01 - Doutorado - Ciência Animal

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Identificação filogenética e caracterização tecnológica da microbiota ácido lática autóctone do queijo artesanal serrano catarinense e seu potencial antagonista a patógenos
Seixas, Felipe Nael; Beloti, Vanerli [Orientador]; Oliveira, André Luíz Martinez de; Alfieri, Alice Fernandes; Oliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de; Nero, Luís Augusto
Resumo: Os queijos artesanais vêm sendo produzidos há séculos no Brasil Cada região do país produz queijos com características sensoriais próprias e distintas entre si A fabricação informal do queijo artesanal no município de Lages, no estado de Santa Catarina, é uma prática muito antiga e de grande aceitação em diferentes camadas da sociedade O queijo artesanal serrano, assim como outros queijos artesanais, utiliza leite cru integral como matéria prima O objetivo deste trabalho foi identificar no queijo artesanal serrano a microbiota patogênica e lática, caracterizar a diversidade genetica dessa microbiota lática, avaliar o seu potencial antagonista frente a patógenos, assim como suas características tecnológicas para integrar um fermento lático Foram estudadas 2 amostras de queijos adquiridas em diferentes pontos comerciais da cidade de Lages/SC Em relação à ocorrência de bactérias patogênicas nas amostras de queijo Serrano, Listeria monocytogenes foi identificada em três amostras de queijo, Staphylococcus coagulase positivos em sete amostras e 11 amostras apresentaram-se contagens acima do estabelecido pela legislação para Escherichia coli Salmonella spp não foi isolada em nenhuma das amostras analisadas Foram obtidos 543 cepas de bactérias ácido láticas (BAL) a partir das 2 amostras de queijos artesanais Serrano As cepas foram agrupadas de acordo com os perfis de polimorfismo de restrição do espaço intergênico 16S-23S (RFLP PCR-ITS) Exemplares destes grupos foram selecionadas para o sequenciamento do gene 16S RNAr, que identificou 268 (49,3%) cepas de Lactobacillus spp, 28 (38,3%) de Lactococcus spp, 34 (6,3%) de Leuconostoc spp e 33 (6,1%) de Enterococcus spp Das 543 cepas de BAL analisadas, Lactobacillus spp mostrou o maior potencial antagonista a Listeria monocytogenes O Enterococcus spp apresentou antagonismo principalmente contra Escherichia coli e Salmonella Thyphimurium O gênero Leuconostoc spp mostrou maior antagonismo para Staphylococcus aureus Em relação às características tecnológicas, 74 cepas de BAL foram selecionadas aleatoriamente, mas contemplando os três gêneros com potencial tecnológico, um total de 12 isolados Leuconostoc, 19 Lactococcus e 43 Lactobacillus As cepas de Lactococcus foram avaliadas para atividade acidificante, proteolítica, autolítica, aminopeptidásica, produção de aminas biogênicas, resistência ao NaCl e a temperatura As cepas de Leuconostoc foram avaliadas para atividade acidificante, proteolítica, autolítica, aminopeptidásica, lipolítica, produção de aminas biogênicas, produção de dextrano, resistência ao NaCl e acidez As cepas de Lactobacillus foram avaliadas para atividade acidificante, proteolítica, autolítica, lipolítica, aminopeptidásica, produção de aminas biogênicas Das 19 cepas de Lactococcus, 4 Lactococcus se destacaram nas atividades acidificante (?pH 2,31 a 2,41U), proteolítica (,6 a ,79 mmol Gly), autolítica (11,69 a 16,64%) e aminopeptidásica Cinco isolados de Lactococcus, no entanto, produziram aminas biogênicas (histamina) não sendo indicadas para integrarem um fermento lático Das 12 cepas de Leuconostoc selecionados da coleção de BAL, seis apresentaram resultados importantes para as atividades acidificante (?pH ,73 a 1,12 U), proteolítica (,28 a ,32 mmol Gly), autolítica (8,95 a 11,81%), aminopeptidásica (Leu ,2 a ,12 U), produção de dextrano e nenhuma cepa produziu aminas biogênicas Das 43 cepas de Lactobacillus avaliadas, duas apresentaram melhores resultados para as atividades acidificante (?pH 1,53 e 1,68 U) e aminopeptidásica (Leu ,45 e ,47 U) Seis amostras produziram aminas biogênicas e não poderiam ser empregadas na formulação de fermentos Os resultados obtidos permitiram conhecer os principais representantes da microbiota ácido lática associada ao queijo artesanal serrano, composta principalmente pelos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Enterococcus Dentre as cepas de BAL obtidas, as cepas Lactobacillus, Enterococcus e Leuconostoc apresentaram maior potencial antagônico contra bactérias patogênicas Doze cepas (quatro Lactococcus, seis Leuconostoc e dois Lactobacillus) apresentaram potencial para o desenvolvimento de um fermento lático para a utilização na produção controlada de queijo Serrano, como inóculos puros ou mistos Além disso, as amostras de queijo analisadas não atenderam as determinações sanitárias da legislação brasileira, indicando risco potencial de agravo à saúde pelo consumo deste produto pela população
