Diagnóstico molecular e análise de polimorfismos do gene S1 de estirpes brasileiras do coronavírus bovino em fezes diarreicas de bezerros naturalmente infectados
Arquivos
Data
Autores
Takiuchi, Elisabete
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Resumo
Resumo: O coronavírus bovino (BCoV) é um importante agente etiológico de diarréia neonatal em bezerros Usualmente, as técnicas para a detecção do BCoV limitam-se a métodos de baixa sensibilidade como ensaios imunoenzimáticos e testes de hemaglutinação (HA)/ inibição da hemaglutinação (HI) Embora a PCR seja altamente sensível e específica, a natureza da amostra biológica é um fator limitante no diagnóstico do BCoV, devido à presença de inibidores de PCR nas fezes que podem gerar resultados falso-negativos A utilização de um controle interno na reação de PCR tem sido útil para monitorar a qualidade da extração e amplificação do ácido nucléico Este trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema de Semi nested-PCR (SN-PCR) para amplificação de um fragmento de 251 pares de bases (pb) do gene do nucleocapsídeo (N) do BCoV a partir de amostras fecais congeladas (n=25) e frescas (n=25) de bezerros com sinais clínicos de diarréia e naturalmente infectados Para aperfeiçoar a detecção do BCoV em amostras fecais pela SN-PCR foi avaliada a inclusão de um controle interno e os resultados foram comparados com uma RT-PCR convencional descrita na literatura O gene N do BCoV foi detectado pela SN-PCR e RT-PCR em respectivamente, 24% (12/5) e 8% (4/5) das amostras analisadas (K=,43) Somente as amostras que não sofreram o congelamento foram positivas na RT-PCR enquanto a SN-PCR descrita neste trabalho detectou o BCoV em ambas condições de preservação A possibilidade de resultados falso-negativos foi descartada com a amplificação do controle interno em todas as amostras analisadas A inclusão de um controle interno na PCR possibilitou maior precisão no diagnóstico do BCoV como agente etiológico da diarréia em bezerros Com o objetivo de estabelecer as relações genéticas entre as três estirpes brasileiras de BCoV daquelas descritas em outros países, foi desenvolvida uma estratégia de seqüenciamento para o gene que codifica a subunidade S1 da glicoproteína da espícula aplicando posteriormente o método da máxima parcimônia para realização das estimativas filogenéticas A análise filogenética da seqüência total de nucleotídeos e dos aminoácidos deduzidos do gene S1 revelou que as estirpes brasileiras descritas neste trabalho apresentaram maior identidade com a estirpe entérica americana BCoV-ENT com 98,7% e 98,7%, respectivamente A menor identidade foi observada com o protótipo BCoV Mebus com 97,8% (nucleotídeos) e 96,8% (aminoácidos) Na reconstrução da árvore filogenética não enraizada, baseada na região hipervariável da subunidade S1, nossas amostras foram agrupadas com as amostras americanas (BCoV-ENT, 182NS), amostras canadenses de diarréia neonatal (BCQ2, BCQ7373, BCQ27, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) e uma amostra canadense de diarréia do inverno (BCQ259) e agruparam-se em um ramo separado das estirpes de origem coreana e as estirpes respiratórias de BCoV Observou-se ainda que as três estirpes localizaram-se em um ramo bem distante de outras amostras brasileiras (AY66193, AY66194) anteriormente descritas Portanto, estes dados colaboram com a reconstrução genealógica dos BCoV e sugerem a existência de no mínimo dois BCoV circulantes no Brasil Adicionalmente o presente trabalho apresenta a descrição de uma mutação inédita na seqüência de aminoácidos observada no sítio de clivagem da proteína S As prováveis conseqüências biológicas desta mutação foram especuladas a partir de estudos relacionados com o coronavirus da hepatite dos comundongos (MHV)
Descrição
Palavras-chave
Coronavírus bovino, Diarréia em bezerro, Virologia veterinária, Coronavirus infections, Diarrhea in cattle, Veterinary virology