Diferenciação entre Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans utilizando a região do espaço intergênico 1 (IGS1) do DNA ribossomal por PCR em tempo real
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Tavares, Eliandro Reis
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Resumo
Resumo: A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado principalmente entre pacientes portadores de HIV A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo C neoformans e C gattii as espécies clinicamente mais importantes Estas acometem principalmente pacientes imunossuprimidos, entretanto C gattii pode causar doença também em indivíduos imunocompetentes Neste trabalho foi padronizada uma reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para a identificação de C neoformans e C gattii tendo como alvo a região IGS1 (intergenic spacer 1) do rDNA Sequências correspondentes à região IGS1 de C gatti e C neoformans foram buscadas no GenBank e, após a análise, foi deduzida as sequências consensos, utilizadas para a síntese dos oligonucleotídeos iniciadores CnIGS1-F e CnIGS1-R, e CgIGS1-F e CgIGS1-R específicos para C neoformans e C gattii, respectivamente As cepas C neoformans ATCC 6631 e C gattii ATCC 5699 foram utilizadas como referência para os ensaios Inicialmente, o DNA genômico foi obtido de céluas em fase de crescimento exponencial, e quantificado por espectrometria a 26/28 nm A reação foi realizada usando 1 ng de DNA como molde, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, oligonucleotídeos iniciadores; as amostras foram corridas em um termociclador Rotor Gene 6 As curvas de dissociação (melting curve) foram geradas em ambas as corridas, entre 6° C e 95° C, com um aumento de ,5 °/segundo, para observação dos picos de dissociação Os resultados mostraram dois diferentes picos de dissociação: 82,8 °C e 84,2 °C para C gattii e C neoformans, respectivamente Não foi observada amplificação quando DNA total, de C albicans, C tropicalis, C dubliniensis, H capsulatum, T rubrum, S schenckii, P brasiliensis ou H sapiens foi utilizada na PCR Em conclusão, a amplificação por PCR em tempo real foi específica, permitindo a identificação de ambos os fungos, mostrando que a região IGS1 apresenta polimorfismo, podendo ser usada como um marcador molecular Assim, os oligonucleotídeos iniciadores desenhados podem ser utilizados na identificação de C neoformans e C gattii
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Palavras-chave
Fungos patogênicos, Diagnóstico molecular, Leveduras (Fungos), Criptococose, Reação em cadeia de polimerase, Molecular diagnosis, Yeast fungi, Cryptococcosis, Pathogenic fungi