01 - Doutorado - Microbiologia

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Abordagem polifásica na taxonomia, filogenia e eficiência da fixação biológica do nitrogênio de rizóbios simbiontes de feijoeiro
Cardoso, Juscélio Donizete; Hungria, Mariangela [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Silva, Krisle da; Nogueira, Marco Antonio; Andrade, Diva Souza [Coorientadora]
Resumo: O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L) é uma leguminosa com baixa especificidade em nodular com uma variedade de estirpes de rizóbios, os quais muitas vezes têm baixa efetividade na fixação de nitrogênio O objetivo geral desta tese foi o de estudar a eficiência simbiótica e a filogenia de um grupo elite de estirpes de rizóbios, microssimbiontes do feijoeiro, utilizando uma abordagem polifásica Avaliaram-se a eficiência simbiótica, características fenotípicas e genotípicas de estirpes de rizóbios isoladas de sementes, nódulos de feijoeiro, nódulos de amendoinzeiro (Arachis hypogaea L) e mucuna anã (Mucuna pruriens) cultivadas em solos de diversos agroecossistemas Quarenta e cinco estirpes elite foram analisadas quanto às propriedades simbióticas (nodulação, massa da parte aérea seca, N- total na parte aérea, porcentagem de N-ureído da seiva do xilema) em casa de vegetação, em vasos contendo solo arenoso não estéril cultivado com feijoeiro As estirpes elite também foram caracterizadas em relação às propriedades morfo-fisiológicas, perfis genéticos de rep-PCR (BOX) e polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP – Restriction Fragment of Length Polymorphism) do gene 16S rRNA, utilizando-se quatro enzimas de restrição Na análise parcial das sequências do 16S rRNA, foram utilizadas 17 estirpes representantes obtidas dos principais grupos resultantes das análises anteriores A estirpe mais eficiente foi a IPR-Pv268, que agrupou com Rhizobium sp, enquanto a IPR-Pv583, mostrando menor eficácia na fixação do N2 foi agrupada com Herbaspirillum lusitanum Estirpes 2 eficientes foram agrupadas com espécies simbióticas e gêneros pouco comuns entre simbióticos, incluindo Leifsonia xyli, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia e Enterobacter As seis estirpes que apresentaram dissimilaridade do gene 16S RNA do gênero Rhizobium foram submetidas às análises do MLSA (Multilocus Sequence Analyses) e do gene nifH Os índices de diversidade (Shannon), com base nas características fenótipicas (eficiência simbiótica, morfo-fisiológicas) e genéticas (BOX-PCR, RFLP do 16S rRNA e sequências do gene 16S rRNAs), calculados em função do número de grupos e de estirpes em cada grupo, apresentaram valores de 1,5 e 1,47, respectivamente Algumas estirpes utilizadas neste estudo se destacaram quanto à sua capacidade de fixação de nitrogênio e, portanto, mostraram alto potencial biotecnológico para a utilização em inoculantes comerciais
Análise polifásica de estirpes de Bradyrhizobium e descrição de novas espécies
Delamuta, Jakeline Renata Marçon; Hungria, Mariangela [Orientador]; Zilli, Jerri Édson; Gomes, Douglas Fabiano; Ribeiro, Renan Augusto; Barcellos, Fernando Gomes
Resumo: O Brasil sobressai no cenário agrícola por ser um grande produtor de diversas culturas de importância econômica, como por exemplo, a soja (Glycine max) Atualmente, tem-se buscado incrementar a produtividade das culturas, mas o manejo inadequado dos solos e das culturas pode limitar a qualidade dos solos e a sustentabilidade agropecuária A fixação biológica de nitrogênio, realizada por bactérias diazotróficas conhecidas de modo geral como rizóbios, em simbiose com plantas leguminosas, destaca-se como uma importante prática na sustentabilidade agrícola, mas estima-se que a diversidade dessas bactérias ainda é pouco conhecida A técnica polifásica, utilizada hoje na taxonomia e sistemática dos procariotos, engloba informações genotípicas, fenotípicas e filogenéticas para garantir uma classificação apropriada dos microrganismos A essas