02 - Mestrado - Microbiologia
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Item Avaliação do potencial de agentes biológicos e seus produtos no controle da cancro cítrico causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri(2006-02-06) Camargo, Flávia Regina Spago; Andrade Filho, Galdino; Mello, João Carlos Palazzo de; Homechin, MartinO Cancro cítrico asiático, causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) (Hasse), é uma doença mundialmente conhecida na maioria das áreas de produção comercial de citrus. Estratégias limitadas existem para o controle do cancro cítrico nos cultivares mais susceptíveis. A aplicação de microrganismos como agentes para controlar a doença é um grande progresso ecológico para solucionar o problema. Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação e bactérias antagonistas (EC, FRC, LV e LN) e seus produtos (suspensões bacterianas, sobrenadantes livre-de-células e a fração acetato de etila obtida pelo tratamento do sobrenadante de LN com solventes orgânicos) foram testados para o controle da população de Xac, da incidência e severidade do cancro cítrico.em folhas de laranja(Citrus sinensis cv. Valencia). Os produtos bacterianos foram pulverizados nas folhas ou deixados em contato direto com as mesmas antes (pré) ou após (pós) a inoculação de Xac. Os resultados mostraram uma redução na população de Xac quando a suspensão bacteriana da cepa EC foi aplicada. Em outro experimento todas as cepas reduziram o número de lesões e a área de lesão quando as folhas foram tratadas com o sobrenadante livre-de-células, também foi observado o mesmo efeito quando as folhas foram tratadas com a fração de acetato de etila da cepa LN. Todos os efeitos inibitórios foram observados quando as folhas foram tratadas com os produtos bacterianos após a inoculação de Xac. Esses resultados mostram que bactérias antagonistas e seus produtos podem ser usados no controle do cancro cítrico.Item Cicatrização de feridas e biacúmulo de prata em ratos wistar tratados topicamente com o antimicrobiano nanopartícula de prata(2020-02-27) Camargo, Larissa Ciappina; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Kobayashi, Renata Katsuko TakayamaInfecções nas feridas dos pacientes com queimaduras, pós-operatório, entre outros, são umas das mais temidas complicações, pois o ferimento atua como um meio de cultura ideal para a colonização e proliferação de microrganismos. Nesses casos a pele que normalmente serve como uma barreira física contra micróbios encontra-se lesionada e precisa ser reparada de forma rápida e adequada. Devido a essa problemática o objetivo do presente trabalho foi formular géis contendo nanopartículas de prata (bio-AgNP) obtidas a partir da biomassa de Fusarium oxysporum, e avaliar a sua atividade antibacteriana, cicatrizante e verificar a ocorrência do bioacúmulo da prata no organismo. Para o teste de cicatrização, foram usados 60 ratos adultos, da raça Wistar, nos quais foi feita uma lesão na região dorsal. As feridas foram tratadas diariamente com as formulações (F250 e F500), a base do produto (componentes da formulação sem bio-AgNP), a sulfadiazina de prata (controle positivo) e com solução fisiológica (controle negativo) de acordo com o grupo experimental. Registros da avaliação macroscópica e coleta do tecido epitelial da lesão foram feitos nos dias: 1°, 5°, 9° e 17° dias após a cirurgia, para avaliação histológica. Os animais tratados tiveram coletados o cérebro, um dos rins, o fígado, testículo, baço e sangue para quantificação de prata por espectrofotometria de absorção atômica. Para a verificação da atividade antimicrobiana dos produtos desenvolvidos foi realizada a técnica de curva de sobrevivência e morte. Os microrganismos testados foram Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. O resultado do ensaio in vitro mostrou que as formulações com bio-AgNP tiveram ação antimicrobiana, assim como o controle positivo (sulfadiazina de prata - SD). Referente à cicatrização, não foram observadas variações significativas entre as médias das áreas das lesões tratadas com as diferentes formulações em relação à solução fisiológica (CTL) e a SD. Quanto ao acúmulo de prata nos diversos órgãos e no sangue, não houve diferença significativa entre o grupo CTL e os grupos experimentais após 17 dias de tratamento, o que indica que os tratamentos com os produtos formulados não ocasionam acúmulo de prata no organismo. O produto formulado contendo nanopartículas de prata biológicas apresentou potente proteção contra microrganismos, pois diminuiu a carga microbiana na lesão no decorrer dos dias de tratamento. Além disso, mostrou que não interferiu no proceso de cicatrização e não resulta em acúmulo de prata nos órgãos estudados, sendo uma alternativa para o tratamento de pacientes com feridas.Item Atividade antimicrobiana da fração F4A obtida de cultura de Pseudomonas aeruginosa LV em Staphylococcus aureus(2020-05-19) Gonçalves, Guilherme Bartolomeu; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Tavares, Eliandro Reis; Navarro, Miguel Octavio PérezStaphylococcus aureus é um patógeno relevante nos âmbitos comunitário e de assistência à saúde, conhecido pela dificuldade terapêutica associada à resistência antimicrobiana e à formação de biofilmes. A partir de 1940, S. aureus passou a ter notoriedade global, devido à resistência à penicilina e, em 1961, à meticilina. Como infecções causadas por essa bactéria dificultam a prática clínica, se faz notável a necessidade de pesquisas por novas substâncias antibióticas para tratar os pacientes acometidos. Ao longo da história, produtos naturais, especificamente metabólitos secundários de microrganismos, têm sido usados para combater patógenos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade inibitória da fração F4A, obtida da purificação do sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa cepa LV, sobre células planctônicas e sésseis de S. aureus, as alterações morfológicas causadas nessas células e sua toxicidade para células