01 - Doutorado - Ciência Animal
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Navegando 01 - Doutorado - Ciência Animal por Autor "Alberton, Geraldo Camilo"
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Item Diagnóstico e estudo molecular de cepas brasileiras de rotavírus suíno espécies B e HMolinari, Bruna Letícia Domingues; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Zotti, Everson; Alberton, Geraldo Camilo; Headley, Selwyn Arlington; Leme, Raquel de ArrudaResumo: A gastroenterite em leitões lactentes e recém-desmamados representa a principal causa de morbidade e mortalidade durante o período neonatal A síndrome é caracterizada por infecção entérica multifatorial e multietiológica Entre as causas infecciosas, o rotavírus (RV) é o principal agente etiológico viral Por serem mais frequentes, as espécies de rotavírus A (RVA) e C (RVC) são as mais estudadas No entanto, surtos de diarreia causados por espécies de rotavírus B (RVB) em leitões lactentes estão sendo relatados em rebanhos de suínos das regiões sul e centro-oeste do Brasil Por sua vez, a espécie de rotavírus H (RVH) foi descrita apenas recentemente na suinocultura brasileira Os objetivos deste estudo foram avaliar a presença de cepas de RV em um surto de diarreia em leitões lactentes e recém-desmamos que ocorreu em uma granja com programa de vacinação contra patógenos entéricos, incluindo RVA, e realizar a caracterização molecular das cepas de RVB e RVH identificadas Para isso, três estudos independentes foram realizados O objetivo do primeiro estudo foi determinar as sequências de nucleotídeos (nt) e de aminoácidos (aa) dos genes que codificam as proteínas VP6, VP7, VP4 e NSP4 de seis cepas de campo identificadas como RVH (BR59, BR6, BR61, BR62, BR63 e BR64) no surto de diarreia A partir da cepa de RVH suína, SKA-1, primers específicos foram selecionados para amplicação dos genes citados acima Com base nas altas identidades encontradas entre as sequências de nt (~99%) dos genes VP6, VP4, VP7 e NSP4 entre cinco das cepas estudadas (BR59 a BR63), é possível considerá-las pertencentes a mesma linhagem de RV, denominada RVH / BRA-1 Em contraste, uma vez que a amostra fecal BR64 apresentou uma diferença relativamente alta (81,6% e 83,4% de identidade para nt e aa, respectivamente) na sequência referente à proteína VP7, quando comparada com as outras cinco amostras, a mesma foi denominada cepa RVH / BRA-2 No segundo estudo, com o objetivo de triar todas as amostras diarreicas (n = 5) obtidas no surto para RVA, B, C e H, realizou-se RT-PCR com primers específicos para cada espécie De acordo com os testes, RVC (78%) foi mais prevalente nas infecções singulares (34%) e mistas (44%), seguido pelo RVA (46%), RVB (32%) e RVH (18%) A análise filogenética de três cepas de RVA permitiu a caracterização de dois genotipos G / P distintos, representados por G5P[13] e G9P[23], diferentemente do G5P[7] presente em vacinas comerciais Independentemente da espécie de RV, as infecções mistas (54%) foram mais prevalentes do que as infecções por um único agente RVB e RVH foram detectados apenas em associação com outros grupos de RV, sugerindo uma ação secundária dessas espécies no surto relatado Finalmente, no terceiro estudo, com base na qualidade do produto amplificado por RT-PCR, a amostra fecal de RVB identificada como BR62, foi selecionada para análises moleculares adicionais As sequências de nt e aa do gene VP7 foram determinadas e a análise comparativa desta cepa com as cepas dos outros 21 genotipos de VP7 previamente identificados mostraram que a cepa suína brasileira pertence a um novo genotipo, G22, e parece estar circulando em diferentes partes do mundo Os estudos reforçam o papel dos RV como importantes agentes causadores de diarreia demonstram a variabilidade genética entre as espécies Além disso, esta é a primeira detecção do genotipo