informações deve-se destacar o incremento, na última década, na incorporação de dados de sequências genômicas e os avanços computacionais para analisar tais sequências, proporcionando uma verdadeira revolução nos estudos taxonômicos e filogenéticos de procariotos Neste trabalho, foram conduzidos estudos polifásicos, incluindo a análise genômica, em grupos de estirpes de Bradyrhizobium com forte indicativo de representarem novas espécies O primeiro estudo englobou duas estirpes, CNPSo 1112 e CNPSo 2833, microssimbiontes de soja perene (Neonotonia wightii) e desmodium (Desmodium heterocarpon), inicialmente relacionadas às espécies Bradyrhizobium elkanii e Bradyrhizobium pachyrhizi, respectivamente A análise polifásica dos dados morfofisiológicos, genotípicos e genômicos suportam a proposta de duas novas espécies, para as quais estão sendo propostos os nomes Bradyrhizobium tropiciagri sp nov (CNPSo 1112) e Bradyrhizobium embrapense sp nov (CNPSo 2833) No segundo estudo, diferenças genéticas (rep-PCR, hibridação DNADNA), genômicas (identidade média de nucleotídeos, conteúdo C+G), fenotípicas (testes morfofisiológicos e perfil de ácidos graxos) e filogenéticas (análise do gene 16S RNAr e multilocus sequence analysis - MLSA) revelaram que um grupo representado por quatro estirpes relevantes para a agricultura e simbiontes de soja, classificadas como Bradyrhizobium japonicum grupo Ia deveriam ser reclassificadas na nova espécie Bradyrhizobium diazoefficiens, sendo a estirpe USDA 11 eleita como estirpe tipo Os resultados obtidos contribuem para o maior conhecimento da diversidade de rizóbios, com ênfase no gênero Bradyrhizobium, que aparentemente representa a maior porcentagem de rizóbios nos trópicos Também houve grande aporte de conhecimento sobre a aplicação da genômica em estudos de sistemática procariótica
Genômica e diversidade de Rhizobium Tropici, uma espécie tropical microssimbionte do feijoeiro Phaseolus Vulgaris L
Pinto, Fabiana Gisele da Silva; Hungria, Mariangela [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Furlaneto, Márcia Cristina; Andrade, Diva de Souza; Nicolás, Marisa Fabiana
Resumo: O Brasil é o maior produtor e consumidor mundial de feijão (Phaseolus vulgaris L) O rendimento médio nacional é bastante baixo, devido, principalmente, ao baixo nível de tecnologia empregado na cultura, ao cultivo em solos de baixa fertilidade, especialmente pobres em N Conseqüentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose com bactérias diazotróficas, representa uma alternativa para aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, contudo, problemas relacionados à nodulação e fixação do N2 com as estirpes nativas dos solos são relatados com freqüência Neste trabalho foram conduzidos dois estudos, sendo que no primeiro foi realizada à caracterização de diversidade genética, pela avaliação de genes simbióticos e não simbióticos, de estirpes de Rhizobium tropici, com alta capacidade de fixação do N2 em condições tropicais e isoladas de quatro regiões brasileiras A técnica de PCR-RFLP dos genes ribossomais 16S e 23S e a análise do seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiram a identificação de dois grupos, um relacionado às estirpes de R tropici tipo A e outro às de R tropici tipo B A diversidade dos genes ribossomais foi elevada, indicando que as estirpes do tipo A podem representar uma nova espécie Além disso, foi constatada diversidade genética intraespecífica elevada, pela análise por rep-PCR com os -primers" BOX, ERIC e REP Contudo, na análise de PCR-RFLP dos genes simbióticos, nifH e nodC, todas as estirpes de R tropici apresentaram uma única combinação de perfis, o que pode refletir uma estratégia evolucionária dessas estirpes para a maximização da fixação de N2 No segundo estudo foi realizado o seqüenciamento e a bioprospecção parcial de genes da estirpe PRF 81 (=SEMIA 48) de R tropici, altamente eficiente no processo de fixação do N2 e recomendada para o uso de inoculantes comerciais