01 - Doutorado - Ciência de Alimentos

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Navegando 01 - Doutorado - Ciência de Alimentos por Assunto "Aflatoxinas"

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    Aflatoxina na cadeia produtiva de amendoim no Estado de São Paulo, principal produtor nacional
    (2023-09-11) Silva, André Ribeiro da; Hirooka, Elisa Yoko; Ono, Elisabete Yurie Sataque; Tanaka, Alice Yoshiko; Hashimoto, Elisabete Hiromi; Lopes, Daiane Dias; Maciel, Leonardo Fonseca
    O Estado de São Paulo é o principal produtor de amendoim no Brasil, responsável por aproximadamente 90% da produção nacional, dos quais 80% são exportados para a Rússia, Holanda, Argélia e alguns países da comunidade europeia. O amendoim é suscetível à contaminação por fungos do gênero Aspergillus spp. e às Aflatoxinas (AFs). Estes metabólitos tóxicos são conhecidos por sua ação carcinogênica em seres humanos e animais. Devido aos riscos à saúde, é essencial que toda a cadeia produtiva do amendoim e de seus derivados sejam rigorosamente monitorados para garantia da segurança desses produtos. O objetivo deste trabalho foi realizar um monitoramento de AFs em um total de quatrocentos e sessenta lotes de amendoim in natura, ao longo de um período de três safras (2016/17 [n=80]; 2017/18 [n=160]; 2018/19 [n=220]). Além de detectar AFs e avaliar a qualidade microbiológica de cinquenta e duas amostras paçocas produzidas e comercializadas no Estado de São Paulo. A análise microbiológica incluiu a detecção de microrganismos indicadores, tais como coliformes termotolerantes, Salmonella sp., Escherichia coli, bolores e leveduras e contagem total de microrganismos mesófilos aeróbios. A confiabilidade da análise rápida de AFs realizada em tempo real usando a coluna de imuno afinidade e fluorimetria (IAC-fluorimetria) foi avaliada comparando os resultados com um ensaio enzimático indireto competitivo validado (ic-ELISA) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-FLR). Os resultados mostraram que a correlação de Pearson (r) entre HPLC-FLD e IAC-fluorimetria foi de 0,86, enquanto a correlação entre IAC-fluorimetria e ic-ELISA foi de 0,90. Em relação à presença de AFs, 60% das amostras (277 lotes) apresentaram níveis totais de AFs abaixo do limite máximo estabelecido pela comunidade europeia (= 4,0 µg.kg-1). 70 lotes (15,2%) excederam os níveis máximos de aflatoxinas estabelecidos pela legislação brasileira (20,0 µg.kg-1). Foram analisadas 52 amostras de paçoca, sendo 37 produzidas pelo processo de prensagem a frio e 15 pelo processo cozido, de 27 municípios do estado de São Paulo. A pesquisa utilizou Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas (UPLC-MS/MS) para a detecção AFs, com limites de quantificação (LOQ) estabelecidos em 0,29 µg.kg-1 para AFB1 e AFG2, 0,36 e 0,37 µg.kg-1 para AFG1 e AFB2, respectivamente. As médias de recuperação para as AFs foram de 89,2, 83,5, 80,5 e 82,8% respectivamente para AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2. Os resultados revelaram que as aflatoxinas foram detectadas em 71% das amostras de paçoca, com níveis variando de 0,29 a 38,8 µg.kg-1 e uma média de 7,06 µg.kg-1. Seis amostras (16%) excederam o limite tolerável de aflatoxina total (AFT, 20 µg.kg-1) estabelecido pela legislação brasileiras. A AFB1 foi a de maior incidência, presente em 75% das amostras de paçoca prensada e 60% das amostras de paçoca cozida. As paçocas cozidas apresentaram níveis superiores de umidade e atividade de água, bem como contagens microbianas mais elevadas, incluindo bactérias aeróbias mesófilas e coliformes termotolerantes. Vinte e uma amostras (56%) apresentaram contaminação por fungos e leveduras variando de 1,0 a 4,25 log UFC.g-1. A contagem total de bactérias mesófilas aeróbias na paçoca cozida (4,85 logs UFC.g-1) foi maior do que na paçoca prensada (2,77 log UFC g-1; p<0,05). Coliformes termotolerantes foram detectados em 7 amostras prensadas, que variaram de 3,6 a > 1100 NMP.g-1; E. coli foi confirmada nas mesmas amostras na faixa de 3,0 a 160 NMP. g-1. A detecção de Salmonella sp. em duas amostras de paçoca prensada indica a necessidade de melhorias na higiene e no processo de fabricação, bem como a importância de medidas de controle ao longo da cadeia de produção. Embora os níveis de contaminação por aflatoxinas em amendoim e seus derivados tenham apresentado redução, quando comparado às últimas duas décadas, este estudo ressalta a importância de um controle rigoroso no processo de produção de paçocas, para evitar a exposição do consumidor a aflatoxinas e microrganismos patogênicos.