de RVB, G22, em rebanhos suinícolas brasileirosItem Efeitos sistêmicos da contaminação por Desoxinivalenol, Fumonisina B e sua associação em suínosLucioli, Joelma; Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro [Orientador]; Santin, Elizabeth; Alberton, Geraldo Camilo; Santos, Joice Sifuentes dos; Ono, Mário AugustoResumo: Com o objetivo de avaliar os efeitos sistêmicos da contaminação por micotoxinas, enfatizando aspectos imunológicos e morfológicos, dois experimentos foram realizados No primeiro experimento, 24 leitões de 5 semanas de idade foram divididos em 4 grupos, cada um recebendo dieta controle, dieta contaminada com 2,8 mg/Kg DON ou 5,9 mg/Kg FB ou 6,5 mg/Kg DON+FB Os animais foram imunizados com ovalbumina no 4º e 16º dia e amostras de sangue foram coletadas Após 35 dias, os animais foram eutanasiados Amostras de tecidos foram coletadas e fixadas em formol 1% e em nitrogênio líquido a -8ºC Com as amostras de sangue, realizaram-se exames hematológicos, bioquímicos e imunológicos As amostras de tecidos fixadas em formol 1% foram submetidas a processamento histológico e imunoistoquímico, enquanto que as amostras congeladas foram submetidas a Western Blot e PCR para avaliação da expressão de proteínas de junção e citocinas No segundo experimento foram utilizados dois modelos experimentais No modelo in vivo, 24 leitões de 4 semanas de idade foram distribuídos em 2 grupos Durante 28 dias, um grupo recebeu dieta controle e o outro dieta contaminada com 2,3 mg/Kg DON Ao término do experimento, seis animais de cada grupo foram eutanasiados e amostras de jejuno e íleo foram coletadas e fixadas em formol a 1% e em nitrogênio líquido a -8ºC Para realização do modelo ex vivo foram eutanasiados seis animais de 4 semanas de idade para a obtenção dos explantes jejunais, os quais foram expostos a 5 e 1µmol/L de DON durante 4 horas, sob agitação constante a 39ºC Após a incubação, estes foram fixados em formol 1% ou nitrogênio líquido a -8ºC Com as amostras obtidas nos 2 modelos experimentais foram realizadas as técnicas de Western Blot e histopatologia, para avaliação da expressão de MAPK’s e morfologia intestinal A ingestão de dietas contaminadas com 2,8 mg/Kg de DON induziu ao aumento da expressão de citocinas de jejuno e íleo, enquanto que a ingestão de dietas contaminadas com 5,9 mg/Kg de FB aumentou a expressão de citocinas no íleo Nos animais que ingeriram dietas contaminadas com 6,5 mg/Kg DON+FB houve uma diminuição na resposta imune sistêmica Alterações morfológicas em fígado, pulmão, rins e intestinos foram observadas em animais que ingeriram as micotoxinas de forma isolada ou em associação A expressão das proteínas de junção E-caderina e Ocludina diminuiu significativamente nos animais que ingeriram dietas contaminadas com 2,8 mg/Kg DON e 6,5 mg/Kg DON+FB No segundo experimento, os dados obtidos no modelo ex vivo demonstraram a capacidade de DON, nas doses de 5 e 1 µmol/L, de provocar lise de enterócitos, edema intersticial e fusão de vilosidades Em ambos os modelos experimentais, verificou-se que DON ativou a expressão das MAPK’s p44/42 ERK ½ e phospho p38, não sendo observada a ativação de SAPK/JNK Em conclusão, os dados obtidos indicam que a ingestão de dietas mono ou co-contaminadas induziram alterações morfológicas e imunológicas que podem predispor os animais a infecções secundáriasItem Senecavirus A : virose vesicular emergente na suinocultura brasileiraLeme, Raquel de Arruda; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro; Takiuchi, Elisabete; Alberton, Geraldo Camilo; Costa, Marcio Carvalho daResumo: As doenças vesiculares são de grande importância para a Medicina Veterinária A febre aftosa, a doença vesicular suína, o exantema vesicular suíno e a estomatite vesicular são doenças vesiculares clássicas de etiologia viral Na família Picornaviridae estão incluídos o vírus da febre