Anticorpo monoclonal de alta eficiência no desenvolvimento de imunoquímica aplicada : análise de ocratoxina em vinho

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dc.contributor.advisorHirooka, Elisa Yoko [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorDoro-da-Silva, Dani Lucept_BR
dc.contributor.bancaScussel, Vildes Mariapt_BR
dc.contributor.bancaMachinski Junior, Miguelpt_BR
dc.contributor.bancaItano, Eiko Nakagawapt_BR
dc.contributor.bancaOliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira dept_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T13:50:40Z
dc.date.available2024-05-01T13:50:40Z
dc.date.created2010.00pt_BR
dc.date.defesa13.12.2010pt_BR
dc.description.abstractResumo: O agronegócio globalizado, cada vez mais competitivo, exige segurança com enfoque na legislação sanitária perante alimento saudável aos consumidores No cenário, o controle de Ocratoxina A (OTA) em produtos derivados de uva, com ênfase ao vinho, já é uma realidade na Comunidade Européia, cujo monitoramento contínuo deve ser executado empregando métodos confiáveis e acessíveis Em contraste ao iminente lançamento de biosensores, capazes de conferir rapidez na análise in loco, o Brasil ainda é dependente de kits analíticos importados, cujo custo restringe o amplo monitoramento na rotina de controle de qualidade Considerando que ensaios imunoquímicos, a exemplo de ELISA, seja a base para avanço tecnológico – biosensores, procedeu-se desde o cultivo de hibridoma OTA1 em meio sintético, visando produção de imunorreagente O anticorpo monoclonal (AcM) IgG anti-OTA obtido foi aplicado no desenvolvimento de ELISA competitivo indireto (ic-ELISA) e coluna de imunoafinidade (IAC) O cultivo de hibridoma OTA1 iniciado em meio RPMI com 1% de soro fetal bovino foi gradativamente adaptado até 1% de meio H-SFM (Hybridoma-Serum Free Medium) O AcM de maior pureza produzido (meio 1% H-SFM) apresentou título de 1:1, analisado por ic-ELISA, sendo utilizado juntamente com o conjugado OTA-BSA na diluição de 1:3 A validação intra-laboratorial foi realizada, procedendo comparação com CLAE para análise de OTA em vinho tinto (VT), rosado (VR) e branco (VB) Os parâmetros avaliados consistiram de limite de detecção (,17; ,15 e ,14 ng/mL para VT, VR e VB respectivamente); quantificação (1,29; ,91 e ,64 ng/mL para VT, VR e VB); exatidão (recuperação média de 9,6%; 89,2% e 89,6% para VT, VR e VB); linearidade; precisão avaliada em termo de repetibilidade (RSD de 9,41; 8,1 e 9,29%, respectivamente para VT, VR e VB) e precisão intermediária (RSD de 15,81; 12,66 e 12,65%) A incerteza padrão máxima foi calculada para três níveis de contaminação de OTA (,5; 2 e 5 ng/mL) obtendo-se para ,5 ng/mL 26, 25 e 24% para VT, VR e VB, respectivamente, e incerteza de 2% para níveis de OTA de 2 e 5 ng/mL para as três matrizes O ic-ELISA desenvolvido apresentou correlação de R=,975 com CLAE, na análise de 14 amostras positivas, do total de 7 vinhos comerciais (47 VT e 23 VB) Consequentemente, CLAE detectou positividade em 14 amostras, divididas em 1 VT (,14 a ,99 ng/mL) e em 4 VB (,33 a ,9 ng/mL) O ic-ELISA detectou 12 amostras positivas, divididas em 8 VT (,26 a ,86 ng/mL) e 4 VB (,29 a 1,12 ng/mL) Paralelamente, CIA baseada em suporte ativado Affi-Gel 1 foi confeccionada com AcM IgG obtido de cultivo em 75 e 1% H-SFM (1:1) nas concentrações de 5, 1 e 2 mg de IgG/mL de gel; as CIAs desenvolvidas foram denominadas CIA 5, 1 e 2, respectivamente Comparando a eficiência de etanolamina e glicina no capeamento pós-imobilização de IgG (end-capping), ambas apresentaram resultados similares A etanolamina foi escolhida para continuidade da padronização, em virtude de menor custo, obtendo-se eficiência da imobilização de AcM de 86,43% para CIA 5; 85,18 % para CIA 1 e 88,5% para CIA 2 A seguir, a capacidade de retenção de toxina pela coluna desenvolvida foi avaliada aplicando 2 ng de OTA; CIA 5 reteve 72,8%, CIA 1, 76,85% e CIA 2, 67,2% de OTA A atividade específica foi de 6,54 ng de OTA retida/mg de IgG imobilizada para CIA 5; 3,58 para CIA 1 e 