Anticorpo monoclonal de alta eficiência no desenvolvimento de imunoquímica aplicada : análise de ocratoxina em vinho
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Doro-da-Silva, Dani Luce
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Resumo
Resumo: O agronegócio globalizado, cada vez mais competitivo, exige segurança com enfoque na legislação sanitária perante alimento saudável aos consumidores No cenário, o controle de Ocratoxina A (OTA) em produtos derivados de uva, com ênfase ao vinho, já é uma realidade na Comunidade Européia, cujo monitoramento contínuo deve ser executado empregando métodos confiáveis e acessíveis Em contraste ao iminente lançamento de biosensores, capazes de conferir rapidez na análise in loco, o Brasil ainda é dependente de kits analíticos importados, cujo custo restringe o amplo monitoramento na rotina de controle de qualidade Considerando que ensaios imunoquímicos, a exemplo de ELISA, seja a base para avanço tecnológico – biosensores, procedeu-se desde o cultivo de hibridoma OTA1 em meio sintético, visando produção de imunorreagente O anticorpo monoclonal (AcM) IgG anti-OTA obtido foi aplicado no desenvolvimento de ELISA competitivo indireto (ic-ELISA) e coluna de imunoafinidade (IAC) O cultivo de hibridoma OTA1 iniciado em meio RPMI com 1% de soro fetal bovino foi gradativamente adaptado até 1% de meio H-SFM (Hybridoma-Serum Free Medium) O AcM de maior pureza produzido (meio 1% H-SFM) apresentou título de 1:1, analisado por ic-ELISA, sendo utilizado juntamente com o conjugado OTA-BSA na diluição de 1:3 A validação intra-laboratorial foi realizada, procedendo comparação com CLAE para análise de OTA em vinho tinto (VT), rosado (VR) e branco (VB) Os parâmetros avaliados consistiram de limite de detecção (,17; ,15 e ,14 ng/mL para VT, VR e VB respectivamente); quantificação (1,29; ,91 e ,64 ng/mL para VT, VR e VB); exatidão (recuperação média de 9,6%; 89,2% e 89,6% para VT, VR e VB); linearidade; precisão avaliada em termo de repetibilidade (RSD de 9,41; 8,1 e 9,29%, respectivamente para VT, VR e VB) e precisão intermediária (RSD de 15,81; 12,66 e 12,65%) A incerteza padrão máxima foi calculada para três níveis de contaminação de OTA (,5; 2 e 5 ng/mL) obtendo-se para ,5 ng/mL 26, 25 e 24% para VT, VR e VB, respectivamente, e incerteza de 2% para níveis de OTA de 2 e 5 ng/mL para as três matrizes O ic-ELISA desenvolvido apresentou correlação de R=,975 com CLAE, na análise de 14 amostras positivas, do total de 7 vinhos comerciais (47 VT e 23 VB) Consequentemente, CLAE detectou positividade em 14 amostras, divididas em 1 VT (,14 a ,99 ng/mL) e em 4 VB (,33 a ,9 ng/mL) O ic-ELISA detectou 12 amostras positivas, divididas em 8 VT (,26 a ,86 ng/mL) e 4 VB (,29 a 1,12 ng/mL) Paralelamente, CIA baseada em suporte ativado Affi-Gel 1 foi confeccionada com AcM IgG obtido de cultivo em 75 e 1% H-SFM (1:1) nas concentrações de 5, 1 e 2 mg de IgG/mL de gel; as CIAs desenvolvidas foram denominadas CIA 5, 1 e 2, respectivamente Comparando a eficiência de etanolamina e glicina no capeamento pós-imobilização de IgG (end-capping), ambas apresentaram resultados similares A etanolamina foi escolhida para continuidade da padronização, em virtude de menor custo, obtendo-se eficiência da imobilização de AcM de 86,43% para CIA 5; 85,18 % para CIA 1 e 88,5% para CIA 2 A seguir, a capacidade de retenção de toxina pela coluna desenvolvida foi avaliada aplicando 2 ng de OTA; CIA 5 reteve 72,8%, CIA 1, 76,85% e CIA 2, 67,2% de OTA A atividade específica foi de 6,54 ng de OTA retida/mg de IgG imobilizada para CIA 5; 3,58 para CIA 1 e 1,5 para CIA 2 A CIA 1 e CIA 5 apresentaram a efetividade de recuperação de OTA similar, quando testadas em concentrações entre ,5 a 15 ng em tampão PBS-bicarbonato de sódio 1% (p<,5) Portanto, a CIA 5 foi selecionada para prosseguir o estudo de validação (taxa de recuperação de OTA em VT 8 artificialmente contaminado, detecção de OTA em vinhos naturalmente contaminados e reuso de coluna) Assim, a CIA 5 foi comparada com CIA comercial, avaliando a eficiência na recuperação de OTA em vinho tinto artificialmente contaminado (,5; 2; 5 ng/mL) A CIA 5 recuperou 8,5 % de OTA em vinho contaminado com ,5 ng de OTA/mL, em relação a 77% de recuperação obtida em CIA comercial Contaminando o vinho tinto com 2 ng de OTA/mL, a recuperação atingida pela CIA 5 foi de 76,87%, em relação a 86,14% pela CIA comercial Contaminando com 5 ng de OTA/mL, a CIA 5 recuperou 76,75%, em ralação 84,97 % pela CIA comercial Entretanto, CIA desenvolvida e comercial não apresentaram diferença significativa perante taxa de recuperação nas concentrações testadas (p<,5) A aplicabilidade de CIA 5 desenvolvida foi testada perante 14 amostras naturalmente contaminadas (1 VT e 4 VB) A alta correlação, observada entre CIA 5 e CIA comercial (R=,954), confirma a aplicabilidade desta imunoferramenta desenvolvida com suporte Affi-Gel no controle de qualidade de vinho A regeneração de coluna visando reuso foi avaliada, procedendo cinco determinações consecutivas para três concentrações de OTA (,5; 2 e 5 ng/mL de vinho) A CIA 5 apresentou possibilidade de reuso após duas regenerações, demonstrando aplicabilidade em vinho tinto por até três usos Resumindo, a alta especificidade do AcM produzido por hibridoma OTA1 atingindo título de 1:1, preenche a condição essencial requerida para desenvolvimento de biossensor que juntamente com o conjugado OTA-BSA estável com fator de diluição de trabalho de 1:3 em ic -ELISA, constitui-se em reagente promissor para emprego em bioferramentas sensíveis Portanto, a melhoria na tecnologia de produção de imunoreagentes deve ser continuada, tendo em vista posição estratégica no contexto de nanobiotecnologia
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Palavras-chave
Vinho e vinificação, Microbiologia, Anticorpos monoclonais, Alimentos, Indústria, Microbiology, Monoclonal antibodies, Immunochemistry, Wine and wine making