02 - Mestrado - Biotecnologia
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Navegando 02 - Mestrado - Biotecnologia por Autor "Andrade, Diva de Souza"
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Item Análise filogenética, com base no gene ribossomal 16S, de 54 estirpes elite de rizóbios utilizadas em inoculantes comerciais brasileirosBinde, Daisy Rickli; Hungria, Mariangela [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Andrade, Diva de SouzaResumo: Entre as bactérias fixadoras de nitrogênio (N2), os rizóbios, em simbiose com leguminosas, estão entre as mais importantes para a agricultura, contudo, a seleção, identificação e manutenção de estirpes elite simbiontes de cada hospedeira em coleções de culturas são etapas críticas para a maximização do processo de fixação biológica do N2 Um problema atual nas coleções de culturas reside nas profundas alterações que ocorreram na taxonomia dos procariotos, incluindo as bactérias fixadoras de N2, como resultado do uso de métodos moleculares, com ênfase na análise dos genes ribossomais, no caso de bactérias, o 16S rRNA Neste estudo, foram determinadas as seqüências de nucleotídeos do gene 16S rRNA de 54 estirpes elite da “Coleção de Culturas de Rizóbios (SEMIA)” da FEPAGRO, que são recomendadas oficialmente, no Brasil, para a produção de inoculantes para 47 leguminosas O objetivo principal do trabalho foi o de obter uma melhor compreensão das relações filogenéticas entre essas 54 estirpes de rizóbios Seis principais grupos filogenéticos foram definidos entre as bactérias estudadas: Bradyrhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium (=Ensifer), Mesorhizobium, Methylobacterium e Burkholderia Das 54 estirpes, a análise do gene 16S rRNA resultou na reclassificação de 18 delas, em relação à classificação prévia, com base nas propriedades morfo-fisiológicas in vitro e de especificidade hospedeira Houve fortes indicações, ainda, de 12 novas espécies de rizóbios A grande diversidade observada neste estudo salienta que os solos localizados nos trópicos são um reservatório importante de genes de fixação de N2, que ainda precisa ser melhor estudado e exploradoItem Análise proteômica de Rhizobium tropici PRF 81Gomes, Douglas Fabiano; Hungria, Mariangela [Orientador]; Andrade, Diva de Souza; Batista, Jesiane Stefânia da SilvaResumo: A estirpe PRF 81 (= SEMIA 48) de Rhizobium tropici é utilizada no Brasil em inoculantes agrícolas para a cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L) desde 1998, devido à sua alta eficiência em fixar nitrogênio, elevada competitividade com estirpes nativas e capacidade de adaptar-se a diferentes condições de estresse Neste contexto, o objetivo deste estudo consistiu em obter uma visão geral das respostas adaptativas ao estresse térmico apresentadas pela estirpe PRF 81 A partir da separação por eletroforese bidimensional foram identificados, por espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF-TOF, 59 proteínas diferencialmente expressas na condição de estresse, representada pela expressão diferencial no crescimento in vitro a 35 oC em comparação com a temperatura de 28 oC As proteínas diferencialmente expressas, in vitro, a 35 oC pela PRF 81 foram associadas às classes funcionais do COG (Clusters of Orthologous Groups) de metabolismo, processos celulares e sinalização e processamento e armazenamento de informações Dentre as proteínas induzidas pela temperatura elevada, duas são, frequentemente, associadas ao estresse térmico, sendo elas as chaperonas DnaK e GroEL Diversas proteínas responsivas ao estresse oxidativo também tiveram expressão diferencial na temperatura de 35 oC, revelando assim a diversidade de adaptações a condições de estresse apresentados por esta estirpe, sugerindo ainda um -cross-talk” entre os estresses térmico e oxidativo Assim, através da análise proteômica diferencial, foi possível caracterizar as respostas ao calor apresentadas pela estirpe PRF 81Item Bioindicadores de qualidade do solo avaliados em diferentes profundidades sob plantio direto e convencionalBabujia, Letícia Carlos; Hungria, Mariangela [Orientador]; Andrade, Diva de Souza; Grange, LucianaResumo: Estudos quantitativos e qualitativos da microbiota evidenciam as alterações ocorridas em um agroecossistema em virtude do sistema de manejo adotado Diversos estudos têm concluído que o sistema de manejo do solo, conhecido como plantio direto (PD) é superior ao sistema de plantio convencional (PC) para preservar a qualidade do solo Somente pela comparação