aftosa e o vírus da doença vesicular suína que ocasionam lesões vesiculares em suínos Entretanto, dois estudos realizados no Canadá e nos EUA a partir de 28 identificaram uma nova espécie de picornavírus, denominada Senecavirus A, como o mais provável agente etiológico de doença vesicular, similar à febre aftosa, em suínos No final de 214 e início de 215 houve diversos relatos de doença vesicular em suínos nas fases de creche e terminação, além do aumento da incidência de doença multissistêmica em leitões, com altas taxas de mortalidade, nos principais estados brasileiros produtores de suínos O objetivo deste estudo foi investigar a infecção natural pelo Senecavirus A em suínos de diferentes categorias de produção provenientes de granjas dos estados brasileiros de maior importância para a suinocultura Para isso foram realizados três estudos O primeiro estudo teve como objetivo investigar a infecção pelo Senecavirus A em surtos de doença vesicular de origem desconhecida em suínos das categorias de creche e adultos Um conjunto de primers específico para amplificar um produto de 542 pb da região VP3/VP1 do genoma do vírus foi desenhado para ser utilizado na técnica de RT-PCR Amostras clínicas de suínos foram coletadas em oito granjas com surto da doença vesicular, incluindo fluido vesicular (n=4), swabs de vesículas rompidas (n=7) e raspados de lesões ulcerativas (n=5) Foram também analisadas raspados de pele (n=52) de suínos assintomáticos provenientes de granjas com e sem histórico da doença Os agentes virais de doenças vesiculares clássicas foram investigados e não foram detectados O RNA do Senecavirus A foi detectado em todas as amostras (16/16) provenientes de animais acometidos pela doença vesicular, enquanto nenhuma das amostras de animais assintomáticos foram positivas para o vírus O segundo e o terceiro estudos descrevem, respectivamente, novas manifestações clínicas associadas ao Senecavirus A assim como os achados patológicos, imunohistoquímicos e moleculares associados à infecção, ambos em leitões neonatos com 1 a 5 dias de idade No segundo estudo, foram analisadas amostras de órgãos/tecidos (n=81) e de fezes (n=6) de 1 leitões, provenientes de cinco granjas dos estados do Paraná, Santa Catarina e Mato Grosso do Sul O terceiro estudo é complementar ao segundo e foram incluídas amostras clínicas de mais dois leitões provenientes dos estados de São Paulo e Santa Catarina, totalizando 12 amostras de órgãos/tecidos e 8 amostras de fezes Todos os leitões incluídos nos estudos manifestaram sinais clínicos de fraqueza, letargia, salivação excessiva, hiperemia cutânea, sinais neurológicos, diarreia e/ou morte espontânea Em conjunto, os resultados desses dois estudos revelaram que os achados de necropsia mais comuns foram impressão das costelas em pulmões (n=9), glossite diftérica (n=6) e lesões ulcerativas na banda coronária (n=5) A histopatologia revelou pneumonia intersticial (n=12), miocardite (n=6), glossite diftérica (n=3), encefalite (n=3) e atrofia das vilosidades intestinais com vacuolização das células epiteliais superficiais (n=6) A imunohistoquímica com anticorpos monoclonais específicos para Senecavirus A demonstrou imunorreatividade no plexo coróide do cérebro, epitélio degenerado de lesões ulcerativas da língua, uroepitelio do rim e vesícula urinária e nas células superficiais do intestino e em vários tecidos dos leitões; os ensaios moleculares para os outros vírus avaliados apresentaram resultados negativos Os estudos descrevem pela primeira vez a infecção pelo Senecavirus A fora da América do Norte e sugerem que o vírus seja o agente causal dos surtos de doença vesicular descritos no Brasil, bem como a participação do vírus em múltiplas lesões observadas em leitões neonatos, caracterizando-se como um vírus pantrópico capaz de causar doença multissistêmica em suínos infectados precocemente