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    Estratégias inovadoras no controle de toxinas naturais: levedura recombinante para biodegradação de microcistinas e método para monitoramento de aflatoxinas em queijo minas frescal
    (2024-09-06) Silva, Fernando de Godoi; Hirooka, Elisa Yoko; Magnani, Marciane; Nóbrega, Gisele Maria de Andrade de; Kuroda, Emília Kiyomi; Oliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de; Lopes, Daiane Dias
    Toxinas naturais, contaminantes inevitáveis em alimentos e água, constituem perigo crescente ao mundo globalizado com impacto direto à saúde humana, prejuízos econômicos e, restrição na disponibilidade de alimentação segura à população. Medidas de controle visam constante monitoramento e procedimentos de descontaminação para assegurar o abastecimento, seja de água ou de matéria-prima agropecuária comsegurança ratificada a níveis oficialmente recomendados. Cianotoxinas e micotoxinas, metabólitos secundários microbianos, se destacam pela prevalência de contaminação e toxicidade. Microcistinas (MCs), cianotoxinas hepatotóxicas de ocorrência principal em água são produzidas por cianobactérias. Por outro lado, as aflatoxinas (AFs), micotoxinas de Aspergillusspp., com ênfase na AFB1, são cancerígenos comprovados do grupo 1 (IARC) alvos de regulamentação pelo agronegócio internacional. Visando contribuição ao controle de MCs e AFs, este trabalho apresenta três tópicos: (i) Avanço na tecnologia de DNA recombinante e desenvolvimento de alternativa para biodegradação de MCs por cepa GRAS de Saccharomyces cerevisiaebaseada na expressão de gene mlrAcódon-otimizado para levedura. (ii) Caracterização da microcistinase A recombinante perante biodegradação de MCs. (iii) Disponibilização de ferramentas de controle de toxinas naturais, com foco no monitoramento de AFs e análise em amostras de queijo Minas frescal. No primeiro tópico, o gene mlrA,codificador da enzima microcistinase A que lineariza e reduz a toxicidade de MCs, foi confeccionado com base no genoma de Sphingosinicella microcystinivoranscepa B9 para recombinação gênica e expressão em S. cerevisiae. Um primeiro plasmídeo contendo promotor e terminador de S. cerevisiaee sítio múltiplo de clonagem foi utilizado para expressão. O segundo plasmídeo contendo regiões de homologia para o locus URA3foi usado para integração cromossomal de mlrA. O sucesso nas técnicas de expressão plasmidial e integração cromossomal do gene foram confirmadas por PCR. A levedura recombinante PE-2 com expressão plasmidial de mlrA biodegradou 69,6% (205ng/mL) de MCs em 72 horas e 83% (267ng/mL) em 120 horas de cultivo, comprovando a eficácia desta alternativa biotecnológica. No experimento seguinte (tópico ii) avaliou-se a atividade da microcistinase A gerada a partir do primeiro experimento. De início foram testados diferentes métodos de lise da parede celular, obtendo extrato concentrado em enzima. Na avaliação da cinética enzimática foi obtida taxa máxima de degradação de MC de 3,09mg/L/h e constante de Michaelis-Menten de 2,81µM. Alta atividade da enzima foi observada em pH neutro e em temperatura na faixa 35-57,5ºC. Em pH alcalino e temperaturas >65ºC a enzima foi inativada. Condições ótimas de atividade foram definidas em pH 6,3 e 42,2ºC. Em suma, a levedura recombinante gerada demonstrou alto potencial de expressão da microcistinase A, cujos dados fornecem base científica-tecnológica a avanços na biodegradação de MCs. No último experimento (tópico iii) foi desenvolvido e validado um método de UPLC-FLR para detecção simultânea de AFM1e AFB1em queijo minas frescal. Os resultados da validação foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados: linearidade (R²>0,99), exatidão (recuperação média: 81-105% para AFM1; 80-109% para AFB1), precisão (RSD<18%), e baixo limite de quantificação (0,03µg/kg para AFM1e 0,31µg/kg para AFB1). Ainda que nenhuma das 20 amostras analisadas de queijo minas frescal tenha apresentado contaminação detectável, salienta-se que o método validado, implementado como ferramenta de monitoramento, contribui para garantir a segurança e agregar valor a este produto essencialmente nacional. Assim, o trabalho executado atingiu os objetivos, propondo novas opções ao controle de toxinas naturais de ocorrência universal em dois recursos interdependentes – água e alimentos, essenciais ao desenvolvimento e saúde humana. Os dados aqui apresentados poderão fundamentar avanços em estudos, promover aplicações práticas e aprimorar os métodos de controle de toxinas naturais, visando reduzir impactos destes contaminantes na saúde pública