dos dois sistemas com as profundidades seria possível verificar o impacto real causado ao solo pelos sistemas de PD e PC As análises deste estudo foram realizadas em ensaio conduzido na Embrapa Soja, em Londrina (PR), em Latossolo Vermelho Eutroférrico estabelecido no verão de 1988/89 Em janeiro de 29 as amostras foram coletadas nas entrelinhas, em sete profundidades, de -5, 5-1, 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 e 5-6 cm, sob PC e PD nas parcelas de sucessão intercalando-se soja (verão) e trigo (inverno) O delineamento experimental do ensaio foi em blocos ao acaso, em esquema fatorial com quatro repetições Foram estudadas as seguintes variáveis: densidade aparente do solo, análises químicas (pH, estoques de carbono total (CT) e nitrogênio total (NT) e macronutrientes), carbono (CBM) e nitrogênio (NBM) da biomassa microbiana, quociente metabólico (qCO2), quociente microbiano (qMic), respiração basal (RB), respiração induzida por substrato (RBI), análise enzimática da ß-Glicosidase e gel de eletroforese com gradiente desnaturante (DGGE) para análise das comunidades bacteriana e fúngica Este estudo confirmou que o sistema de PD favoreceu a CBM em relação ao PC, mesmo que as diferenças da densidade de solo sejam consideradas na sua determinação O CBM, NBM e atividade metabólica dos microrganismos acompanham a distribuição da MOS no perfil e decrescem com a profundidade do solo Os aspectos qualitativos devem ser melhor estudados, pois têm significado inerente na explicação de muitos processos, sendo a principal lacuna do presente trabalhoItem Caracterização bioquímica e molecular de bactérias diazotróficas isoladas de tomate (Solanum lycopersicum) e lulo (Solanum quitoense) : influência do efeito rizosferaAlzate Zuluaga, Mónica Yorlady; Oliveira, André Luiz Martinez de [Orientador]; Andrade, Diva de Souza; Oliveira, Suzana Mali deResumo: O solo é um dos maiores reservatórios de biodiversidade microbiana, constituindo um importante recurso para a exploração biotecnológica Esta biodiversidade não se distribui uniformemente neste ambiente, e a cobertura vegetal exerce grande influência sobre a diversidade microbiana do solo Este fenômeno é conhecido como efeito rizosfera, onde algumas espécies têm suas populações aumentadas conforme a qualidade e quantidade de material exsudado pelas raízes Nesse sentido, torna-se interessante o estudo da interação de algumas culturas de importância econômica com bactérias do solo que possam promover seu crescimento Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito rizosfera promovido por duas espécies de Solanum, S lycopersicum (tomate) e S quitoense (lulo) sobre a comunidade de bactérias diazotróficas em solos sob diferentes tipos de manejo: mata secundária (MS), hortícola convencional (HC) e orgânico (ORG) As bactérias diazotróficas foram isoladas usando meios semi-sólidos livres de nitrogênio (JMV, NFb, JNFb, LGI e LGI-P) e sua população foi quantificada pela técnica do número mais provável (NMP) O posicionamento taxonômico dos isolados foi realizado pelo sequenciamento parcial do gene 16S RNAr, aplicando o índice de Shanon-Wiener para determinar variações na biodiversidade entre os tratamentos Os isolados foram avaliados para características de promoção do crescimento vegetal, como a capacidade de produção de compostos indólicos, produção de sideróforos e solubilização de fosfatos inorgânicos Foram obtidos 117 isolados bacterianos em populações acima de 1x14 células g-1 rizosfera ou solo, dos quais 114 foram posicionados taxonomicamente dentro dos seguintes gêneros: Rhizobium (6 isolados); Pseudomonas (15 isolados); Burkholderia (12 isolados); Enterobacter e Variovorax (6 isolados cada); Cupriavidus e Massilia (3 isolados cada); Stenotrophomonas e Roseateles (2 isolados cada); Bacillus, Herbaspirillum, Xanthomonas, Novosphingobium e Caulobacter (um isolado cada) Houve diferença tanto na composição qualitativa como quantitativa da comunidade diazotrófica associada às diferentes espécies de Solanum, com diminuição da diversidade de diazotrofos na rizosfera de S lycopersicum e S quitoense em comparação ao solo, e incremento na população de diazotrofos na rizosfera – principalmente de Rhizobium na rizosfera de S lycopersicum, independentemente do manejo de solo estudado A caracterização bioquímica identificou a capacidade de produção de compostos indólicos em 54 isolados, a produção de siderofóros em 49 isolados, a capacidade para solubilizar FePO4 foi detectada em 84 isolados e a solubilização