Semi-nested PCR para a detecção molecular do fungo Paracoccidioides brasiliensis
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Koishi, Andrea Cristine
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Resumo
Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico e agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica endêmica na América Latina A PCM é rotineiramente diagnosticada pela observação direta das células do fungo, por cultura celular ou ainda por métodos sorológicos Entretanto, essas técnicas apresentam limitações que podem levar a atrasos para o início do tratamento ou mesmo a resultados falso negativos Neste estudo foi desenvolvida uma reação de semi-nested PCR para a detecção do DNA de P brasiliensis, utilizando a seqüência do DNA ribossomal como alvo Inicialmente, amostras de DNA de P brasiliensis (cepas Pb18 e LDR1) e de outros fungos patogênicos foram extraídas e usadas para se determinar o limite de detecção da reação e a ocorrência de reações cruzadas Para avaliar a reação de semi-nested, ela foi comparada com os métodos de cultivo e histopatologia quanto à capacidade de detecção de P brasiliensis Pb18 em amostras de tecidos de camundongos experimentalmente infectados E ainda, a reação desenvolvida neste trabalho foi utilizada para a detecção do fungo em amostras de biópsia bucal de pacientes com suspeita de PCM e solo de tocas de tatu e formigueiros Na tentativa de otimizar a reação foi desenvolvida uma semi-nested PCR em uma única etapa A semi-nested PCR mostrou-se específica para P brasiliensis e o limite de detecção foi de 2,5 pg de DNA ou 1 células do fungo No estudo comparativo a semi-nested PCR e a histopatologia foram positivas para todas as amostras de animais infectados, inclusive quando parafinadas, enquanto que a cultura foi positiva apenas para 6% das amostras A semi-nested PCR também foi positiva para as 4 amostras de pacientes com PCM e para duas amostras de solo, uma de toca de tatu e outra de formigueiro A semi-nested PCR em um tubo foi específica para P brasiliensis, porém, com um limite de detecção de ,25 ng de DNA Este estudo mostrou a alta sensibilidade e especificidade dessa nova reação de semi-nested PCR para a detecção molecular de P brasiliensis em amostras de biópsias, em tecidos embebidos em parafina e mesmo do solo
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Palavras-chave
Patologia experimental, Paracoccidioides brasiliensis, Paracoccidioidomicose, Experimental pathology, Brazilian blastomycosis