1,5 para CIA 2 A CIA 1 e CIA 5 apresentaram a efetividade de recuperação de OTA similar, quando testadas em concentrações entre ,5 a 15 ng em tampão PBS-bicarbonato de sódio 1% (p<,5) Portanto, a CIA 5 foi selecionada para prosseguir o estudo de validação (taxa de recuperação de OTA em VT 8 artificialmente contaminado, detecção de OTA em vinhos naturalmente contaminados e reuso de coluna) Assim, a CIA 5 foi comparada com CIA comercial, avaliando a eficiência na recuperação de OTA em vinho tinto artificialmente contaminado (,5; 2; 5 ng/mL) A CIA 5 recuperou 8,5 % de OTA em vinho contaminado com ,5 ng de OTA/mL, em relação a 77% de recuperação obtida em CIA comercial Contaminando o vinho tinto com 2 ng de OTA/mL, a recuperação atingida pela CIA 5 foi de 76,87%, em relação a 86,14% pela CIA comercial Contaminando com 5 ng de OTA/mL, a CIA 5 recuperou 76,75%, em ralação 84,97 % pela CIA comercial Entretanto, CIA desenvolvida e comercial não apresentaram diferença significativa perante taxa de recuperação nas concentrações testadas (p<,5) A aplicabilidade de CIA 5 desenvolvida foi testada perante 14 amostras naturalmente contaminadas (1 VT e 4 VB) A alta correlação, observada entre CIA 5 e CIA comercial (R=,954), confirma a aplicabilidade desta imunoferramenta desenvolvida com suporte Affi-Gel no controle de qualidade de vinho A regeneração de coluna visando reuso foi avaliada, procedendo cinco determinações consecutivas para três concentrações de OTA (,5; 2 e 5 ng/mL de vinho) A CIA 5 apresentou possibilidade de reuso após duas regenerações, demonstrando aplicabilidade em vinho tinto por até três usos Resumindo, a alta especificidade do AcM produzido por hibridoma OTA1 atingindo título de 1:1, preenche a condição essencial requerida para desenvolvimento de biossensor que juntamente com o conjugado OTA-BSA estável com fator de diluição de trabalho de 1:3 em ic -ELISA, constitui-se em reagente promissor para emprego em bioferramentas sensíveis Portanto, a melhoria na tecnologia de produção de imunoreagentes deve ser continuada, tendo em vista posição estratégica no contexto de nanobiotecnologiapt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: The globalized agribusiness, increasingly competitive, requires safety with a focus on health legislation before healthy food to consumers In this scenario, the control of Ochratoxin A (OTA) in grape-derived products, with emphasis on wine is already a reality in the European Union, whose continuous monitoring should be performed using reliable and accessible methods In contrast to the imminent launch of biosensors, capable of making rapid analysis in situ the Brazil is still dependent on analytical imported kits, which cost restricts the broad monitoring in routine of quality control Whereas, immunochemicals methods such ELISA, is the basis for technological advancement - biosensors, proceeded from the cultivation of hybridoma OTA1 in synthetic medium, aiming production of immunoreagent The monoclonal antibody (MAb) IgG anti-OTA obtained was applied in the development of indirect competitive ELISA (ic-ELISA) and immunoaffinity column (IAC) Cultivation of hybridoma OTA1 initiated in RPMI medium with 1% of fetal bovine serum was gradually adapted until 1% of the H-SFM (Hybridoma Serum-Free Medium) The mAb with higher purity showed titer of 1:1,, analyzed by ic-ELISA being used with the OTA-BSA conjugate at a dilution of 1:3, Intra-laboratory validation was carried out, proceeding with comparison to HPLC analysis of OTA in red wine (RE), rose (RO) and white (WH) The parameters evaluated were the detection limit (17, 15 and 14 ng ml-1 for RE, RO and WH respectively), quantification (129, 91 and 64 ng ml-1 for RE, RO and WH), accuracy (average recovery of 96%, 892% and 896% for RE, RO and WH), linearity, precision evaluated in terms of repeatability (RSD of 941, 81 and 929%, respectively for RE, RO and WH) and intermediate precision (RSD of 1581, 1266 and 1265%) The maximum standard uncertainty was calculated for three contamination levels of OTA (5, 2 