Prevalência e fatores de risco associados ao herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) em rebanhos bovinos do estado do Paraná
Dias, Juliana Alves; Müller, Ernst Eckehardt [Orientador]; Ferreira Neto, José Soares; Gonçalves, Vitor Salvador Picão; Alfieri, Alice Fernandes; Freitas, Julio Cesar de; Alfieri, Amauri Alcindo [Coorientador]
Resumo: O herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1), agente etiológico da Rinotraqueite Infecciosa Bovina (IBR), e considerado um dos principais patogenos de bovinos sendo responsável por grandes prejuizos econômicos a exploração pecuária Estudos sorológicos e etiológicos revelaram a presença e alta frequencia da enfermidade em rebanhos de grande parte do país, entretanto a situação epidemiológica da doença no Estado do Paraná não esta totalmente elucidada O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência e os fatores de risco associados ao BoHV-1 no estado do Paraná, destacando a região oeste (NR Cascavel e Toledo), que envolve o circuito produtor em maior desenvolvimento do estado O delineamento estatístico, amostras de soro e informações referentes as propriedades foram as empregadas para o estudo da brucelose bovina no Estado do Paraná dentro do contexto do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Para o estado, foram avaliadas 1483 fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses provenientes de 218 rebanhos não vacinados contra o BoHV-1 Na região oeste, foram avaliadas 193 fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses provenientes de 295 rebanhos não vacinados Para o diagnostico sorológico da infecção pelo BoHV-1 foi utilizado um ensaio imunoenzimatico (ELISA) indireto Em cada propriedade foi aplicado um questionário epidemiológico, a fim de obter informações sobre tipologia e praticas de manejo empregadas A prevalência de propriedades e animais do estado foi de 71,3% [69,29-73,32%] e 59,2% [56,19-61,85%], respectivamente e as variáveis associadas à infecção pelo BoHV-1 na analise de regressão logística multivariada foram: I) exploração de corte (OR=1,58; IC: 1,12-2,23); II) compra de reprodutores (OR=1,9; IC: 1,52-2,37); III) monta natural (OR=1,48; IC: 1,2-2,14); IV) aluguel de pasto (OR=2,24; IC: 1,51-3,33); V) presenca de piquete de parição (OR=1,56; IC: 1,2-2,3); VI) histórico de aborto nos ultimos 12 meses (OR=1,45; IC: 1,8-1,95) Na região oeste, a prevalência de rebanhos foi de 64,41% (IC95% = 58,65-69,87%) e as variáveis consideradas fatores de risco para a infecção pelo BoHV-1 na analise de regressão logística multivariada foram: I) numero (= 23) fêmeas com idade = 24 meses (OR=2,22; IC: 1,9-4,51); II) compra de reprodutores (OR=2,68; IC: 1,48-4,82); III) uso de pastagens comuns (OR=5,93; IC: 1,31-26,82); IV) histórico de abortamento nos ultimos 12 meses (OR=2,37; IC:1,9-5,16); V) presença de animais silvestres (OR=8,86; IC: 1,11-7,73) Estes resultados indicam que a infecção pelo BoHV-1 esta amplamente distribuída no estado do Paraná e que fatores relacionados as características das propriedades e ao manejo estão associados a infecção
Transplante de microbiota fecal no tratamento de cães com diarreia
(2023-02-24) Pereira, Giorgio Queiroz; Gomes, Lucas Alécio; Pereira, Patrícia Mendes; Alfieri, Alice Fernandes; Souza, Mirian Siliane Batista de; Basso, Karina Maria
