Estratégias inovadoras no controle de toxinas naturais: levedura recombinante para biodegradação de microcistinas e método para monitoramento de aflatoxinas em queijo minas frescal
Data
2024-09-06
Autores
Silva, Fernando de Godoi
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Resumo
Toxinas naturais, contaminantes inevitáveis em alimentos e água, constituem perigo crescente ao mundo globalizado com impacto direto à saúde humana, prejuízos econômicos e, restrição na disponibilidade de alimentação segura à população. Medidas de controle visam constante monitoramento e procedimentos de descontaminação para assegurar o abastecimento, seja de água ou de matéria-prima agropecuária comsegurança ratificada a níveis oficialmente recomendados. Cianotoxinas e micotoxinas, metabólitos secundários microbianos, se destacam pela prevalência de contaminação e toxicidade. Microcistinas (MCs), cianotoxinas hepatotóxicas de ocorrência principal em água são produzidas por cianobactérias. Por outro lado, as aflatoxinas (AFs), micotoxinas de Aspergillusspp., com ênfase na AFB1, são cancerígenos comprovados do grupo 1 (IARC) alvos de regulamentação pelo agronegócio internacional. Visando contribuição ao controle de MCs e AFs, este trabalho apresenta três tópicos: (i) Avanço na tecnologia de DNA recombinante e desenvolvimento de alternativa para biodegradação de MCs por cepa GRAS de Saccharomyces cerevisiaebaseada na expressão de gene mlrAcódon-otimizado para levedura. (ii) Caracterização da microcistinase A recombinante perante biodegradação de MCs. (iii) Disponibilização de ferramentas de controle de toxinas naturais, com foco no monitoramento de AFs e análise em amostras de queijo Minas frescal. No primeiro tópico, o gene mlrA,codificador da enzima microcistinase A que lineariza e reduz a toxicidade de MCs, foi confeccionado com base no genoma de Sphingosinicella microcystinivoranscepa B9 para recombinação gênica e expressão em S. cerevisiae. Um primeiro plasmídeo contendo promotor e terminador de S. cerevisiaee sítio múltiplo de clonagem foi utilizado para expressão. O segundo plasmídeo contendo regiões de homologia para o locus URA3foi usado para integração cromossomal de mlrA. O sucesso nas técnicas de expressão plasmidial e integração cromossomal do gene foram confirmadas por PCR. A levedura recombinante PE-2 com expressão plasmidial de mlrA biodegradou 69,6% (205ng/mL) de MCs em 72 horas e 83% (267ng/mL) em 120 horas de cultivo, comprovando a eficácia desta alternativa biotecnológica. No experimento seguinte (tópico ii) avaliou-se a atividade da microcistinase A gerada a partir do primeiro experimento. De início foram testados diferentes métodos de lise da parede celular, obtendo extrato concentrado em enzima. Na avaliação da cinética enzimática foi obtida taxa máxima de degradação de MC de 3,09mg/L/h e constante de Michaelis-Menten de 2,81µM. Alta atividade da enzima foi observada em pH neutro e em temperatura na faixa 35-57,5ºC. Em pH alcalino e temperaturas >65ºC a enzima foi inativada. Condições ótimas de atividade foram definidas em pH 6,3 e 42,2ºC. Em suma, a levedura recombinante gerada demonstrou alto potencial de expressão da microcistinase A, cujos dados fornecem base científica-tecnológica a avanços na biodegradação de MCs. No último experimento (tópico iii) foi desenvolvido e validado um método de UPLC-FLR para detecção simultânea de AFM1e AFB1em queijo minas frescal. Os resultados da validação foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados: linearidade (R²>0,99), exatidão (recuperação média: 81-105% para AFM1; 80-109% para AFB1), precisão (RSD<18%), e baixo limite de quantificação (0,03µg/kg para AFM1e 0,31µg/kg para AFB1). Ainda que nenhuma das 20 amostras analisadas de queijo minas frescal tenha apresentado contaminação detectável, salienta-se que o método validado, implementado como ferramenta de monitoramento, contribui para garantir a segurança e agregar valor a este produto essencialmente nacional. Assim, o trabalho executado atingiu os objetivos, propondo novas opções ao controle de toxinas naturais de ocorrência universal em dois recursos interdependentes – água e alimentos, essenciais ao desenvolvimento e saúde humana. Os dados aqui apresentados poderão fundamentar avanços em estudos, promover aplicações práticas e aprimorar os métodos de controle de toxinas naturais, visando reduzir impactos destes contaminantes na saúde pública
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Palavras-chave
Microcistinase A, Recombinação gênica, Biodegradação de microcistinas, Aflatoxinas, Cromatografia líquida, Microcistinas, Biodegradação, DNA recombinante, Engenharia genética, Saccharomyces cerevisiae, Segurança alimentar, Queijo minas frescal