no Brasil O genoma dessa estirpe foi estimado em 7,85 Mb, pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) Foram obtidas 2192 CDSs, sendo classificadas como válidas (1255), hipotéticas conservadas (668) ou hipotéticas (269) A estratégia de panorama genômico, para a obtenção de genoma parcial, mostrou-se viável e eficiente, uma vez que foram identificados genes putativos na maioria das classes funcionais dos bancos de dados KEGG e COG Foram identificados genes do metabolismo de aminoácidos, carboidratos e lipídeos, bem como relacionados à biodegradação, quimiotaxia e, provavelmente, a mecanismos de infecção, com ênfase em genes relacionados aos sistemas de secreção dos tipos II e III Além disso, foram identificados genes relacionados à capacidade competitiva, saprofítica e ao processo de fixação biológica do N2 A estratégia de panorama genômico utilizada na estirpe PRF 81 indicou um mosaico de similaridade com diversos outros rizóbios Além disso, foram identificados alguns genes promissores para manipulações futuras visando obter incrementos no processo de fixação biológica do N2, não só com o feijoeiro, como em outras leguminosas
Pseudomonas aeruginosa cepa LV produtora de um antibiótico organometálico : análise do transcriptoma na presença de cobre e atividade antibacteriana em isolados de Acinetobacter baumannii multirresistentes
Gionco, Bárbara; Andrade Filho, Galdino [Orientador]; Barcellos, Fernando Gomes; Marroni, Floristher Elaine Carra; Pereira, Ulisses de Pádua; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Oliveira Júnior, Admilton Gonçalves de [Coorientador]
Resumo: As infecções causadas por microrganismos multirresistentes constituem um problema de saúde pública e apresentam altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos multiresistentes relacionados às infecções hospitalares, com altas taxas de resistência aos carbapenêmicos relatadas em importantes centros de saúde Atualmente a terapia antimicrobiana para o tratamento das infecções multirresistentes por A baumannii baseia-se no uso de polimixinas, e tigeciclina, além da combinação de fármacos Entretanto, isolados resistentes a essas drogas já foram detectados Frente a este problema crescente há uma incerteza na perspectiva do uso de antimicrobianos, levando à necessidade de descoberta de novos compostos O solo é um ecossistema promissor na busca de novos antimicrobianos e bactérias do gênero Pseudomonas isoladas desse hábitat se destacam como um dos microrganismos mais estudados na produção de compostos bioativos Estratégias de biologia molecular, como o sequenciamento de RNA, são fundamentais na elucidação das vias metabólicas de novos compostos, visando à melhoria e otimização de sua produção Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de analisar a expressão gênica diferencial de uma cepa ambiental de P aeruginosa, isolada do solo, produtora de um composto organometálico com atividade antimicrobiana, pela metodologia do RNA-seq, para a compreensão da via de síntese do agente bioativo Além disso, objetivamos testar o composto produzido pela cepa, isoladamente ou em combinação com os fármacos comerciais imipenem e polimixina B, em isolados multirresistentes de A baumannii, a fim de detectar sua possível ação sinérgica Pela análise dos transcritos foram anotados nove genes diferencialmente expressos com relevância estatística nas condições ausência/presença do composto: três deles relacionados ao transporte de íons metálicos (PA3521, PA3523 e PA392), três (PA2691, PA4141 e PA4782) não caracterizados em nenhum dos bancos utilizados, um gene (PA3574a) associado ao grupo de chaperonas ligadas ao cobre, um (PA4872) classificado como um regulador de transcrição e um dos genes (phzA2) relacionado à via biosintética das fenazínas Esses resultados nos permitiram associar a produção do composto com a via metabólica das fenazinas, entretanto mais estudos precisam ser realizados para a confirmação e elucidação da hipótese