02 - Mestrado - Biotecnologia

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Determinação in vitro de possíveis efeitos genotóxicos e protetores de B- glucana botriosferana em células de mamíferos
Silva, Leandra Ernst Kerche; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Prado, Marialba Avezum Alves de Castro; Paiva, Wagner José Martins; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Coorientadora]
Resumo: Exopolissacarídeos (EPS) são biopolímeros produzidos por microrganismos como bactérias e fungos e que possuem atividade como modificadores de resposta biológica O fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina produz uma ß-(1?3; 1?6)-D-glucana conhecida como botriosferana quando cultivado em diversas fontes de carbono O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos mutagênicos, genotóxicos e protetores da botriosferana O fungo Botryosphaeria rhodina MAMB-5 foi cultivado em meio líquido em sacarose comercial como única fonte de carbono, e o EPS produzido foi dialisado e liofilizado, e então redissolvido em salina isotônica e reservado para os ensaios biológicos As atividades protetoras e genotóxicas da botriosferana foram testadas através do teste do micronúcleo, do ensaio do cometa e da avaliação do consumo de oxigênio usando células V79, HTC e eritrócitos humanos contra o quimoterápido doxorrubicina e os geradores de ROS peróxido de hidrogênio, benzo[a]pireno e tert-butil hidroperóxido Três concentrações deste EPS foram usadas nos testes, 7,5, 3 e 1µg/mL Os resultados mostraram que a botriosferana não apresentou atividade mutagênica em nenhum das três concentrações avaliadas e diminuiu os efeitos mutagênicos da doxorrubicina, do peróxido de hidrogênio e do benzo[a]pireno resultando em um diminuição da frequencia de micronúcleos de 9 a 95% O ensaio do cometa mostrou uma atividade genotóxica de classe 1 para a botriosferana, o que não foi significante já que o dano não foi permanente, comprovado pelo teste do micronúcleo A botriosferana também foi capaz de proteger a membrana celular de eritrócitos humanos da lipoperoxidação provocada pelo tert-butil hidroperóxido Vários mecanismos podem ser propostos para se explicar os efeitos protetores da botriosferana, entre eles a atividade antioxidante, a modulação de enzimas antioxidantes e os mecanismos de desmutagênese e bioantimutagênese Conclui-se, então, que a botriosferana é um quimopreventivo e antioxidante interessante; mais estudos devem ser realizados para se aprovar a utilização da botriosferana para consumo humano
Otimização da produção de botriosferana por Botryosphaeria rhodina na presença de óleo de soja e tween 80
Silva, Cassiano Correa da; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Silva, Maria de Lourdes Corradi Custódio da; Silva, Rui Sérgio dos Santos Ferreira da; Dekker, Robert F. H.; Dekker, Robert F. H. [Coorientador]
Resumo: Neste trabalho foram avaliados o efeito da adição de óleo de soja, óleo de babaçu, etanol e Tween 8 na produção de botriosferana, um exopolissacarídeo (EPS) do tipo ß-(1,3)(1,6)-D-glucana, secretado no meio de cultivo pelo fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina Também foi otimizada a produção desta ß-glucana utilizando a abordagem fatorial, após triagem prévia das variáveis que mais influenciaram na sua produção A adição de óleo vegetal aumentou a produção do EPS, enquanto que a de etanol não promoveu diferença significativa na produção O tempo e o pH inicial de cultivo, as concentrações de glucose, óleo de soja e de Tween 8 foram as variáveis que demonstraram efeito significativo na produção de botriosferana A condição otimizada para a produção do EPS foi glucose 4 g/L, óleo de soja 1 mL/L, Tween 8 4,5 g/L, durante 72 horas a 18 rpm, 28 °C, pH inicial 5,7 com 7 mL de inóculo para cada 1 mL de meio de cultivo, na condição estabelecida A produção de botriosferana prevista pelo modelo matemático foi 8,22 ± 1,36 g/L, enquanto que a produção obtida na validação experimental foi 7,74 ± ,13 g/L, confirmando o resultado previsto A caracterização parcial de botriosferana produzida na condição otimizada mostrou que o óleo de soja e Tween 8 não afetaram as características estruturais da molécula do EPS
