Diagnóstico molecular e análise de polimorfismos do gene S1 de estirpes brasileiras do coronavírus bovino em fezes diarreicas de bezerros naturalmente infectados

Página do item simplificado
dataload.collectionmapped01 - Doutorado - Ciência Animalpt_BR
dataload.filenamenourau303.pdfpt_BR
dataload.handlemapped123456789/3pt_BR
dataload.idpergamum114795pt_BR
dataload.idvirtuanourauvtls000119466pt_BR
dataload.idvirtuapergamumvtls000119466pt_BR
dataload.idvirtuapergamum.sameurlnourauSIMpt_BR
dataload.linknourauhttp://bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000119466pt_BR
dataload.linknourau.regularNÃOpt_BR
dataload.linknourau.retificadohttp://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000119466pt_BR
dataload.linknourau.size60.00pt_BR
dc.contributor.advisorAlfieri, Amauri Alcindo [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorTakiuchi, Elisabetept_BR
dc.contributor.bancaHeinemann, Marcos Bryanpt_BR
dc.contributor.bancaGarcia, José Eduardopt_BR
dc.contributor.bancaBarreiros, Marco Antônio Bacellarpt_BR
dc.contributor.bancaFungaro, Maria Helena Pelegrinellipt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T12:47:58Z
dc.date.available2024-05-01T12:47:58Z
dc.date.created2006.00pt_BR
dc.date.defesa17.11.2006pt_BR
dc.description.abstractResumo: O coronavírus bovino (BCoV) é um importante agente etiológico de diarréia neonatal em bezerros Usualmente, as técnicas para a detecção do BCoV limitam-se a métodos de baixa sensibilidade como ensaios imunoenzimáticos e testes de hemaglutinação (HA)/ inibição da hemaglutinação (HI) Embora a PCR seja altamente sensível e específica, a natureza da amostra biológica é um fator limitante no diagnóstico do BCoV, devido à presença de inibidores de PCR nas fezes que podem gerar resultados falso-negativos A utilização de um controle interno na reação de PCR tem sido útil para monitorar a qualidade da extração e amplificação do ácido nucléico Este trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema de Semi nested-PCR (SN-PCR) para amplificação de um fragmento de 251 pares de bases (pb) do gene do nucleocapsídeo (N) do BCoV a partir de amostras fecais congeladas (n=25) e frescas (n=25) de bezerros com sinais clínicos de diarréia e naturalmente infectados Para aperfeiçoar a detecção do BCoV em amostras fecais pela SN-PCR foi avaliada a inclusão de um controle interno e os resultados foram comparados com uma RT-PCR convencional descrita na literatura O gene N do BCoV foi detectado pela SN-PCR e RT-PCR em respectivamente, 24% (12/5) e 8% (4/5) das amostras analisadas (K=,43) Somente as amostras que não sofreram o congelamento foram positivas na RT-PCR enquanto a SN-PCR descrita neste trabalho detectou o BCoV em ambas condições de preservação A possibilidade de resultados falso-negativos foi descartada com a amplificação do controle interno em todas as amostras analisadas A inclusão de um controle interno na PCR possibilitou maior precisão no diagnóstico do BCoV como agente etiológico da diarréia em bezerros Com o objetivo de estabelecer as relações genéticas entre as três estirpes brasileiras de BCoV daquelas descritas em outros países, foi desenvolvida uma estratégia de seqüenciamento para o gene que codifica a subunidade S1 da glicoproteína da espícula aplicando posteriormente o método da máxima parcimônia para realização das estimativas filogenéticas A análise filogenética da seqüência total de nucleotídeos e dos aminoácidos deduzidos do gene S1 revelou que as estirpes brasileiras descritas neste trabalho apresentaram maior identidade com a estirpe entérica americana BCoV-ENT com 98,7% e 98,7%, respectivamente A menor identidade foi observada com o protótipo BCoV Mebus com 97,8% (nucleotídeos) e 96,8% (aminoácidos) Na reconstrução da árvore filogenética não enraizada, baseada na região hipervariável da subunidade S1, nossas amostras foram agrupadas com as amostras americanas (BCoV-ENT, 182NS), amostras canadenses de diarréia neonatal (BCQ2, BCQ7373, BCQ27, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) e uma amostra canadense de diarréia do inverno (BCQ259) e agruparam-se em um ramo separado das estirpes de origem coreana e as estirpes respiratórias de BCoV Observou-se ainda que as três estirpes localizaram-se em um ramo bem distante de outras amostras brasileiras (AY66193, AY66194) anteriormente