de mamíferos. Para isso, foram selecionados 26 isolados clínicos de S. aureus da coleção do Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos, da Universidade Estadual de Londrina (UEL). Os valores de CIM de F4A variaram de 1,56 a 6,25 µg/mL; 19 isolados apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) de 3,13 µg/mL (73,1%), 6 apresentaram CIM de 1,56 µg/mL (23,1%) e 1 isolado apresentou CIM de 6,25 µg/mL(3,8%). Concentração bactericida mínima (CBM) de 3,13 µg/mL foi detectada em 84,6% dos isolados (n=21) e 18 apresentaram valores idênticos de CIM e CBM, evidenciando o potencial efeito bactericida da fração. Pela cinética do tempo de morte, observou-se que S. aureus reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (UFCs) a partir de 4 h de tratamento com a CIM/CBM de F4A. A microscopia eletrônica de transmissão das cepas de referência tratadas com a CIM/CBM de F4A evidenciou alterações ultraestruturais como: diminuição na eletrodensidade citoplasmática, discreto espessamento e diminuição na compactação da parede celular, inibição da formação de septo e descolamento da membrana citoplasmática. O biofilme de todos os isolados apresentou redução significativa na atividade metabólica nas concentrações de 12,5 e 25 µg/mL. A maioria dos isolados apresentou concentração inibitória mínima para 50% das células sésseis (SCIM50) de 6,25 µg/mL (n=15), seguido de 12,5 µg/mL (n=8), 3,13 µg/mL (n=2) e 25,0 µg/mL (n=1). Para a maior concentração testada (50 µg/mL), a atividade hemolítica foi superior a 3%, enquanto as outras concentrações (25 a 0,1 µg/mL) não ultrapassaram 1% de hemólise; a concentração citotóxica para 50% das células (CC50) LLCMK2 de F4A após 24 h foi de 3,44 µg/mL. Como conclusão, a fração F4A apresentou atividade bactericida contra S. aureus, incluindo atividade antibiofilme. Embora mais estudos sejam necessários em relação à sua toxicidade para células de mamíferos e ensaios in vivo, a fração F4A pode ser promissora para o tratamento de infecções causadas por S. aureus.Item Avaliação de efeitos da intoxicação aguda pela ocratoxina A em frangos e análise de tratamento com L-triptofano(2021-02-22) Galdino Ricci, Fernando; Itano, Eiko Nakagawa; Hirooka, Elisa Yoko; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Venâncio, JoséA Ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina produzida por Penicillium spp. e Aspergillus spp. que são capazes de contaminar produtos de origem vegetal, muto utilizados na alimentação dos animais. Através da exposição oral, pelo consumo dos alimentos contaminados, a OTA pode afetar vários sistemas dos animais, tais como os sistemas imunológico e gastrointestinal. Os objetivos do presente estudo foram avaliar o impacto da intoxicação pela OTA em pintainhos, e verificar se o tratamento com Ltriptofano pode inibir seus efeitos tóxicos. Após a inoculação de uma dose única de OTA (1,4 mg/kg de peso vivo) em frangos de um dia de idade (Cobb 500), no primeiro dia do experimento, foram administradas quatro doses diárias de L-triptofano (100 mg/kg de peso vivo). No 14º dia foram avaliadas as respostas do sistema imunológico sistêmico e local através de quantificação dos níveis de imunoglobulinas A e Y (IgY/IgA) plasmáticas e presentes no conteúdo cecal, níveis de leucócitos totais circulantes, titulação dos anticorpos vacinais maternos contra o Vírus da Doença de Newcastle (NDV) e contagem do número de células IgA positivas (IgA+) na mucosa do duodeno, além do impacto na mucosa local com a avaliação da morfometria do duodeno. Adicionalmente, foram avaliados alguns parâmetros hematológicos e bioquímicos. Para quantificação de IgA/IgY foi realizado o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de imunocaptura, a revelação das células IgA+ por imunohistoquímica, a titulação de anticorpos vacinais por ELISA direto, os níveis de leucócitos totais circulantes por contagem (câmara de Neubauer) e a morfometria do duodeno pela mensuração dos tecidos corados com hematoxilina/eosina. Os níveis de IgA/IgY no conteúdo cecal, o número de células IgA+ e a altura das vilosidades e profundidade das criptas do duodeno dos animais contaminados apenas com OTA diminuíram significativamente, assim como os níveis de leucócitos totais circulantes e do hematócrito dos animais contaminados apenas por OTA (p<0,05), o que demonstrou seus efeitos tóxicos na mucosa local e na hematopoiese. O tratamento com L-triptofano foi benéfico para os animais em diversos parâmetros, os animais contaminados com OTA e tratados com L-triptofano tiveram níveis de IgA/IgY do conteúdo cecal, células IgA+ do duodeno e leucócitos totais circulantes similares aos animais do grupo controle, assim como o hematócrito e a altura das vilosidades do duodeno (p>0,05). Conclui-se que a exposição à uma dose alta de OTA no início da vida dos pintainhos induz a alterações na mucosa local e a utilização do tratamento com L-triptofano é válido para diminuir os efeitos prejudiciais da OTA, ao estimular a produção de imunoglobulinas locais e manter a integridade da mucosa.Item Atividade antimicrobiana de nanopartícuas de silênio sintetizadas a partir de extratos de Allium cepa, Malpighia emarginata e Vernonia condensata(2021-02-23) Souza, Lucas Marcelino dos Santos; Nakazato, Gerson; Kobayashi, Renata Katsuko Katayma; Medeiros, Leonardo PintoA resistência bacteriana aos antimicrobianos é um grande problema para a saúde pública e a nanotecnologia vem sendo empregada no controle do crescimento bacteriano, incluindo os multirresistentes. Nesse contexto estudos com nanopartículas de diferentes elementos, principalmente metais, como: prata, ouro e ferro, apresentam desejável atividade antimicrobiana. Outro elemento que vem se destacando é o selênio (Se), cuja nanopartículas possui alta bioatividade e ação antibacteriana. Portanto, o objetivo do trabalho foi realizar a biossíntese de nanopartículas de selênio (SeNps) a partir de extratos de três plantas: Allium cepa (cebola), Malpighia emarginata (Acerola), e Vernonia condensata (boldo-baiano). As nanopartículas sintetizadas foram caracterizadas por dynamic light scattering (DLS) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foram utilizadas. A atividade antibacteriana foi avaliada pelos métodos de microdiluição em caldo e curva de sobrevivência contra cepas padrão Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) BEC 9393, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Escherichia coli ATCC 25922. Os efeitos citotóxicos das SeNps sintetizadas foram avaliados através da capacidade hemolítica. As SeNps apresentaram tamanho entre 219 a 340 nm e morfologia majoritariamente esférica, também tiveram ação contra todas as bactérias Gram positivas com CIM variando de 6,125 a 98 μg/ml, porém sem ação nas Gram negativas testadas. E em relação à hemólise as CC50 variaram de 0,82 a 2,1 mg/ml. Esses resultados indicam que elas podem ser usadas contra bactérias Gram positivas por possuírem boa atividade antimicrobiana, além de possuírem baixa concentração hemolítica abrindo uma grande variedade de opções para suas aplicações.Item Caracterização fenotípica e genotípica de isolados de Escherichia coli de um caso clínico de colite histiocítica ulcerativa canina(2021-05-17) Dibo, Miriam; Nakazato, Gerson; Rocha, Sérgio Paulo Dejato; Sarmiento, Juan Josue PuñoA colite histiocítica ulcerativa (CHU) é uma doença inflamatória intestinal que pode acometer principalmente cães jovens das raças Boxer e buldogue francês, sendo associada à presença de Escherichia coli Aderente-Invasiva (AIEC). Deste modo, o presente estudo teve como objetivo realizar as caracterizações fenotípica e genotípica de isolados de E. coli e sua associação a um CHU em uma fêmea da raça buldogue francês. Neste estudo, foram obtidos 46 isolados de E. coli, sendo todos resistentes a ampicilina, ciprofloxacino, enrofloxacino e sulfametoxazol trimetoprima. Também foram encontradas resistências a amoxicilina-ácido clavulânico, azitromicina, cefazolina, cloranfenicol, gentamicina e tetraciclina. Todos os isolados obtidos foram classificados como multirresistentes e apenas um deles foi positivo no teste fenotípico de produção de beta-lactamases de espectro extendido, pertencendo ao grupo CTX-M-2. Com relação à classificação filogenética de Clermont, a maioria das cepas pertence aos grupos C e B1, enquanto os grupos B2 e F apresentaram apenas um representante cada. Os genes de virulência de E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC) encontrados foram ecpA, fimH, hlyF, iroN, iss, iutA, ompT, sitA e traT. Nenhuma das cepas apresentou capacidade de replicação no interior de macrófagos J774A.1 em 24 horas, no entanto, três cepas apresentaram capacidade de sobrevivência. A cepa 1.4 apresentou nove genes de virulência de ExPEC, ausência de fatores de virulência de E. coli diarreiogênica, e classificação no grupo filogenético B2. Essas características, juntamente com os sintomas apresentados pelo animal, indicam a possibilidade de que infecção por AIEC. No entanto, o teste de sobrevivência e replicação em macrófagos não apresentou resultados conclusivos, sendo necessário realizar os testes fenotípicos de adesão e invasão para confirmação da hipóteseItem Alterações celulares e moleculares de morfotipos de Candida tropicalis pré e pós exposição ao fluconazol(2022-01-28) Santos, Murilo Moreira dos; Furlaneto, Márcia Cristina; Ishida, Kelly; Panaggio, Luciano AparecidoCandida tropicalis é uma das 15 espécies do gênero Candida que são patogênicas ao ser humano. A espécie tem sua relevância epidemiológica traduzida como a segunda ou terceira espécie mais isolada do gênero, com prevalência registrada em regiões tropicais e subtropicais, como América Latina e Ásia, incluindo o Brasil. A levedura tem capacidade de promover infecções com taxa de mortalidade semelhante à de Candida albicans e superiores às de outras espécies não-Candida albicans. O switching fenotípico, considerado um fator de virulência descrito como capaz de promover variabilidade a partir de linhagens isogênicas, podendo acarretar em aumento na virulência. Neste sentido, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito do switching fenotípico em aspectos moleculares e celulares de morfotipos (linhagem parental, Variante Crepe e Revertente de Crepe – RC) de C. tropicalis expostos ao fluconazol. Para isso, as metodologias utilizadas visaram avaliar a influência do switching fenotípico pré e pós exposição ao fluconazol na concentração inibitória mínima (CIM) do fármaco, na expressão dos genes ERG11 (gene que codifica a enzima lanosterol 14-α-desmetilase da via de síntese do ergosterol) e CDR1 (gene que codifica uma bomba de efluxo para múltiplas drogas para o gênero Candida), na porosidade de parede celular, no tamanho e granulosidade celular, na quantidade de componentes de parede celular e na integridade de membrana plasmática. Os resultados demonstraram o morfotipo (RC) com o maior valor de CIM50, menor porosidade de parede celular e superexpressão do gene CDR1. Além disso, destaca-se a superexpressão do gene ERG11 para o morfotipo Crepe, sugerindo que há uma maquinaria molecular morfotipo dependente para morfotipos de C. tropicalis em resposta ao fluconazol. Para todas as análises foi possível evidenciar o efeito do switching fenotípico, mostrando que o fator de virulência tem a capacidade de modificar características moleculares e celulares em C. tropicalis.Item Efeito da aspirina sobre a resposta inflamatória e interação de células raw 264.7 com vesículas extracelulares secretadas por Trypanosoma Cruzi(2022-06-24) Santos, Lucas Felipe; Pinge Filho, Phileno; Kobayashi, Renata Katsuko Katayma; Toledo, Karina Alves deDurante a infecção por Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, a resposta imunológica é importante para o controle do parasitismo e sobrevida do hospedeiro. Macrófagos são células com reconhecida ação tripanocida e que produzem diversos mediadores inflamatórios, como o óxido nítrico (NO) e eicosanóides que atuam no controle da carga parasitária e no desenvolvimento da infecção. Contudo, o parasito apresenta mecanismos de evasão, como a liberação de vesículas extracelulares, que ao carrearem moléculas funcionais, sinalizam para células do hospedeiro, modulando a resposta inflamatória favorecendo o parasito. Os processos de invasão celular e controle da carga parasitária estão sob forte influência de mediadores lipídicos, especialmente aqueles derivados das vias das ciclooxigenases 1 e 2 (COX-1/COX2). A aspirina (ASA) é classificada como um antiinflamatório não esteroidal que atua no bloqueio de COX-1/COX2 responsáveis pela conversão do ácido araquidônico em eicosanóides. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da ASA sobre a ação exercida pelas vesículas extracelulares de T. cruzi cepa Y (EVs-Y). Foram realizados ensaios de viabilidade celular em macrófagos RAW 264.7 tratados com as concentrações de 0,625mM, 1,25mM e 2,5mM de ASA. Após a infecção dessas células foi determinado o índice de internalização do parasito e quantificado a produção de nitrito como estimativa da produção de NO. Análises estatísticas foram realizadas no programa “GraphPad Prism 8”, One-Way ANOVA seguida de teste de Turkey de comparações múltiplas. As concentrações de ASA utilizadas não apresentaram citotoxicidade. Macrófagos expostos à EVs-Y e posteriormente infectados com formas tripomastigotas de T. cruzi apresentaram menor produção de NO e aumento no número de formas amastigotas no citoplasma, demonstrando a modulação exercida pelas EVs-Y em favor do parasito. Surpreendentemente, quando os macrófagos foram tratados com ASA antes da exposição às EVs-Y e subsequente infecção com tripomastigotas, houve maior produção de NO, assim como menor internalização de parasitos e consequente menor presença de formas amastigotas no citoplasma das células, em comparação com os controles. Esses resultados sugerem que EVs-Y modula a resposta de macrófagos em favor do T. cruzi e indicam um papel para COX na modulação imune exercida por EVs-Y.Item Atividade de metabólitos secundários bacterianos no controle do cancro cítricoMurate, Letícia Sayuri; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Homechin, Martin; Mello, João Carlos Palazzo deResumo: O desafio é encontrar novos métodos para o controle da doença do cancro Atualmente, o controle é feito através de erradicação ou uso de metais pesados (cobre) como bactericidas A bactéria LN foi cultivada em meio liquido e o sobrenadante, centrifugado para retirada de células, foi tratado com metanol (AMF) e acetato de etila (AEF), e posteriormente o extrato foi concentrado, filtrado, liofilizado; e fracionado por cromatografia liquida a vácuo (CLV) Depois da CLV, oito frações foram obtidas: FAM, FAE, CLV1, CLV2, CLV3, CLV4, CLV5 e CLV6 Todas as frações foram testadas para atividade contra Xanthomonas axanopodis pv citri (Xac 36) para nesaios de atividade antimicrobiana, em placas de petri e placas de cultura com 24 poços, esse método demonstrou efeito inibitório mas em diferentes concentrações Efeito citotóxico em todas as frações em 5 µg/mL-1 Em plantas somente CLV3 mostrou resultados significantes (p<,5), reduzindo a incidência de lesões de cancroItem Modelos invertebrados no estudo de infecções fúngicas e na avaliação de antifúngicosSouza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Furlaneto, Márcia CristinaResumo: É crescente o número de infecções causadas por fungos, dentre eles, o gênero Candida é o mais frequente e Cryptococcus sp ocupa o segundo lugar Essas leveduras causam graves doenças em pacientes imunossuprimidos e são responsáveis por alta letalidade Diante desses fatos, a procura por novos fármacos é importante A sinvastatina é uma droga antes conhecida por reduzir os níveis de colesterol do sangue, porém muitos artigos relatam que ela possui ação antifúngica in vitro, contudo, não há trabalhos in vivo As larvas de Galleria mellonella, um modelo alternativo invertebrado já bem estabelecido, são uma opção relevante para esse estudo Outros modelos precisam ser padronizados para serem utilizados na elucidação das infecções fúngicas Os objetivos desse estudo foram testar a atividade de sinvastatina in vitro em interação com fluconazol contra espécies raras de Candida, testar a atividade de sinvastatina em G mellonella contra Candida albicans e padronizar autilização de Tenebrio molitor como hospedeiro em infecções fúngicas Foram feitos testes de antibiograma e microdiluição em caldo C guilliermondii apresentou a concentração inibitória mínima para sinvastatina de 312,5 µg/mL que foi dez vezes maior do que para C lusitaniae Entretanto, a interação das drogas para C guilliermondii foi sinérgica, enquanto que para C lusitaniae foi aditiva A taxa de mortalidade das larvas tratadas com sinvastatina e infectadas com C albicans foi alta, estatisticamente igual à taxa de mortalidade do grupo controle, que apenas recebeu o inóculo com a levedura Obtivemos resultados semelhantes na terapia conjunta das drogas Os testes com T molitor mostraram que com o aumento da concentração dos inóculos de ambos os fungos (C albicans e Cryptococcus neoformans) houve um aumento nas taxas de morte e foi possível observar a invasão nos tecidos Assim pudemos concluir que a sinvastatina possui atividade antifúngica in vitro, porém não há correspondência in vivo Além disso, T molitor foi apresentado aqui como um novo modelo invertebrado para o estudo de infecções fúngicasItem Comparação da qualidade bacteriológica de água mineral, água de poços artesianos e água de abastecimento municipal : potencial patogênico de pseudomonas aeruginosa isoladasSilva, Marie Eliza Zamberlan da; Dias Filho, Benedito Prado [Orientador]Item Atividade antiviral de polissacarídeo e frações de agaricus brasiliensis contra o Herpevírus bovino tipo 1Oliveira, Mariana Caldas Minari; Linhares, Rosa Elisa Carvalho [Orientador]; Castilho, Juliana Galera; Ogatta, Sueli Fumie YamadaResumo: Os produtos naturais constituem uma fonte inesgotável de substâncias com atividades farmacológicas