Otimização da produção de lacase por Botryosphaeria rhodina MAMB-05 em óleo de soja como única fonte de carbono
Sacchetto, João Paulo; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Lima, Valéria Marta Gomes de; Scarminio, Ieda Spacino; Rezende, Maria Inês [Coorientadora]
Resumo: Lacases (EC 1132) são oxidases multicúpricas que catalizam reações de oxidação de compostos fenólicos e não-fenólicos com a concomitante redução do oxigênio à água Estas enzimas estão envolvidas na patogenicidade e morfogênese de diversos organismos incluindo-se fungos ligninolíticos As lacases fúngicas tem sido estudadas e aplicadas em vários processos biotecnológicos tais como no tratamento de efluentes industriais, no processamento de sucos, vinhos e cerveja, e também no branqueamento de polpa e papel O fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-5 foi isolado de cancro de eucalipto e selecionado previamente como ligninolítico e produtor constitutivo de lacases No presente trabalho foi avaliada a influência da adição de fontes de nitrogênio inorgânicas (NH4Cl, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3), orgânicas (extrato de levedura, uréia, peptona, milhocina), de fosfato inorgânico (KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, K2HPO4) e de diferentes concentrações de íons cobre , 12,5, 25, 5 e 1 µg mL-1, na produção de lacase pelo fungo, utilizando-se óleo de soja como única fonte de carbono O NaNO3 e KH2PO4 foram as fontes de nitrogênio e fosfato selecionadas, respectivamente Um planejamento fatorial composto central 23 foi desenvolvido para determinar as concentrações destas respectivas fontes de nitrogênio e fostato e de íons cobre para otimizar a produção da enzima A análise por metodologia de superfície de resposta demonstrou que a máxima produção de lacase (3,7 ± ,4 U mg-1) foi obtida na presença de NaNO3, (1 g L-1), KH2PO4 (125 g L-1) e 5 µg mL-1 de CuSO45H2 Nos experimentos de validação do método em laboratório a produção de lacase obtida por B rhodina MAMB-5 foi 2,95 ± ,1U mg-1 nas condições otimizadas acima descritas Cultivos nas condições otimizadas foram desenvolvidos em biorreatores de bancada, nos quais foram obtidos títulos mais elevados de lacase (19 ± 2,82 U mg-1) em 24 horas de cultivo, e de lipase (,56 ± ,7 U mg-1) em 72 horas
Produção de beta-(1-3)-glucanase e beta-glicosidase pelo isolado de levedura 1WA1 utilizando-se biomassa micelial de Botryosphaeria rhodina MAMB-05
Bauermeister, Anelize; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Oliveira, André Luiz Martinez de; Silva, Silvio Silvério da; Rezende, Maria Inês [Coorientadora]
Resumo: Enzimas microbianas têm sido aplicadas em várias indústrias para diferentes processos Beta-(1?3)-glucanases são hidrolases que degradam ligações glicosídicas beta-1,3 e têm sido descritas como sendo do tipo exo-(EC 32158) e endo-(EC 32139) As beta-glucosidases (EC 32121) também pertencem ao complexo enzimático glucanolítico e hidrolisam ligações glicosídicas de dissacarídeos, oligossacarídeos, e ligações entre glucose e grupos agliconas que ocorrem em muitos compostos fenólicos e aromáticos voláteis presentes em frutas Estas enzimas hidrolíticas são produzidas por fungos filamentosos e leveduras e podem ser úteis em vários processos biotecnológicos, incluindo-se a produção de bebidas como vinhos e sucos de frutas, para melhorar as suas características organolépticas Neste trabalho, 18 micro-organismos foram isolados da filosfera de uvas produzidas no norte do Estado do Paraná e do Rio Grande do Sul Os isolados foram selecionados quanto à produção de beta-(1?3)-glucanase e beta-glicosidase utilizando-se o exopolissacarídeo (EPS) botriosferana, uma beta-(1?3; 1?6)-D-glucana produzida pelo fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-5 O melhor micro-organismo produtor dos maiores títulos de enzima foi uma levedura, 1WA1, isolada de uva Moscato Bailey na região de Londrina Pó de Micélio (1g % m/v) de B rhodina MAMB-5 crescido nas condições ótimas para a produção de botriosferana, foi o melhor substrato para a produção de beta-(1?3)-glucanase pelo isolado 1WA1, em 96 h a 28 °C (18 rpm) A atividade da beta-(1?3)-glucanase foi otimizada e os ensaios foram desenvolvidos incubando-se a enzima em tampão citrato fosfato pH 4,5 com laminarina ,4 % (m/v) como substrato, por 2 minutos a 6°C A atividade foi determinada pela quantificação dos açúcares redutores liberados Para o ensaio da atividade da beta-glicosidase, a enzima foi incubada em tampão acetato de sódio (pH 4,) a 75°C por 2 min, utilizando-se p-NPG (p-nitrofenil beta-D-glicopiranosídeo) como substrato, e quantificando-se o p-nitrofenol liberado Os valores de KM aparente da beta-(1?3)-glucanase e da beta-glicosidase foram ,9 mg laminarina /mL e ,4 mg p-NPG /mL, respectivamente, e os respectivos Vmáx foram 1,7 e ,11 µmol/min A beta-(1?3)-glucanase da levedura foi inibida fortemente por Mn++ e parcialmente por Cu++ e Zn++, enquanto que a beta-glicosidase foi também inibida por Mn++ e Cu++ e parcialmente por Zn++ Um planejamento fatorial 32 completo e análise por metodologia de superfície de resposta foram desenvolvidos para otimizar a produção de beta-(1?3)-glucanase e beta-glicosidase, avaliando-se as variáveis: X1 (concentração de biomassa micelial de B rhodina) de ,5 a 1,5 (g % m/v), e X2 (pH inicial do meio de cultivo) de 2,5 a 7,5 As condições ótimas de cultivo foram: 1,5 g% de biomassa micelial, pH inicial 2,5 durante 96 h a 28 °C e 18 rpm A atividade específica preditiva da produção de beta-(1?3)-glucanase foi 5,92 U/mg, e o valor experimental obtido foi 5,96 U/mg Para a beta-glicosidase o valor preditivo foi 1,73 U/mg, enquanto que o experimental foi 1,77 U/mg, nas condições de cultivo descritas para a produção da beta-(1?3)-glucanase A microscopia eletrônica de varredura mostrou que o isolado de levedura (1WA1) apresentou evidências de degradação na parede celular do micélio do B rhodina MAMB-5, usado como substrato para produzir ambas as enzimas estudadas neste trabalho
Produção de botriosferana e avaliação de suas atividades mutagênica, antimutagênica, hipoglicemiante e hipocolesterolêmica
Miranda, Carolina Castello Branco Otoni de; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Zaia, Cássia Thaïs Bussamara Vieira; Silva, Maria de Lourdes Corradi Custódio da; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Coorientadora]
Resumo: Exopolissacarídeos são polímeros de carboidratos secretados por algumas espécies microbianas e conhecidos por apresentarem atividades biológicas como, modificadores da resposta biológica; entre elas, antimutagenicidade e imunomodulação e são utilizados em alguns países nas indústrias farmacêutica, cosmética e alimentícia O botriosferana é um EPS descrito recentemente como uma b-(1®3);(1®6)-D-glucana, produzido pelo ascomiceto Botryosphaeria rhodina O fungo foi cultivado em glucose com única fonte de carbono e o botriosferana foi utilizado neste trabalho para a avaliação de suas possíveis atividades mutagênica, antimutagênica, hipoglicemiante e hipocolesterolêmica Na avaliação das atividades mutagênicas e antimutagênicas, utilizando-se o sistema Teste do Micronúcleo, observou-se que o botriosferana não exerceu efeito mutagênico em camundongos Os resultados também mostraram, que o botriosferana apresentou atividade antimutagênica, chegando à uma redução de 45, 71 e 78% em eritrócitos policromáticos micronucleados na medula óssea; e 45, 78 e 82% de redução em reticulócitos micronucleados no sangue periférico de camundongos, nas doses de 7,5; 15 e 3 mg/kg pc/dia O botriosferana na concentração de 