A diarreia é uma manifestação clínica comum em cães, sendo a gastrenterite hemorrágica causada por parvovirose mais prevalente em jovens. Estabelecer o diagnóstico pode ser um desafio, porém, o tratamento é igual ou semelhante na maioria dos casos. Assim sendo, o objetivo geral desse trabalho foi investigar o efeito do transplante de microbiota fecal (TMF) na recuperação clínica de cães filhotes com gastrenterite hemorrágica comparando o uso de diferentes alíquotas de fezes. Foram avaliados 18 cães com gastrenterite hemorrágica por parvovirose, sem restrição de raça, sexo e com idade entre 2 e 12 meses. Os animais foram distribuídos em três grupos com seis indivíduos cada. O grupo controle (CON) recebeu apenas terapia convencional/padrão (fluidoterapia, antibiótico, protetores de mucosa, antieméticos e antiácidos), o grupo TMF10 recebeu terapia convencional mais o TMF com 10 gramas de fezes, e o grupo TMF20 tratamento convencional mais TMF com 20 gramas de fezes. Os cães foram avaliados diariamente por meio de exame clínico e registrou-se as características das fezes quanto a consistência, ou seja, se líquida, pastosa ou normal. Considerou-se como recuperação clínica o exame físico normal, a evolução de diarreia para fezes pastosas e a presença de apetite sem vômitos. Os resultados em relação a consistência das fezes demostrando o período de recuperação clínica dos animais e alta, foram analisados utilizando ANOVA seguida de teste de Tukey para fins de comparação. Nos grupos TMF o tempo de recuperação clínica foi mais rápido quando comparados ao grupo controle. Quando comparados entre si, não houve diferença estatística entre os grupos que receberam o transplante, porém, observou-se que a recuperação clínica no grupo TMF20 foi discretamente melhor que no grupo TMF10. Conclui-se que o TMF proporciona melhora clínica mais rápida e menor tempo de hospitalização dos cães e que um maior volume fecal no TMF poderá proporcionar melhores resultados
Vigilância epidemiológica dos genotipos G (VP7) e P (VP4) de rotavírus A em rebanhos bovinos leiteiros vacinados contra rotavirose
Fritzen, Juliana Torres Tomazi; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Alfieri, Alice Fernandes; Claus, Marlise Pompeo; Lorenzetti, Elis; Otonel, Rodrigo Alejandro Arellano
Resumo: A diarreia neonatal bovina (DNB) é uma enfermidade multifatorial que, com maior frequência, acomete bezerros com até 3 dias de idade A DNB é o principal evento sanitário em bezerras leiteiras lactentes e devido às taxas de morbidade e mortalidade a infecção ocasiona perdas econômicas consideráveis à cadeia produtiva do leite O principal agente infeccioso viral envolvido na etiologia dessa enfermidade é o rotavírus A (RVA) Entre as várias medidas de controle e profilaxia a serem adotadas para a redução da frequência de DNB em rebanhos bovinos leiteiros destaca-se a vacinação das vacas no período pré-parto O objetivo desse estudo foi monitorar os genotipos G (VP7) e P (VP4) de cepas de RVA identificadas em bezerras leiteiras em rebanhos regularmente vacinados com vacina comercial contendo RVA genotipo G6P[5] Para isso, foram conduzidos dois experimentos sendo o primeiro de caráter longitudinal e o segundo transversal No primeiro experimento, 122 bezerras provenientes de um rebanho da raça Holandesa foram avaliadas até os 3 dias de idade Em todas as bezerras, independentemente da presença ou ausência de DNB, nos dias 1, 4, 7, 1, 14, 17, 21, 24, 28 e 3 de idade foram realizadas colheitas de amostras fecais totalizando 122 amostras O segundo experimento foi realizado em 14 rebanhos bovinos leiteiros regularmente vacinados contra a rotavirose, e em cada rebanho foi realizada apenas uma colheita de amostras fecais diarreicas (n=87) em bezerras de até 3 dias de idade Como técnica de triagem, a presença de RVA nas amostras fecais foi avaliada pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) Todas as amostras positivas para RVA por EGPA foram submetidas à amplificação dos genes VP7 e VP4 por RT-PCR e os genotipos G e P, respectivamente foram determinados por sequenciamento dos produtos amplificados e análise das sequencias obtidas No experimento longitudinal foram identificados 76 (62,3%) e 99 (8,1%) animais e amostras fecais positivas para RVA, respectivamente Todas as amostras RVA-positivas (n=1) selecionadas para o sequenciamento foram caracterizadas como genotipo G1P[11] No experimento transversal somente 42,86% (6/14) das propriedades foram analisadas Oito rebanhos foram excluídos do estudo, por não apresentarem bezerras com diarreia (n=2) ou por não apresentarem amostras fecais positivas para RVA (n=6) Nos seis rebanhos restantes, 17 (25,4%) amostras de fezes foram positivas para RVA O sequenciamento e análise filogenética dos produtos amplificados dos genes VP7 e VP4 possibilitaram identificar os genotipos G6P[11] em cinco rebanhos e G1P[11] em um As cepas G6 pertencem a linhagem III enquanto a cepa G6 vacinal pertence a linhagem IV, caracterizando a ocorrência nos rebanhos vacinados de RVA genotipo G6 distinto daquele presente na cepa vacinal Adicionalmente, nestes