da casca de ,37 mm ± ,4 e ,373 mm ± ,4 para a granja A e para a granja B , respectivamente O imunoensaio ic-ELISA desenvolvido consistiu numa ferramenta de triagem de uso rápido, fácil e econômico, mostrando-se um método promissor para detecção de AFB1 em ovoItem Imunoensaio ic-ELISA para aflatoxina : desenvolvimento, padronização e validação visando análise em amendoimSilva, André Ribeiro da; Hirooka, Elisa Yoko [Orientador]; Hashimoto, Elisabete Hiromi; Ishikawa, Angélica Tieme; Yamashita, Cássia Reika Takabayashi [Coorientadora]Resumo: O Estado de São Paulo se destaca pela maior produção de amendoim do Brasil, ocupando 92% da produção nacional A cultura do amendoim é suscetível à contaminação por aflatoxinas Estes metabólitos secundários tóxicos produzidos por fungos do gênero Aspergillus, apresentam efeitos tóxicos e carcinogênicos ao homem e animais O desenvolvimento de metodologias de triagem confiáveis, rápido e simples como o ensaio imunoenzimático pode ser alcançado empregando anticorpo monoclonal (AcM) O objetivo deste trabalho foi desenvolver, padronizar e validar imunoensaio enzimático indireto competitivo (ic-ELISA) para quantificação de aflatoxina B1 em amendoim Amendoins da região Alta Paulista, estado de São Paulo, foram avaliados, utilizando anticorpo monoclonal (AcM) anti-aflatoxina B1 produzido in vitro por cultivo da linhagem de hibridoma AF4 Sessenta amostras de lotes de amendoim fornecidos por indústria de processamento localizada na região de Marília-SP (n = 42 amendoim não blancheado e n = 18 amendoim blancheado) foram analisados quanto à umidade, atividade de água e AFB1 Cada lote representou cinco toneladas de amendoim da cultivar IAC Runner 886, da safra 214 / 15 e 215 / 16 O plano de amostragem foi realizado segundo estabelecido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA A validação intra-laboratorial apresentou boa linearidade (R2 = ,9993), limite de detecção e quantificação de 1,13 ng/g e 3,59 ng/g, respectivamente, com taxas médias de recuperação de AFB1 de 14,4; 11,7 e 17,% para as concentrações de 4, 1 e 2 ng/g (CV de 4,9; 7,9 e ,7%), respectivamente O ic-ELISA mostrou boa precisão, expressa pela repetibilidade através da precisão intracorrida (CV= 1,87%) e precisão intermediária, através de precisão intercorrida (CV=6,75%) O teor de umidade variou de 4,3 a 7,89% (média de 6,9 % ± ,18), sendo que nenhuma amostra ultrapassou o limite máximo permitido (8,%) A atividade de água apresentou a variação de ,48 a ,69 Os resultados revelaram AFB1 em concentração variando de 1,13 a 29,2 ng/g No entanto, apenas duas amostras (3,3%) apresentaram níveis de contaminação acima de 2 ng/g, limite máximo estabelecido pela legislação Brasileira, sendo que 48,35% (n = 29) estavam abaixo do limite de quantificação Em relação a legislação da Comunidade Européia, 76% das amostras (n = 46) apresentaram níveis em conformidade com o limite máximo permitido para amendoim (8 ng/g) a ser submetido a triagem ou outro tratamento físico antes do consumo humano, sendo que destas, 35% (n = 21) estavam de acordo se for considerar amendoim processado pronto para consumo humano (2 ng/g) Concluindo, este ic-ELISA desenvolvido pode consistir numa ferramenta de uso fácil para monitoramento rápido na cadeia produtiva de amendoim, contribuindo para a redução de perigo através da detecção e segregação de lotes contaminadosItem Teratogênese e histopatologia em larvas de tilápia (Oreochromis niloticus) expostas à aflatoxina B1, microcistina e glifosatoRamos, Cleiton Inácio; Hirooka, Elisa Yoko [Orientador]; Rocha, Odete; Kuroda, Emília KiyomiResumo: O aumento universal na demanda por produtos de pescado requer implementação de práticas capazes de assegurar a qualidade do produto final, sendo prioritário o manejo adequado aliado ao rigoroso controle de qualidade d'água A adição de ração eleva o teor de nutrientes da água e pode resultar na eutrofização, morte de peixes e proliferação de cianofíceas produtoras de microcistinas (MCs) O acúmulo tecidual de MCs em peixes pode potencializar o efeito de aflatoxinas (AFs) ingeridas através do consumo de ração Em adição, o uso de herbicidas a base de glifosato é comum na agricultura, com efeito mutagênico e hepatotóxico demonstrado Considerando que AF seja potente iniciador de câncer hepático, aliado ao efeito promotor de MCs e uso contínuo de glifosato, a coocorrência de contaminantes representaria um perigo em potencial na qualidade dos pescados e na saúde humana O objetivo do trabalho foi investigar efeito teratogênico e histológico (fígado e rim) de aflatoxina B1 (AFB1), extrato celular de Microcystis sp TAC 95 produtora de MC-LR em grande concentração e herbicida comercial Roundup® (princípio ativo glifosato) de forma isolada e combinada destes compostos em ovos de tilápia (Oreochromis niloticus) e em respectivo desenvolvimento larval A exposição aos contaminantes foi iniciada em ovos (placas de Petri, 5ng/mL de AFB1 por 1 hora), seguida de MC (5?jg de microcistina/L) e/ou GF (5jL de produto comercial/L) em placas de cultura celular Malformações como megalocardia, desvio da cauda e da coluna, foram registradas em fase larval, porém esses efeitos reverteram antes da fase pós-larval, decorrente de baixo nível de exposição, independentemente do contaminante De acordo com o sistema de escore estabelecido, a MC-LR afetou em maior intensidade os animais, enquanto a AFB1 não demonstrou efeito detectável sob as larvas, provavelmente devido à concentração utilizada no ensaio Embora ocorreram alterações teciduais, como diminuição da freqüência de núcleos e presença de núcleos vacuolizados, somente as alterações hepáticas diferiram estatisticamente (P<,5) do tratamento controle Em relação a histologia, os resultados mais significantes foram atribuídos ao GF, e não se observando efeito da AFB1 Os resultados mostraram que MC e GF, mesmo em doses consideradas baixas e sem efeito tóxico agudo, podem desencadear alterações nos tecidos hepático e renal durante a ontogênese de tilápia e induzindo a leve teratogênese