3, g/L, também apresentou 48% de redução da glicose plasmática nos ratos (P<,1), em diabetes melitus tipo I, induzida pela droga estreptozotocina (STZ) Na concentração de 1,5 g/L não exerceu atividade hipoglicemiante, bem como, não foi capaz de desenvolver atividade hipocolesterolêmica na concentração de 3, g/L em lipidemia induzia pela dieta com colesterol a 1%, gorduras saturadas 25% e ,1% de ácido cólico Entretanto, os resultados demonstraram que, mesmo o botriosferana, não tendo apresentado diferença estatística significativa (p>,5) em relação ao grupo controle positivo; na avaliação da atividade hipocolesterolêmica, apresentou uma tendência à diminuição do colesterol, reduzindo 18% do nível de colesterol total em ratos Portanto, novos bioensaios deverão ser desenvolvidos, buscando-se aumentar a concentração deste EPS Com isso, espera-se futuramente, que o botriosferana possa ter aplicações farmacêuticas, como medicamento coadjuvante no tratamento de certas doenças
Produção de lipases por Botryosphaeria ribis EC-01 em diferentes fontes de carbono
Messias, Josana Maria; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Scarminio, Ieda Spacino; Krieger, Nadia; Lima, Valéria Marta Gomes de [Coorientadora]
Resumo: Fungos do gênero Botryosphaeria são endofíticos e além de secretarem exopolissacarídeo e lacase, ainda não tinham sido descritos como produtores de lipase (EC3113) Esta última enzima possui amplas aplicações biotecnológicas, podendo ser utilizada na produção de biodiesel, detergentes, medicamentos, processamento de cosméticos e também na indústria alimentícia Neste trabalho foram avaliados nove isolados fúngicos do gênero Botryosphaeria, quanto à produção de lipases e lacases em diferentes óleos vegetais (soja, oliva, girassol, milho, canola, babaçu, gergelim e algodão) e também em glicerol, como fontes únicas de carbono O Botryosphaeria rhodina MAMB-5 foi o isolado que se destacou como produtor de lacase, enquanto que o B ribis EC-1 foi o melhor produtor de lipase, em todos os óleos vegetais e glicerol O pH ótimo de atividade da lipase deste isolado foi 8, e a temperatura ótima 55ºC (2 minutos de reação); parâmetros que proporcionaram um aumento de 8 vezes na atividade enzimática A solução de lipase do B ribis EC-1 foi estável por 24 horas até 55 ºC e também foi na faixa de pH de 1, a 1, (75 % de atividade residual) por uma hora à temperatura ambiente (3 ± 2 ºC) A atividade da lipase foi aumentada na presença de 1, mM de K+, Zn2+, Na+, Ba2+ e Co2+, destacando-se Mn2+, Mg2+ e Ca2+ e os íons Cu2+ (1, mM) e Hg2+ (1 mM) diminuíram a atividade enzimática Detergentes como Tween 8, SDS e Triton X-1 também aumentaram a atividade desta lipase A enzima permaneceu praticamente 1 % estável na presença de 5 % (v/v) de metanol, etanol e glicerol e apresentou 68 % de atividade residual quando incubada em isooctano (99,3 %, v/v) durante 1 hora à temperatura ambiente A lipase de B ribis EC-1 é uma enzima constitutiva, não é regulada por glucose e sua produção nos diferentes carboidratos testados foi maior em lactose Quando a fonte de carbono foi o óleo de soja (1, %, v/v), as fontes de nitrogênio e fosfato importantes para o aumento da atividade de lipase foram NH4NO3 e KH2PO4 A curva de crescimento revelou que a produção da enzima (U/mL) foi maior no 4º dia de cultivo, todavia, a melhor atividade específica foi registrada no 3º dia O pH inicial do meio de cultivo beneficiou a produção da enzima quando acertado para 8,5, cujas atividades enzimática e específica foram 145,5 U/mL e 632,2 U/mg (12 h de cultivo), respectivamente Dentre os detergentes avaliados como fonte de carbono, o Tween 8 (1, %, m/v) proporcionou maior produção de lipase pelo B ribis EC-1 e quando as fontes de carbono foram diferentes ácidos graxos, o ácido esteárico emulsificado com Triton X-1 (,1 %, m/v) foi a melhor fonte para a produção de lipase, seguido do ácido palmítico A trioleína promoveu boa produção da enzima