rebanhos vacinados com RVA genotipo G6P[5] foi observada a emergência dos genotipos G1 e P[11] caracterizando possível falha na proteção heteróloga Os resultados, tanto do experimento longitudinal quanto do transversal, demonstraram que nos rebanhos bovinos regularmente vacinados com a cepa G6P[5] de RVA houve redução na frequência de diarreia em bezerros com idade inferior a 3 dias Contudo, houve circulação de RVA com genotipos G e P distintos daqueles presentes na cepa vacinal Com isso, evidencia-se a importância do constante monitoramento das cepas de RVA circulantes em rebanhos bovinos regularmente vacinados e também da realização de estudos de vigilância epidemiológica para a identificação de genotipos emergentes e para a caracterização molecular de cepas de RVA com maior virulência e/ou com potencial zoonótico
Vírus da diarreia viral bovina e herpesvírus linfotrópico suíno em javalis de vida livre (Sus scrofa Linnaeus, 1758) provenientes de fragmentos de Mata Atlântica
(2021-10-01) Porto, Gisele da Silva; Alfieri, Alice Fernandes; Silva, Virgínia Santiago; Lorenzetti, Elis; Orsi, Mário Luís; Zotti, Éverson; Alfieri, Amauri Alcindo
Espécies não nativas invasoras têm se tornado um problema ambiental de interesse público. Quando somadas as suas distribuições exóticas e nativas o javali (Sus scrofa) é o suídeo com a maior distribuição geográfica do mundo. Os suínos asselvajados têm motivado estudos ambientais, sociais e sanitários, inclusive no Brasil, envolvendo principalmente o potencial de atuação desses animais como reservatório de doenças passíveis de serem transmitidas a animais silvestres, domésticos e humanos. A preocupação com o status sanitário das populações brasileiras de javalis de vida livre tem origem na característica continental e ambiental do país, que tem proporcionado a rápida dispersão desse invasor e, principalmente, pelo fato de javalis serem hospedeiros de doenças com alto impacto na saúde humana e animal. Considerando a capacidade de dispersão de javalis no ambiente natural e a possibilidade de contato com espécies domésticas de animais de produção, este estudo investigou a presença de pestivírus (vírus da diarreia viral bovina – BVDV) e gammaherpesvirus suíno (Herpesvírus linfotrópico suíno – PLHV) em javalis de vida livre provenientes das regiões Norte e dos Campos Gerais, no estado do Paraná, Brasil. Amostras de pulmões e soros de javalis abatidos por controladores colhidas entre 2017 e 2019 foram utilizadas para a investigação da presença de RNA de BVDV, de anticorpos anti-BVDV e de DNA de PLHV. Adicionalmente, pulmões e baços de seis fetos provenientes de uma fêmea abatida foram investigados quanto à presença de PLHV. No primeiro estudo, para investigação de BVDV, 49 amostras de pulmão foram avaliadas por RT-PCR para amplificação de um fragmento de 288 pb da região genômica 5'UTR e 42 amostras de soros pela técnica de vírusneutralização. Nenhuma das amostras de soro avaliadas apresentou anticorpos anti-BVDV. Porém, em três (6,12%) amostras de pulmão foi possível obter um fragmento do tamanho esperado para BVDV. Por meio de sequenciamento, uma cepa de BVDV foi classificada como subgenotipo 1a e duas cepas como subgenotipo 1d. No segundo estudo, 50 amostras de pulmões foram utilizadas para investigação da presença de DNA de PLHV a partir da amplificação do gene da DNA polimerase. Primeiramente, foram realizadas reações de PCR com primers consensuais (pan-herpesvírus) e, para classificação das espécies de PLHV-1, PLHV-2 e PLHV-3, novas reações de PCR foram feitas com primers específicos para amplificação de 393pb, 334pb e 148pb, respectivamente. DNA de PLHV foi amplificado em 48 (96%) das 50 amostras de pulmões analisadas, das quais, 33 (68,75%) amostras foram positivas para pelo menos duas espécies de PLHV. Apesar de serem provenientes de uma fêmea PLHV-positiva, as amostras de órgãos dos seis fetos analisadas foram negativas. O estudo permitiu concluir que i) ocorre circulação de BVDV em javalis de vida livre na região estudada; ii) as infecções por PLHV são endêmicas nessas populações; iii) e não há evidências de transmissão vertical de PLHV na fêmea avaliada. Esses resultados alertam sobre o potencial de javalis de vida livre atuarem como reservatórios e transmissores de doenças para animais de produção e evidenciam a importância do constante monitoramento sanitário desses animais.

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