promissoras, incluindo ação antiviral Neste trabalho, foi avaliado o potencial antiviral do polissacarídeo (PLS) e frações de Agaricus brasiliensis na replicação do herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) em células HEp-2 Foi demonstrado que o PLS e as frações (F1-F4) não possuem nenhum efeito citotóxico até a concentração de 2 µg/ml A atividade antiviral destes compostos foi analisada pelo tratamento das células antes, durante e depois da infecção viral através de ensaio de redução de plaque As frações tiveram pouco efeito na replicação de BHV-1, porém, PLS suprimiu significativamente a replicação em 67,9% com uma concentração inhibitória (IC5) de 16 µg/mL quando adicionado no tempo hora O PLS também inibiu o número de células fluorescentes em 61%, quando adicionado ao mesmo tempo em que o vírus e na concentração de 4 µg/ml Sugerimos então que PLS inibe a replicação viral interferindo nos estágios iniciais da penetração Estudos adicionais devem ser realizados a fim de se determinar os prováveis mecanismos de ação desta substânciaItem Prevalência e caracterização de Escherichia coli enteroagregativa típica e atípica em amostras de carne moída na cidade de Londrina, PRLima, Nicole Ribeiro de; Pelayo, Jacinta Sanchez [Orientador]; Vespero, Eliana Carolina; Rocha, Sérgio Paulo Dejato daResumo: Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente que pode causar diarreia aguda e persistente, em crianças e adultos Surtos de diarreia em vários países foram associados à EAEC pela ingestão de alimentos contaminados Nos últimos anos, diagnóstico molecular para caracterizar EAEC típica (EAECt) utilizando os genes aatA e aggR e para EAEC atípica (EAECa) os genes aaiC e aaiA, vem sendo utilizado como alternativa ao teste de adesão Assim, o presente estudo teve como objetivo pesquisar a prevalência de EAECt e EAECa em 1 amostras de carne moída bovina na cidade de Londrina, através do teste de adesão em células HEp-2 e da pesquisa dos genes aatA, aggR, aaiC e aaiA e comparar os resultados utilizando marcadores moleculares e o padrão de adesão Formação de biofilme, pesquisa de outros genes associado à virulência de EAEC, resistência a antimicrobianos, filogenia e sorotipagem, também foi realizada No teste de adesão, 89 (89%) amostras apresentaram o padrão agregativo (AA) característico de EAEC Utilizando somente os marcadores moleculares, 5% das amostras foram classificadas como EAECt (aggR) e 9% como EAECa (aaiC e/ou aaiA) Das 89 EAEC analisadas, 79 (86,7%) apresentaram formação de biofilme As 14 (15,7%) amostras que apresentaram um dos genes utilizados como marcador molecular foram testadas para resistência a antimicrobianos, outros genes de virulência associados à EAEC, filogenia e sorotipagem Foi verificada resistência a ampicilina em seis amostras (42,8%) e duas (14,2%) ao trimetoprim-sulfametoxazol O gene astA foi encontrado em nove amostras (64,3%), aggA em cinco (35,7%) e o gene shf em três amostras (21,4%) Na análise filogenética as amostras foram classificadas em três grupos: quatro (28,6%) no A, sete (5%) no B1 e três (21,4%) no E Foram identificados 1 sorotipos diferentes: O93:H9; O3:H2; O14:H2; O152:H8; O175:H7; O93:H19; O113:H21; O7:H8; ONT:H21 e ONT:H8 De acordo com nossos resultados o padrão de adesão continua sendo o melhor teste para detectar EAEC, uma vez que pelo diagnóstico molecular 84,3% das amostras deixaram de ser caracterizadas como EAEC Os resultados mostram que a carne moída bovina pode ser considerada um importante reservatório de EAEC, o que traz preocupação para a saúde pública pela possibilidade de transmissão deste patotipo ao homem através de alimentos contaminadosItem Enterococcus faecium dependente de vancomicina : caracterização fenotípica e genotípicaLopes, Gilselena Kerbauy; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Perugini, Marcia Regina EchesResumo: A vancomicina, um antimicrobiano de amplo espectro, é indicada para tratamento de infecções graves Enterococcus spp resistente a este glicopeptídeo, com predomínio de Enterococcus faecium estão entre os principais agentes etiológicos de infecções relacionadas aos serviços de saúde Além disso, enterococos dependente de vancomicina para o crescimento foram isolados de amostras clínicas Neste trabalho Enterococcus faecium vanA, que cresce apenas na presença de vancomicina (VDEfm-UEL), foi isolado de fezes de uma paciente em antibioticoterapia endovenosa com vancomicina para tratamento de sepse por Staphylococcus aureus resistente a oxacilina VDEfm-UEL também apresentou resistência a ampicilina, ciprofloxacina, cloranfenicol, eritromicina, levofloxacina, penicilina, rifampicina e teicoplanina Além disso os genes que codificaram fatores associados a virulência: efaA, gelE e esp, foram detectados no genoma da bactéria A dependência de vancomicina parece estar associada a mutações em D-Ala-D-Ala ligase (Ddl), importante enzima com função na síntese da parede celular A inserção de uma adenosina mono fosfatada na sequência genética de ddl, resultou na formação de um códon terminador da tradução prematuro Este é o primeiro relato de VDE E faecium isolado em um Hospital Universitário no BrasilItem Caracterização de determinantes de resistência adquirida aos antimicrobianos e de genes de virulência em isolados clínicos e ambientais de Pseudomonas spp. multirresistentesPalermo, Raquel Lima; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Tognim, Maria Cristina Bronharo; Paula, Suelen Balero de; Carrara-Marroni, Floristher Elaine [Coorientador]Resumo: O surgimento de isolados de Pseudomonas spp multirresistentes aos antimicrobianos (MR-PS) é um problema de saúde pública, uma vez que a maioria dos determinantes de resistência aos antimicrobianos são adquiridos e podem ser disseminados entre isolados, em diversos ambientes, por meio da transferência lateral de genes O objetivo desta pesquisa foi realizar a vigilância epidemiológica de MR-PS no ambiente hospitalar e comunitário contribuindo para o controle de infecções hospitalares no Hospital