Para os cinco isolados multirresistentes de A baumannii testados dois apresentaram resistência a polimixina B e todos foram resistentes ao imipenem com concentração inibitória mínima para o composto organometálico foi de 7,8µg/ml A combinação do imipenem com o composto apresentou efeito antagônico para dois isolados e ação indiferente para os demais A combinação com a polimixina B foi mais eficiente, apresentando ação sinérgica para todas as amostras de A baumannii Portanto, essa combinação fornece uma perspectiva futura para uma nova forma de utilização da polimixina B no tratamento das infecções multirresistentes causadas por A baumannii
Taxonomia e filogenia molecular de rizóbios microssimbiontes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)
Ribeiro, Renan Augusto; Cunha, Mariangela Hungria da [Orientador]; Pavanelli, Pâmela Menna Pereira; Nogueira, Marco Antônio; Andrade, Diva de Souza; Barcellos, Fernando Gomes
Resumo: O feijão comum (Phaseolus vulgaris L) é uma leguminosa que foi originalmente domesticada nas Américas Central e do Sul Os rizóbios são bactérias que vivem em simbiose com algumas leguminosas, resultando em um complexo processo denominado fixação biológica de nitrogênio Apesar da alta diversidade procariótica presente no solo, o grande desafio consiste em identificar e classificar um número cada vez maior de microrganismos, de modo que se consiga extrair ao máximo o potencial tecnológico dessas bactérias em favor de um incremento no rendimento das culturas e na sustentabilidade da agricultura Os estudos taxonômicos possuem um papel fundamental para a classificação dessa biodiversidade Atualmente, a filogenia dos procariotos é baseada principalmente no gene 16S RNAr, embora alguns estudos tenham demonstrado que os genes ribossomais podem, ocasionalmente, sofrer transferência horizontal e recombinação genética, fazendo com que os resultados nem sempre possam refletir a verdadeira filogenia procariótica Além disso, o gene 16S RNAr apresenta um nível elevado de conservação, dificultando a identificação e classificação taxonômica para grupos de microrganismos intimamente relacionados Com isso, a técnica de MLSA (Multilocus Sequencing Analysis), que consiste na análise concatenada de pelo menos cinco genes conservados e que estejam presentes em todos os organismos em análise, vem sendo empregada para conferir maior confiabilidade a estudos taxonômicos e de filogenia No primeiro trabalho desta tese foi realizado um estudo polifásico, incluindo caracterização morfo-fisiológica, genética por rep-PCR e MLSA e hibridização DNA-DNA, com o objetivo de reclassificar as estirpes hoje denominadas como R tropici tipo A, em um nova espécie, R leucaenae, sendo a estirpe CFN 299T proposta como estirpe tipo da nova espécie No segundo trabalho, foram utilizadas quinze estirpes de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro provenientes do México, Equador e Brasil, com o objetivo de correlacioná-las taxonomicamente e filogeneticamente, através da técnica de MLSA As análises dos cinco genes (recA, rpoA, gltA, glnII, gyrB), além do 16S RNAr indicaram a formação de três grupos principais envolvendo essas estirpes Oito estirpes ficaram agrupadas com R etli e R leguminosarum, que por serem duas espécies intimamente relacionadas evolutivamente, só foram claramente separadas e identificadas na árvore concatenada com os cinco genes Três estirpes agruparam com R tropici, com nítida separação entre os tipos A (agora proposto como R leucaenae) e B, principalmente na árvore concatenada Outras quatro estirpes foram posicionadas no grupo de R radiobacter, mas pela grande distância evolutiva apresentada, podem ser representantes de uma nova espécie Em ambos os trabalhos a técnica de MLSA demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação precisa e consistente quando comparada à utilização de apenas um gene, principalmente dentro do grupo dos rizóbios

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