and 5 ng ml-1), obtained 26, 25 and 24% to 5 ng ml-1 for RE, RO and WH, respectively, and uncertainty of 2% for OTA levels of 2 and 5 ng ml-1 for the three matrixThe ic-ELISA developed showed correlation of R= 975 with HPLC analysis of 14 positive samples, out of 7 commercial wines (47 RE and 23 WH) Consequently, HPLC detected positivity in 14 samples, divided into 1 RE (14 to 99 ng ml-1) and 4 WH (33 to 9 ng ml-1) The ic-ELISA detected 12 positive samples, divided into 8 RE (26 to 86 ng ml-1) and 4 WH (29 to 112 ng ml-1) In parallel, IAC based on support activated Affi-Gel 1 was prepared with mAb IgG obtained from cultivation at 75 and 1% H-SFM (1:1) at concentrations of 5, 1 and 2 mg of IgG /mL of gel; the IACs developed were called IAC 5, 1 and 2, respectively Comparing the efficiency of ethanolamine and glycine in the capping post-immobilization of IgG (end-capping), both showed similar results The ethanolamine was chosen to continue the standardization, because of lower cost, resulting in immobilization efficiency of 8643% to IAC 5; 8518% to IAC 1 and 885% to IAC 2 Next, the capacity of retention of toxin by the column was evaluated by applying 2 ng of OTA; IAC 5 retained 728%, IAC 1, 7685% and IAC 2, 672% of OTA The specific activity was 654 ng of OTA retained/ mg of IgG immobilized to IAC 5, 358 for 1 IAC and 15 for IAC 2 The IAC 1 and IAC 5 recovered OTA with similar effectiveness at concentrations between 5 and 15 ng in PBS-1% sodium bicarbonate (p <5) The IAC 5 was chosen to proceed the intra-laboratory validation by comparing with IAC commercial Was evaluated the recovery rate of OTA in red wine (RE) artificially contaminated; 1 detection of OTA in naturally contaminated wine and reusing column The effectiveness of IAC 5 was compared with IAC commercial, evaluating the recovery efficiency of OTA in red wine spiked (5, 2, 5 ng ml-1) The IAC 5 recovered 85% of OTA in spiked wine with 5 ng ml-1 compared to 77% of recovery obtained by IAC commercial RE spiked RE with 2 ng of OTA ml-1, the recovery achieved by the CIA 5 was 7687% against 8614% for CIA commercial Spiking with 5 ng OTA ml-1, the CIA 5 recovered 7675% 8497% for the CIA commercialHowever, was not found significant difference between IAC developed and commercial in recovery rate for tested concentrations (p <5) Assessing the applicability of the IAC developed against 14 naturally contaminated samples (1 RE and 4 WH) The high correlation observed between IAC 5 and IAC commercial (R = 954) confirms the applicability of immuno tool developed with Affi-Gel support for the control quality of wine The column regeneration was evaluated in order to reuse carrying five consecutive determinations for three concentrations of OTA (5, 2 and 5 ng ml-1 of wine) The IAC 5 presented the possibility of reuse after two regenerations, demonstrating applicability in red wine for up to three uses Summarizing, the high specificity of mAb produced by hybridoma OTA1 reaching title of 1:1, fill up the essential condition requested by development of biosensor, which coupled with the stable OTA-BSA conjugate at working-dilution factor of 1:3, by ic -ELISA, would be a promising reagent to engage into sensitive biotool Therefore improvement on production technology concerning immunoreagents should be continued, taking to account its strategic status within the background of nanobiotechnologypt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/12241
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência de Alimentospt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.subjectVinho e vinificaçãopt_BR
dc.subjectMicrobiologiapt_BR
dc.subjectAnticorpos monoclonaispt_BR
dc.subjectAlimentospt_BR
dc.subjectIndústriapt_BR
dc.subjectMicrobiologypt_BR
dc.subjectMonoclonal antibodiespt_BR
dc.subjectImmunochemistrypt_BR
dc.subjectWine and wine makingpt_BR
dc.titleAnticorpo monoclonal de alta eficiência no desenvolvimento de imunoquímica aplicada : análise de ocratoxina em vinhopt_BR
dc.typeTesept_BR

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