Universitário de Londrina (HU) Foram analisadas a presença de genes que codificam resistência adquirida aos antimicrobianos e virulência, e a relação clonal entre os isolados A identificação e o perfil de resistência foram, primeiramente, realizados pelo sistema automatizado Vitek-2 (BioMéuriex®) para os isolados clínicos e por testes bioquímicos convencionais para os isolados ambientais seguido por identificação molecular baseada em análises do gene 16S rRNA para espécies de Pseudomonas Os genes codificadores de resistência aos beta-lactâmicos e carbapenêmicos de classe A, B e D de Ambler, quinolonas (qnr), aminoglicosídeos (rmt) e colistina (mcr-1) foram pesquisados por PCR e a identidade confirmada por sequenciamento O contexto dos genes codificadores de carbapenemases foi investigado por PCR-mapping e a relação clonal entre os isolados foi analisada por ERIC-PCR Um total de 198 isolados clínicos recuperados entre os anos de 215 e 216 foram selecionados para o estudo com base nos seguintes critérios: isolados únicos, consecutivos e não sensíveis a ceftazidima e/ou imipenem e meropenem Além disso, foram incluídos no presente trabalho sete isolados ambientais de MR-PS produtores de carbapenemases, os quais foram recuperados de efluentes e faziam parte de uma coleção de isolados de Pseudomonas spp do Laboratório de estudos moleculares e resistência aos antimicrobianos (LEMRA) do Ambulatório de Especialidades do HU (AEHU) Com exceção das polimixinas (1,% sensíveis), altas taxas de resistência foram obtidas para todos os antimicrobianos testados Taxas preocupantes foram detectadas para os carbapenêmicos em isolados clínicos: 81,5% e 82,5% para imipenem e meropenem, respectivamente Dentre os 198 isolados clínicos MR-PS, 38 (19,2%) apresentaram genes codificadores de beta-lactamases, dos quais 32 (16,1%) apresentaram genes codificadores de carbapenemases Desta forma, a nova distribuição dos genes codificadores de beta-lactamases foi: em 14 isolados o gene blaSPM-1, seguido por 1 isolados carreando o gene blaKPC-2, 2 blaIMP-16, 6 blaCTX-M-2 e 6 blaGES-5, indicando um aumento da taxa de isolados portadores de blaKPC e uma redução de isolados portadores de blaSPM em comparação com as pesquisas anteriores Os genes investigados que codificam resistência às quinolonas, aminoglicosídeos e colistina não foram detectados neste estudo Os 32 isolados clínicos de MR-PS que apresentaram genes de carbapenemases foram agrupados em 12 clones (A-L) distribuídos ao longo do período analisado em diversas unidades hospitalares Os isolados que carreiam o gene blaSPM-1 foram agrupados em um único clone (A), sugerindo uma disseminação clonal e que este clone A é o responsável pela manutenção desse determinante de resistência no HU Os isolados codificadores de blaIMP-16 foram agrupados em 2 clones que diferiram fenotipicamente do clone que se manteve no hospital por 1 anos caracterizado pela sensibilidade ao meropenem Dentre os 1 isolados portadores do gene blaKPC-2, obtiveram-se 7 clones revelando a adaptação deste determinante de resistência em nosso hospital, provavelmente movido pela pressão seletiva do uso de carbapenêmicos A presença de uma nova carbapenemase do tipo GES-5 foi detectada em 6 isolados pertencentes a um mesmo clone (B) Todos os isolados exibiram um padrão de genes de virulência que condiz com sua a capacidade patogênica, porém não apresentaram correlação com a produção de carbapenemases, mas podem estar relacionados a clones epidêmicos mundiais Os isolados ambientais apresentaram-se clonalmente distintos dos isolados clínicos, representando 7 clones diferentes (A-G) condizendo com a diversidade esperada em isolados ambientais Além disso, a frequência de genes de virulência foi menor, revelando uma menor capacidade patogênica quando comparado aos isolados clínicos A presença de isolados produtores de carbapenemases recuperados de efluentes é alarmante uma vez que este ambiente é caracterizado pela notável capacidade de disseminação da resistência Além disso, esses resultados mostram que as taxas e a distribuição dos genes de resistência adquirida aos antimicrobianos podem flutuar em uma instituição e que a sua vigilância é essencial para estabelecer as medidas de controle de infecção para resguardar a eficácia dos antimicrobianos no tratamento de infecções por Pseudomonas sppItem Biossíntese de nanopartículas de prata de diferentes fontes e a influência do pH sobre sua atividade antibacterianaCorrêa, Alana Elke do Nascimento; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de [Orientador]; Lonni, Audrey Alesandra Stinghen Garcia; Faccin-Galhardi, Ligia CarlaResumo: As nanopartículas representam um grande mercado em expansão, suas propriedades físico químicas, ópticas, eletrônicas, térmicas e catalíticas permitem sua aplicação em diversas áreas Sua atividade antimicrobiana conhecida e amplo espectro de ação tornaram seu uso frequente na Microbiologia Por apresentarem uma alternativa promissora ao combate a bactérias multirresistentes seu uso é realizado em diversos estudos a fim de compreender melhor seu funcionamento Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi sintetizar e caracterizar nanopartículas de prata (AgNPs) de origem biogênica (fúngica e vegetal), e testar a atividade antibacteriana das mesmas em condições de pH ácido (6,), neutro (7,) e básico (9,) As nanopartículas sintetizadas foram caracterizadas por métodos de espalhamento dinâmico de luz (DLS), fluorescência de raios X por dispersão em energia (EDXRF) e potencial zeta A atividade antimicrobiana foi determinada pelos testes de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) Também foram realizados ensaios de curva de crescimento e morte, atividade antibiofilme e observação de alterações ultraestruturais superficiais por microscopia eletrônica de varredura (MEV) De acordo com os resultados de CIM, a AgNP fúngica foi a NP que mais apresentou influência do pH em sua atividade antibacteriana, especialmente em pH básico Nos ensaios de curva de crescimento