de AlPO4 em 49 isolados Dentre a coleção de isolados obtida, 49% apresentaram potencial aplicação na promoção do crescimento de tomate, onde 32% correspondem a isolados provenientes do solo, 4% da rizosfera de tomate e 28% da rizosfera de luloItem Caracterização bioquímica e molecular de isolados de bactérias promotoras do crescimento vegetal associadas ao girasso (Helianthus annuus)Goes, Kelly Campos Guerra Pinheiro de; Oliveira, André Luiz Martinez de [Orientador]; Carvalho, Claudio Guilherme Portela de; Andrade, Diva de SouzaResumo: Estudos de associações entre microrganismos promotores do crescimento em plantas apresentam um enorme potencial devido aos benefícios dados sobre a produtividade A cultura do girassol possui aspectos interessantes para o agronegócio, com a crescente demanda por óleos vegetais para a indústria alimentícia e como matéria-prima na produção de combustíveis renováveis A importância econômica do girassol, bem como a necessidade de cultivá-lo em diversos ambientes, torna interessante o estudo da sua interação com Bactérias Promotoras do Crescimento Vegetal (BPCV) que auxiliam sua sobrevivência em diferentes condições de solo O objetivo desse trabalho foi identificar e avaliar a diversidade genética de parte da comunidade bacteriana associada à cultura do girassol, buscando identificar isolados capazes de atuar na promoção de crescimento vegetal Os 57 isolados foram obtidos de amostras da rizosfera, raiz, capítulo e colmo das plantas de girassol das cultivares Helio 251 e Aguará 3, avaliados quanto à capacidade de produção de auxina, produção de proteínas, atividade antagonista, solubilização de fosfato, produção de sideróforos e quitinase Foi utilizada a técnica de seqüenciamento para identificação taxonômica e a diversidade intragênica observada com base em marcadores RAPD das espécies de bactérias associadas às plantas de girassol Através das técnicas utilizadas foi possível identificar que todos os isolados de bactérias apresentaram características de microrganismos promotores do crescimento vegetal Três isolados do colmo, capítulo e rizosfera do girassol apresentaram habilidade de FBN em meio de cultura sem nitrogênio, e sete isolados do colmo, capítulo e raiz apresentaram atividade antagonista contra o fitopatógeno Sclerotina sclerotiorum Todos os isolados apresentaram habilidade de produzir auxinas “in vitro” e nenhum dos isolados apresentou produção da enzima quitinase Do total de 57 isolados, 32 apresentaram produção de sideróforos Foi possível observar através dos marcadores de RAPD o agrupamento dos isolados obtidos das mesmas partes das plantas com alta similaridade O seqüenciamento do gene 16S RNAr de 45 isolados permitiu classificar 42 como pertencente ao gênero Bacillus, compreendendo as espécies B subtilis, B cereus, B thuringiensis, B pumilus, B megaterium e Bacillus sp Somente 3 isolados obtidos foram classificados fora do gênero Bacillus, sendo identificadas como Methylobacterium spItem Caracterização inter e intra-específica de 45 estirpes elite de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro baseada em análise polifásicaCardoso, Juscélio Donizete; Hungria, Mariangela [Orientador]; Andrade, Diva de Souza; Oliveira, André Luiz Martinez deResumo: Diversas espécies de bactérias do solo do gênero Rhizobium em simbiose com o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L), apresentam a capacidade de formar nódulos efetivos e com isso fixar biologicamente o nitrogênio atmosférico (FBN) contribuindo para a redução no uso de fertilizantes nitrogenados nessa cultura No Brasil, programas de pesquisa para seleção de estirpes de rizóbios têm buscado a eficácia e estabilidade das características da FBN Porém, antes de uma avaliação da eficácia dessas bactérias em experimentos de campo, uma caracterização inter e intra específica é quase um exigência Neste sentido, o estudo foi conduzido com o objetivo de realizar a caracterização de estirpes elite utilizando uma abordagem polifásica com base nas análises morfo-fisiológicas e genéticas Nesse estudo, foram utilizadas, 45 estirpes elite de rizóbios microssimbiontes de feijoeiro, provenientes da Coleção de Microrganismos de Interesse do Agronegócio do Laboratório de Microbiologia do Solo do Instituto Agronômico do Paraná e três estirpes de Rhizobium tropici tipo B SEMIAs 477, 48 e 488 (CIAT 899, PRF 81, H 12) autorizadas pelo MAPA para a produção de inoculantes para a cultura do feijoeiro, no Brasil Os dados de morfologia de colônia, produção de ácido e