Anticorpo monoclonal anti-aflatoxina B1 : aplicação em imunoensaio enzimático, imunofluorescência in situ e estudo da toxicidade em embrião de frango
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Resumo: O Brasil é líder mundial em exportação de carne de frango e o segundo maior produtor, a garantia da saúde e produção animal é essencial na manutenção de posição destaque perante economia nacional e mundial As aflatoxinas (AF), metabólitos secundários produzidos por fungos do gênero Aspergillus, constituem ameaça por contaminar alimentos e rações e causar efeitos tóxicos e carcinogênicos em humanos e animais A imunoquímica se destaca na análise de micotoxinas pela sensibilidade, confiabilidade e simplicidade, a exemplo de ensaio imunoenzimático ic-ELISA para quantificação e imunofluorescência na detecção tecidual Com enfoque no desenvolvimento de métodos imunoquímicos, anticorpo monoclonal (AcM) antiaflatoxina foi produzido in vitro, cultivando hibridoma linhagem AF4 em meio RPMI + 5% de soro fetal bovino (SFB), seguido de adaptação gradual ao meio H-SFM, obtendo-se total de 58,6 mg de anticorpo purificado O AcM diluído ao título de 1:1 permitiu quantificação de AFB1 em fígado de frango por ic-ELISA Na validação intralaboratorial do ic-ELISA, a interferência de matriz não contaminada (fígado), foi avaliada no fator de diluição entre 2 a 15, sendo a diluição 5x escolhida pelo menor CV (14%) e melhor recuperação (1%) Em seguida, as curvas padrão na ausência e presença da matriz foram comparadas pela porcentagem de ligação de cinco pontos (,5 ng/mL a 5, ng/mL), não obtendo diferença significativa (p > ,5) A curva padrão de AFB1 demonstrou linearidade adequada, expressa pela equação de regressão y = -1334 ln(x) + 5352 e R2 de ,9917 (p < 5) As taxas de recuperação foram 9,5; 91,3 e 81,3% para 1,5; 3, e 5, ng/g, respectivamente A precisão do método foi avaliada por repetibilidade (CV de 3,8; 4,6 e 4,% para 1,5; 3, e 5, ng/g) e precisão intermediária (CV de 4,7; 7, e 5,% para 1,5; 3, e 5, ng/g), estando todos os valores dentro dos limites preconizados pelas agências reguladoras A robustez foi avaliada pela troca de analistas, instrumento (micropipeta) e tempo de sensibilização (18 e 24 h) da placa; o CV foi de 4 a 8% para sete curvas padrão realizadas por analistas diferentes, o CV médio obtido pela troca de instrumento e tempo de sensibilização foi de 5,2%, garantindo robustez para as três variáveis testadas O limite de detecção foi de 1,2 ng/g e limite de quantificação de 1,5 ng/g O AcM, ao título de 1:1, foi também aplicado na detecção direta de AFB1 em tecido hepático de embrião de frango por imunohistoquímica colorimética (DAB-diaminobenzidina) e imunofluorescência (FICT-Fluorescein Isothiocyanate) Análise macroscópica, histológica e imuno-histoquímica foram conduzidas em quatro grupos experimentais, sendo G1: sem tratamento; G2: controle negativo da solução veículo (5% DMSO: 5% H2O); G3: 5 ng AFB1/ovo e G4: 1 µg AFB1/ovo, injetados via saco de gema Após 24 h de exposição, os embriões foram eutanaziados para análise (taxa de sobrevivência de 85,7%; 42,9%; 28,6% e % para os grupos G1, G2, G3 e G4, respectivamente) Não houve diferença significativa no tamanho dos órgãos entre os grupos (p > ,5) As lesões macroscópicas evidentes nos grupos tratados com AFB1 foram hemorragia no coração (42,9% no G4; 28,6% no G3; 14,3% no G2 e sem observações no G1) e pulmão (57,1% no G4; 42,9% no G3 e sem observações no G2 e G1) Fígado e rins hemorrágicos foram evidenciados com maior frequência nos grupos tratados e controle (71,4% no G4 e G3; 42,9% no G2 e 14,3% no G1, para fígado; e 57,1% no G4, G3 e G2 e 14,3% no G1, para rim), visto que o veículo DMSO também apresentou toxidez contra os embriões Órgãos friáveis, que caracterizam os primeiros sinais de aflatoxicose, foram evidenciados no G4 (57,1%) e G3 (42,8%), mas não nos grupos controle Na análise 7 histológica, não houve diferença significativa no escore lesional total hepático entre os grupos G2, G3 e G4 (escore de 13,9; 14,1 e 16,3, respectivamente; p > ,5), mas estes grupos diferiram em relação ao G1 (escore de 3,1; p < ,5) A presença de dissociação dos hepatócitos, necrose e inflamação aleatória foram expressivas nos grupos tratados com AFB1 e DMSO, não sendo detectadas no G1 Na imuno-histoquímica, ambas as técnicas colorimétrica e fluorescente foram capazes de detectar AFB1 no tecido, sendo que a imunofluorescência permitiu a visualização definida da marcação da toxina nos hepatócitos, se comparada à colorimétrica, que marcou toda a extenção dos hepatócitos com deposição do DAB A produção ilimitada de AcM permitiu desenvolver imunoensaio ic-ELISA com custo 16 vezes inferior aos kits comerciais, assim como permitiu a detecção direta de toxina no tecido, mostrando-se promissor para triagem de AFB1 em fígado de frango e no diagnóstico de aflatoxicoses
Descrição
Palavras-chave
Aflatoxina, Micotoxinas, Carne de ave, Anticorpos monoclonais, Galinha, Aflatoxins, Mycotoxins, Poultry as food, Monoclonal antibodies, Embryo, Chicken