Fusarium verticillioides : identificação de antígeno espécie-específico e desenvolvimento de PCR-ELISA para detecção do fungo
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Resumo: Fusarium verticillioides é o principal patógeno de milho e pode causar desde uma infecção assintomática até o apodrecimento de todas as partes da planta Além disso, esse fungo é o principal produtor de fumonisinas, que estão relacionadas a doenças em humanos e animais Os métodos tradicionais utilizados para detectar fungos baseado em suas características morfológicas são demorados e apresentam baixa especificidade e sensibilidade A identificação e a caracterização de possíveis antígenos espécie-específicos com potencial para serem utilizados em métodos imunológicos bem como o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos para detecção desse fungo são importantes para o controle de qualidade do milho destinado à alimentação humana e animal Portanto, os objetivos deste trabalho foram identificar e caracterizar um antígeno de 67 kDa possivelmente espécie-específico de F verticillioides e desenvolver uma PCR-ELISA baseada no gene FUM21 A proteína de 67 kDa (p67) foi analisada por espectrometria de massa e sua atividade enzimática foi determinada em gel de poliacrilamida copolimerizado com amido, gelatina e soro albumina bovina A PCR-ELISA foi desenvolvida utilizando primers e sonda específicos para o gene FUM21 A especificidade da PCR-ELISA e da PCR convencional foi determinada analisando DNA de isolados de F verticillioides, F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, Aspergillus niger, A ochraceus, A carbonarius e Penicillium variabile e a sensibilidade dos métodos foi avaliada utilizando concentrações de 25 fg a 25 ng de DNA de F verticillioides 13G O efeito de matriz e a sensibilidade da PCR-ELISA e da PCR convencional em milho também foram analisados inoculando de 1 a 17 conídeos de F verticillioides 13G em milho triturado Duas possíveis proteínas resultaram da análise da p67 por espectrometria de massa: a proteína relacionada ao precursor da aminopeptidase Y de F fujikuroi e a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A análise da atividade enzimática da p67 revelou que a proteína apresenta atividade de amilase, sugerindo, portanto, que a p67 é a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A PCR-ELISA não apresentou positividade com DNA de F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, A niger, A ochraceus, A carbonarius e P variabile, e foi capaz de detectar cinco isolados de F verticillioides apresentando sensibilidade de 2,5 pg e 14 conídeos/g para DNA de cultura pura e para DNA de milho inoculado com suspensão de conídeos de F verticillioides, respectivamente, sendo 1 vezes mais sensível do que a PCR convencional Portanto, a p67 foi identificada como provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides o que permitirá a produção dessa proteína em sua forma recombinante em larga escala visando o desenvolvimento de método imunológico espécie-específico A PCR-ELISA foi específica para F verticillioides, foi mais sensível que a PCR convencional e apresentou potencial para ser utilizada na detecção de F verticillioides em amostras de milho
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Palavras-chave
Fusario, Fungos toxigênicos, Antígenos de fungos, Enzimas, Fusarium, Toxigenic fungi, Fungal antigens