por este ascomiceto, enquanto que os triacilgliceróis tributirina e tricaprilina inibiram o crescimento do fungo A lipase foi produzida em diferentes concentrações de glicerol, entretanto, a maior produção da enzima foi em 4, % (m/v) Através de planejamento estatístico de misturas e sendo estas representadas pelas fontes de carbono glicerol (futuro rejeito do biodiesel) e óleo de soja, foram realizados, para todas as Condições, delineamentos fatoriais fracionários (25-1) Os fatores selecionados foram: tempo de cultivo, pH inicial do meio, concentração de NH4NO3 (%, m/v), concentração de KH2PO4 (%, m/v) e velocidade de rotação (rpm) O tempo de cultivo e o pH inicial do meio foram as variáveis que mais influenciaram a produção de lipase pelo B ribis EC-1 e uma mistura de glicerol e óleo de soja adequada foi 3,6 % (m/v) e ,8 % (v/v), respectivamente Para esta última Condição, no planejamento fatorial completo (25), maior produção de lipase (413,6 U/mg) foi obtida em 72 horas de cultivo a 12 rpm, com ,4 % (m/v) de NH4NO3, 1, % (m/v) de KH2PO4 e pH inicial 4,5 Foi significante a interação entre todos os fatores, sendo o pH inicial do meio de cultivo a variável que mais influenciou a produção da lipase A lipase de B ribis EC-1 produzida em qualquer condição de cultivo hidrolisou ésteres de p-nitrofenila e triacilgliceróis de cadeia curta, média e longa Somente as lipases obtidas dos cultivos que continham óleo de soja como uma das fontes de carbono e o pH inicial do meio era 5,8-6, (pH do meio de Vogel) ou 8,5 hidrolisaram o MUF-butirato (zimograma) O óleo de soja é produzido em abundancia no Brasil sendo um substrato barato para a produção de lipases, assim como o glicerol, que é um subproduto da indústria produtora de biodiesel Portanto, o uso destas fontes de carbono pode ser uma estratégia biotecnológica viável para a obtenção de lipase por B ribis EC-1
Produção e caracterização estrutural do exopolissacarídeos secretado pelo ascomiceto Botryosphaeria SP
Steluti, Rosangela Maria; Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]; Silva, Maria de Lourdes Corradi Custódio da; Gorin, Philip Albert James; Hauly, Maria Célia de Oliveira; Silva, Maria de Lourdes Corradi Custódio da [Coorientadora]
Resumo: A influência da concentração de glucose e de outras fontes de carboidratos (monossacarídeos: frutose, galactose, manose; polióis: manitol e sorbitol; dissacarídeos: lactose, sacarose e sacarose comercial e melaço de indústria açucareira) foram comparados, separadamente, como únicas fontes de carbono para a produção de Botriosferana , um exopolissacarídeo (EPS) produzido pelo Botryosphaeria sp A concentração ótima de glucose para a produção do EPS foi 5g L-1 Com exceção do manitol, o fungo produziu EPS em todas as fontes de carbono estudadas e as maiores produções ocorreram em sacarose, seguida da glucose As análises por FTIR demonstraram que todos os EPS produzidos pelo Botryosphaeria sp, nas diferentes fontes de carbono são essencialmente glucanas do tipo ß O Botriosferana produzido em glucose como única fonte de carbono, foi isolado do fluido extracelular através de precipitação com etanol, purificado por cromatografia de filtração em gel, tendo produzido uma fração rica em carboidrato (96%) composta principalmente de glucose (98%) Os espectros de infravermelho e de ressonância magnética nuclear 13C mostraram que todas as ligações glicosídicas estavam na configuração b Os dados das análises de metilação e degradação de Smith indicaram que este polímero é uma glucana b-D-(1®3) com aproximadamente 22% de ramificações em C-6 Os produtos obtidos a partir da hidrólise ácida parcial demonstraram que as ramificações consistem de unidades glucopiranosídicas e gentiobiosídicas (1®6) ligadas

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Navegando 02 - Mestrado - Biotecnologia por Autor "Barbosa, Aneli de Melo [Orientador]"

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