e morte, amostras de S aureus e E coli obtiveram comportamentos semelhantes em todas as condições de pH com AgNP fúngica, e comportamentos distintos em todas as condições com a AgNP vegetal Uma cepa de E coli rugosa demonstrou comportamento semelhante em todas as condições testadas com ambas AgNPs Supostamente, o comportamento cinético pode ser influenciado predominantemente por fatores além do pH, como características do antimicrobiano e do microrganismo em questão Nos ensaios de atividade antibiofilme a condição de pH básico se destacou de forma negativa com a AgNP fúngica, principalmente em amostras de K pneumoniae Já para a AgNP vegetal, a condição de pH básico se destacou de forma positiva, apresentando maior atividade antibiofilme em relação as condições de pH ácido e neutro Em imagens de MEV, foram observadas alterações em forma de vesículas e protuberâncias, e também fragmentação e alongamento de células De acordo com os resultados obtidos, foi possível concluir que o pH do meio pode influenciar na atividade antibacteriana da nanopartícula, e que possivelmente esse acontecimento é definido por características oriundas da síntese da mesma No presente trabalho o pH exerceu maior influência sobre a atividade antibacteriana da AgNP de origem fúngicaItem Diferenciação entre Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans utilizando a região do espaço intergênico 1 (IGS1) do DNA ribossomal por PCR em tempo realTavares, Eliandro Reis; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Orientador]; Barros, Tânia Fraga de; Venâncio, Emerson JoséResumo: A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado principalmente entre pacientes portadores de HIV A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo C neoformans e C gattii as espécies clinicamente mais importantes Estas acometem principalmente pacientes imunossuprimidos, entretanto C gattii pode causar doença também em indivíduos imunocompetentes Neste trabalho foi padronizada uma reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para a identificação de C neoformans e C gattii tendo como alvo a região IGS1 (intergenic spacer 1) do rDNA Sequências correspondentes à região IGS1 de C gatti e C neoformans foram buscadas no GenBank e, após a análise, foi deduzida as sequências consensos, utilizadas para a síntese dos oligonucleotídeos iniciadores CnIGS1-F e CnIGS1-R, e CgIGS1-F e CgIGS1-R específicos para C neoformans e C gattii, respectivamente As cepas C neoformans ATCC 6631 e C gattii ATCC 5699 foram utilizadas como referência para os ensaios Inicialmente, o DNA genômico foi obtido de céluas em fase de crescimento exponencial, e quantificado por espectrometria a 26/28 nm A reação foi realizada usando 1 ng de DNA como molde, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, oligonucleotídeos iniciadores; as amostras foram corridas em um termociclador Rotor Gene 6 As curvas de dissociação (melting curve) foram geradas em ambas as corridas, entre 6° C e 95° C, com um aumento de ,5 °/segundo, para observação dos picos de dissociação Os resultados mostraram dois diferentes picos de dissociação: 82,8 °C e 84,2 °C para C gattii e C neoformans, respectivamente Não foi observada amplificação quando DNA total, de C albicans, C tropicalis, C dubliniensis, H capsulatum, T rubrum, S schenckii, P brasiliensis ou H sapiens foi utilizada na PCR Em conclusão, a amplificação por PCR em tempo real foi específica, permitindo a identificação de ambos os fungos, mostrando que a região IGS1 apresenta polimorfismo, podendo ser usada como um marcador molecular Assim, os oligonucleotídeos iniciadores desenhados podem ser utilizados na identificação de C neoformans e C gattiiItem Identificação e caracterização de Escherichia coli enteroagregativa em amostras de água destinadas ao consumo humano na região Norte do estado do ParanáSchüroff, Paulo Alfonso; Pelayo, Jacinta Sanchez [Orientador]; Vespero, Eliana Carolina; Kobayashi, Renata Katsuko TakayamaResumo: Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) têm sido um patógeno comumente associado a pacientes HIV positivos, viajantes e presente em surtos alimentares, contudo sua pesquisa em fontes de água ainda é bastante escassa Diante disso, o presente trabalho teve por objetivo investigar e caracterizar o patotipo EAEC em 75 isolados de E coli oriundos de 25 amostras de água destinadas ao consumo não tratadas e coletadas de 21 municípios na região Norte do estado do Paraná entre os meses de janeiro de 212 a dezembro de 214 No teste de adesão, 84% dos isolados foram classificados como EAEC por apresentarem o padrão de aderência agregativo (AA) nas células HEp-2 Dos quatro genes de diagnóstico pesquisados (aatA, aggR, aaiA and aaiC), apenas o aaiC foi encontrado em 7,2% dos isolados No teste deformação de biofilme, 72,4% dos isolados apresentaram formação de biofilme e destes 95,6% pertenciam ao patotipo EAEC Os 18 isolados positivos ao aaiC foram também testados para oito genes de virulência associados com EAEC, resistência a antimicrobianos e análise filogenética Apenas três genes de virulência astA (72,2%), shf (22,2%) e pic (5,6%) foram detectados Resistência foi verificada apenas para os antibióticos ampicilina (38,9%) e cefalotina (11,1%) Na análise filogenética, os filogrupos B1(61,1%) e A (22,2%) foram os mais prevalentes Os resultados encontrados mostras que a água para consumo é um importante reservatório para EAEC em nosso meio ambiente O teste de adesão em células epiteliais ainda é de grande importância na identificação deste patotipo e a pesquisa de novos marcadores para de detectar EAEC é necessária Além disso, a presença de diferentes perfis de virulência e características fenotípicas em cepas EAEC é de grande preocupação para a saúde pública, principalmente por estas cepas poderem ser transmitidas diretamente para humanos, animais e alimentosItem Trypanosoma Cruzi : estudos sobre o efeito do partenolídeoIzumi, Erika; Nakamura, Celso Vataru [Orientador]; Abreu Filho, Benício Alves de; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi; Nakamura, Celso Vaturu [Coorientador]Resumo: A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e é a doença endêmica de maior abrangência na América Latina, com aproximadamente 1 milhões de pessoas vivendo em áreas de risco Assim como outras doenças causadas por protozoários parasitas, a única droga disponível para o tratamento dos doentes apresenta muitos efeitos colaterais, e no caso da doença de Chagas, também baixa eficácia na fase crônica Uma alternativa visada atualmente é o estudo de substâncias extraídas de fontes naturais, como as plantas, para substituir drogas convencionais e conhecidamente tóxicas no tratamento de inúmeras doenças e disfunções Tanacetum parthenium é uma planta medicinal usada há anos no tratamento de enxaqueca, febre e inflamações Este trabalho teve por objetivo estudar o efeito dos extratos brutos, frações e substância purificada partenolídeo, sobre a forma epimastigota de T cruzi, bem como avaliar o efeito tóxico em hemáceas de mamíferos e células de linhagem O partenolídeo foi estudado quanto sua ação na viabilidade de formas tripomastigota e amastigota, alterações ultraestruturais e na interação parasita-hospedeiro Ao longo do processo de purificação, o efeito tripanocida foi aumentando, resultando em inibição de 5% após 96 h, na faixa de 3, – 28 µg/ml para os extratos brutos, 2,1 – 79, µg/ml para as frações e ,5 µg/ml para o partenolídeo, em formas epimastigotas As concentrações citotóxicas de 5% também foram determinadas entre 3,2 – 432,5 µg/ml em células de mamífero e 24 - 7 µg/ml em hemáceas A partir das concentrações obtidas foi determinado o índice de seletividade de 1,5 – 12,6, ,9 – 8,9 e 6,4, para extratos brutos, frações e partenolídeo, respectivamente A viabilidade das formas tripomastigotas, a temperatura de 4 ºC e 37 ºC após 24 h, e amastigotas a 4 ºC, foi de aproximadamente 6-65%, na concentração de 2 µg/ml A 37 ºC, as concentrações efetivas de 5% e 9% em amastigotas foram determinadas em 2,2 e 6,8 µg/ml, respectivamente Na interação parasita-hospedeiro, após 96 h de tratamento com partenolídeo, o índice de internalização foi reduzido em 51% na concentração de 2 µg/ml e 96,6% a 4 µg/ml Foram visualizadas alterações morfológicas e ultraestruturais por microscopia eletrônica de varredura e transmissão (MEV e MET) em epimastigotas e amastigotas tratadas com partenolídeo Na MET mostrou alterações em algumas organelas como núcleo, reservossomos, mitocôndria, também formação de vacúolos e estruturas concêntricas Alterações morfológicas foram visualizadas por MEV nas duas formas replicativas do parasita, principalmente distorções no corpo celularItem Staphylococcus aureus resistente à meticilina : determinação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, fatores de virulência e diversidade genéticaOliveira, Caio Ferreira de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Lopes, Gilselena Kerbauy; Pelayo, Jacinta Sanchez; Perugini, Marcia Regina Eches [Coorientadora]Resumo: Staphylococcus aureus é um patógeno oportunista que pode causar desde doenças de pele e tecidos moles a infecções disseminadas fatais No início da década de 194, as infecções causadas por esta bactéria foram tratadas com penicilina, logo após a sua introdução na terapia clínica No entanto, o surgimento de isolados resistentes a este antimicrobiano levou ao desenvolvimento de penicilinas semissintéticas (meticilina) Crucialmente, em 1961, o primeiro relato de S aureus resistente à meticilina (MRSA: methicillin-resistant S aureus) foi descrito no Reino Unido Atualmente, MRSA é uma das principais causas de infecções relacionadas à assistência à saúde (HA-MRSA: healthcare-associated MRSA) em todo o mundo, e em adição, isolados desta espécie bacteriana tem emergido como uma das principais causas de infecções em indivíduos saudáveis em ambientes comunitários (CA-MRSA: community-associated MRSA) Nos dias de hoje, as comunidades médica e científica são desafiadas com a emergência de S aureus resistentes aos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), uma das últimas escolhas para o tratamento intravenoso de infecções causadas por cepas de MRSA A partir deste novo cenário, observou-se o surgimento de VRSA (vancomycin-resistantS aureus), VISA (vancomycin-intermediate S aureus) e hVISA (hetero-VISA)MRSA constitui-se em um dos principais agentes de infecções em pacientes atendidos no Hospital Universitário de Londrina, PR Assim, o objetivo deste trabalho foi determinaro perfil de sensibilidade a antimicrobianos, fatores de virulência e diversidade genética de isolados clínicos de MRSA Foram utilizados 123 isolados clínicos de MRSA de pacientes assistidos no HU, entre janeiro de 21 e junho de 213 A maioria dos isolados foi obtida de amostras de sangue (43/123; 34,95%), seguido por fragmento de tecido (21/123; 17,7%) Todos os isolados foram sensíveis a linezolida e teicoplanina e resistentes à penicilina e cefoxitina A maioria dos isolados apresentou resistência a oxacilina (116/123; 94,31%), eritromicina (116/123; 94,31%), ciprofloxacina (114/123; 92,68%) e clindamicina (113/123; 91,87%)A maioria dos isolados (73; 59,35%) foi sensível à vancomicina e destes, 62 (5,41%) apresentou CIM (Concentração Inibitória Mínima) de 2,µg/mLTodos os isolados apresentaram o gene icaA, e 112 isolados (91,5%) apresentaram os genes hlb e hld Em relação à tipagem de SCCmec, o tipo II foi o mais freqüente entre os isolados (66; 53,66%), seguido pelo SCCmec tipo I (28; 22,76%) A partir da genotipagem por rep-PCR e análise do dendograma, os isolados foram reunidos em 17 grupos, denominados de A à Q, adotando-se 65% de similaridade O grupo E reuniu a maioria dos isolados (5), seguido pelo grupo F (16) e H (14) Assim, observa-se que não há disseminação clonal de MRSA no HU, e que os isolados apresentam resistência heterogênea aos antimicrobianos O trabalho contribuirá para adoção de medidas de controle da infecção hospitalar, assim como embasamento para o tratamento de infecções por S aureus