melanina em meios de culturas específicos foram transformados em matriz binária e o agrupamento da dissimilaridade apresentado com base nas diferenças estimadas pela distância euclidiana Através desse agrupamento, as estirpes foram distribuídas em dois grandes grupos, sendo que, o grupo I foi formado por 73% das quais três estirpes IPR-Pv tiveram 1% de similaridade com as estirpes de Rhizobium tropici (CIAT 899, PRF 81 e H 12) Na análise molecular, também, foram utilizadas as estirpes de R tropici tipo A (CFN 299); R leguminosarium bv phaseoli (ATCC14); R etli (CFN 42); R giardini (H 152); R galicum (R62sp) As análises de agrupamento dos produtos da amplificação com primers do RFLP-PCR-16S para análise inter especifica e do REP, BOX A1R-PCR para uma caracterização intra específica das estirpes foram realizadas usando o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard Pela técnica do PCR-RFLP do 16S rDNA foi observado um grupo contendo 34 estirpes IPR-Pv juntamente com as oito do genêro Rhizobium, enquanto a IPR-Pv 89 ficou isolada com baixa similaridade (3%) Através da análise do dendrograma com perfis de DNA obtidos por PCR-BOX, todas as estirpes analisadas apresentaram perfil distinto, com exceção de cinco pares de IPR-Pv que apresentaram 1% de similaridade O agrupamento do PCR-REP com 7% de similaridade foi observado à formação de 2 perfis distintos e dentro desses ocorreram cinco subgrupos com 1% de similaridade Através da análise polifásica verifica se que essas 45 IPR-Pv, embora pré selecionadas para eficácia simbiótica, apresentam alta diversidade feno-genotipica Pelas análises moleculares verifica-se que o BOX-PCR é discriminatório de estirpe caracterizando cada uma, enquanto a do RFLP-PCR 16S RNAr dentro do gênero agrupa espéciesItem Desenvolvimento de formulação para produção de biomassa de Azospirillum brasilense com alta qualidade fisiológicaMilani, Karina Maria Lima; Oliveira, André Luiz Martinez de [Orientador]; Nogueira, Marco Antonio; Andrade, Diva de SouzaResumo: O objetivo deste trabalho foi desenvolver um meio de cultura para a produção de biomassa celular de Azospirillum brasilense que proporcione uma elevada densidade de células e alta concentração de biopolímeros (exopolissacarídeo e polihidroxibutirato), buscando favorecer a sobrevivência do microrganismo no produto e após sua utilização como inoculante O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo que inicialmente foram desenvolvidas quatro formulações de meios de cultura líquidos (MCA1; MCA2; MCA3; MCA4) buscando identificar aqueles com maior potencial para produção de biomassa celular de A brasilense Ab-V5 e exopolissacarídeos (EPS) Em adição aos novos meios desenvolvidos, o meio de cultura FORM15 foi utilizado como referência em todos os ensaios realizados A etapa seguinte teve como objetivo avaliar a qualidade fisiológica das células durante o cultivo nas formulações pré-selecionadas anteriormente (MCA2 e MCA4), através da cinética de crescimento, agregação celular, produção de polihidroxibutirato (PHB), e formação dos grânulos de PHB Também foi avaliada a sobrevivência da bactéria ao armazenamento das formulações MCA2 e MCA4 durante 2 dias, e o escalonamento da produção de inoculante em escala semi-piloto utilizando apenas a formulação controle (FORM15) O meio de cultura MCA4 foi o que apresentou maior potencial de utilização para o desenvolvimento de uma formulação inoculante, pois obteve a maior contagem de Azospirillum (1,7 x 19 UFCmL-1), quando comparado com as demais formulações Em adição, o cultivo da bactéria nesta formulação (MCA4) propiciou a manutenção de células viáveis até 24 h de cultivo, retardando a fase de declínio das bactérias, o que possibilitou uma alta produção de PHB (1,73 gL-1) Com relação ao armazenamento das formulações (MCA2 e MCA4), após 2 dias não foi detectada a contagem de células viáveis em nenhuma delas No entanto, foram realizadas avaliações de microscopia no qual revelaram que as formulações armazenadas tardiamente (72 e 144 h de cultivo) apresentaram um maior número de células vivas Sabendo que a maior produção de EPS e PHB foi encontrada nas células cultivadas por mais tempo, foi possível observar que a presença desses biopolímeros influenciou positivamente na sobrevivência da bactéria durante o armazenamento das formulações O experimento realizado em escala semi-piloto demonstrou maior sobrevivência de A brasilense Ab-V5 na FORM15, apresentando uma fase estacionária de maior duração comparada com o cultivo em agitador