01 - Doutorado - Patologia Experimental
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Navegando 01 - Doutorado - Patologia Experimental por Assunto "Antígenos de fungos"
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Item Análise da reatividade de IgG/IgG2 a epítopos de carboidratos de espécies de Paracoccidioides e detecção de casos de Paracoccidioidomicose infecção na população de Guarapuava, PRVidal, Adriane Lenhard; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Venâncio, Emerson José; Marquez, Audrey de Souza; Tatibana, Berenice TomokoResumo: Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelos fungos termodimórficos Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidiodies lutzii, sendo restrita a América Latina e endêmica no Brasil Acredita-se que a infecção ocorra pela inalação de propágulos fúngicos quando o solo é revolvido A PCM pode ser dividida em: (1) PCM infecção, sem sintomas, mas com reação positiva aos antígenos de Paracoccidioides spp, com prevalência muito variável entre regiões; e (2) PCM doença, classificada em (2a) PCM aguda, condição mais grave que ocorre em crianças e jovens ou (2b) PCM crônica, que ocorre em adultos e soma aproximadamente 9% dos casos A presente pesquisa objetivou: (a) avaliar a reatividade de IgG/IgG2 de pacientes crônicos aos epítopos de carboidrato de Paracoccidioides spp; (b) avaliar epidemiologicamente os casos de PCM infecção em Guarapuava, PR, Brasil A investigação dos epítopos de carboidrato foi feita por immunoblot (IB) de cell free antigens (CFA) de P brasiliensis B339 (anteriormente espécie S1), Paracoccidioides americana LDR3 (anteriormente P brasiliensis PS2) e P lutzii LDR2, tratados ou não com metaperiodato de sódio (SMP) IgG de coelho anti-P brasiliensis Pb18 e IgG/IgG2 de um pool de soros de pacientes com PCM doença reconheceram principalmente antígenos de alta massa molecular (hMM, >15 kDa), gp7 e gp43, sendo esta última não detectada em P lutzii LDR2 A reatividade aos antígenos diminuiu com o tratamento com SMP Conclui-se que não foi possível detectar gp43 em P lutzii LDR2 e, como P brasiliensis, seus principais antígenos apresentam epítopos de carboidrato reconhecidos pelos soros de pacientes com PCM No levantamento epidemiológico sobre PCM infecção, 359 soros foram analisados por ELISA para detecção de IgG contra CFA de P brasiliensis B339, P americana LDR3 e P lutzii LDR2 Gp43 de B339 serviu de teste confirmatório Estes antígenos foram também testados após tratamento com SMP para redução de reações cruzadas Reatividade em ELISA: CFA/SMP-CFA em geral 37,3/17,8%, B339 25,3/14,5%, LDR3 24,5/1,4%, LDR2 8,3/5,8%; gp43/SMP-gp43 7,2/4,7% Houve soros reagentes para mais de uma espécie IB de 37 soros selecionados demonstrou diferentes padrões de reconhecimento de gp43, gp7 e hMM Residência em zona rural e profissões relacionadas ao manejo do solo foram identificados como fatores de risco P brasiliensis parece ser a espécie prevalente na área, mas 21 soros de pessoas que declararam ter vivido apenas na região foram reagentes com antígenos de P lutzii LDR2 IgG anti-gp7 e -hMM foram avaliados em amostras reagentes, mas com baixa reatividade: gp7/hMM em geral 6,4/6,7% O uso de SMP ou antígenos purificados podem não ser adequados para levantamentos sobre PCM infecção na região avaliada, portanto, recomenda-se o uso de CFA-ELISA Apesar de Guarapuava ser uma cidade de economia agrícola e estar localizada em região endêmica de PCM, a baixa prevalência para PCM infecção era esperada, considerando-se que a região teve relatos anteriores de menor endemicidade de PCM doença do que outras áreas do Paraná, mas as características gerais encontradas assemelham-se à outros trabalhos publicadosItem Fusarium verticillioides : identificação de antígeno espécie-específico e desenvolvimento de PCR-ELISA para detecção do fungoOmori, Aline Myuki; Ono, Mário Augusto [Orientador]; Santos, Joice Sifuentes dos; Sartori, Daniele; Itano, Eiko Nakagawa; Watanabe, Maria Angelica EharaResumo: Fusarium verticillioides é o principal patógeno de milho e pode causar desde uma infecção assintomática até o apodrecimento de todas as partes da planta Além disso, esse fungo é o principal produtor de fumonisinas, que estão relacionadas a doenças em humanos e animais Os métodos tradicionais utilizados para detectar fungos baseado em suas características morfológicas são demorados e apresentam baixa especificidade e sensibilidade A identificação e a caracterização de possíveis antígenos espécie-específicos com potencial para serem utilizados em métodos imunológicos bem como o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos para detecção desse fungo são importantes para o controle de qualidade do milho destinado à alimentação humana e animal Portanto, os objetivos deste trabalho foram identificar e caracterizar um antígeno de 67 kDa possivelmente espécie-específico de F verticillioides e desenvolver uma PCR-ELISA baseada no gene FUM21 A proteína de 67 kDa (p67) foi analisada por espectrometria de massa e sua atividade enzimática foi determinada em gel de poliacrilamida copolimerizado com amido, gelatina e soro albumina bovina A PCR-ELISA foi desenvolvida utilizando primers e sonda específicos para o gene FUM21 A especificidade da PCR-ELISA e da PCR convencional foi determinada analisando DNA de isolados de F verticillioides, F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, Aspergillus niger, A ochraceus, A carbonarius e Penicillium variabile e a sensibilidade dos métodos foi avaliada utilizando concentrações de 25 fg a 25 ng de DNA de F verticillioides 13G O efeito de matriz e a sensibilidade da PCR-ELISA e da PCR convencional em milho também foram analisados inoculando de 1 a 17 conídeos de F verticillioides 13G em milho triturado Duas possíveis proteínas resultaram da análise da p67 por espectrometria de massa: a proteína relacionada ao precursor da aminopeptidase Y de F fujikuroi e a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A análise da atividade enzimática da p67 revelou que a proteína apresenta atividade de amilase, sugerindo, portanto, que a p67 é a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A PCR-ELISA não apresentou positividade com DNA de F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, A niger, A ochraceus, A carbonarius e P variabile, e foi capaz de detectar cinco isolados de F verticillioides apresentando sensibilidade de 2,5 pg e 14 conídeos/g para DNA de cultura pura e para DNA de milho inoculado com suspensão de conídeos de F verticillioides, respectivamente, sendo 1 vezes mais sensível do que a PCR convencional Portanto, a p67 foi identificada como provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides o que permitirá a produção dessa proteína em sua forma recombinante em larga escala visando o desenvolvimento de método imunológico espécie-específico A PCR-ELISA foi específica para F verticillioides, foi mais sensível que a PCR convencional e apresentou potencial para ser utilizada na detecção de F verticillioides em amostras de milho