descritas Portanto, estes dados colaboram com a reconstrução genealógica dos BCoV e sugerem a existência de no mínimo dois BCoV circulantes no Brasil Adicionalmente o presente trabalho apresenta a descrição de uma mutação inédita na seqüência de aminoácidos observada no sítio de clivagem da proteína S As prováveis conseqüências biológicas desta mutação foram especuladas a partir de estudos relacionados com o coronavirus da hepatite dos comundongos (MHV)pt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Bovine coronavirus (BCoV) is an important infectious agent of neonatal diarrhea in calves worldwide Currently, the routine detection and diagnosis of BCoV have been mainly dependent on assays with low sensitive as the enzyme-linked immunosorbent assay or hemagglutination (HA) / hemagglutination inhibition (HI) tests Although PCR has been described as an assay with high sensitivity and specificity, the feces remains the most difficult clinical specimen for nucleic acid extraction and amplification due to the presence of PCR inhibitors that may yield false negative results The use of an internal control in the PCR reaction has been most commonly applied to monitor and evaluate these failures The aim of the present study was to develop and evaluate a semi-nested PCR (SN-PCR) to amplify a 251 base pairs (bp) fragment of BCoV N gene from fresh (n=25) and frozen (n=25) diarrheic fecal samples of naturally infected calves To improve detection of BCoV in fecal samples by the SN-PCR an internal control was developed, and the results were compared with a conventional RT-PCR assay previously described in the literature The rates of positive samples by SN-PCR and RT-PCR were respectively, 24% (12/5) and 8% (4/5) ((K=,43) Only fresh samples were positive in RT-PCR while the SN-PCR detected BCoV in both storage conditions The possibility of false negative results was excluded due to the internal control amplification in all samples analysed The inclusion of an internal control provided more accurate diagnosis of BCoV as causative agent of diarrhea in calves To verify genetic relationships among the three Brazilian strains of BCoV from other BCoV strains from different countries, was developed a sequencing strategy for the gene which codes spike glycoprotein S1 subunit and further phylogenetic analysis using maximum parsimony The phylogenetic analysis of the entire S1 nucleotide and deduced amino acid sequences showed that BCoV Brazilian strains described in this study were more similar to the American enteric strain BCoV-ENT with 987% and 987%, respectively The lower identity was observed with the BCoV Mebus strain with 978% (nucleotide level) and 968% (amino acid level) The phylogenetic unrooted tree based on hipervariable region of the S1 subunit, showed our strains clustered with American strains (BCoV-ENT, 182NS), Canadian calf diarrhea strains (BCQ2, BCQ7373, BCQ27, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) and an Canadian winter dysentery strain (BCQ259) but clustered on a separate branch of the Korean and respiratory BCoV strains Besides, it was described that BCoV strains of this study clustered in a separate branch of the previously published Brazilian strains (AY66193, AY66194) Therefore, these data corroborate to the genealogical construction and suggest the existence of at least two different BCoV strains circulating in Brazil The present study also relates an exclusive mutation in the amino acid sequence of the S protein cleavage site The probable biological effects of this mutation are discussed based on murine hepatitis coronaviruses (MHV) studiespt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Ciência Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animalpt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10724
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência Animalpt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-graduação em Ciência Animalpt_BR
dc.subjectCoronavírus bovinopt_BR
dc.subjectDiarréia em bezerropt_BR
dc.subjectVirologia veterináriapt_BR
dc.subjectCoronavirus infectionspt_BR
dc.subjectDiarrhea in cattlept_BR
dc.subjectVeterinary virologypt_BR
dc.titleDiagnóstico molecular e análise de polimorfismos do gene S1 de estirpes brasileiras do coronavírus bovino em fezes diarreicas de bezerros naturalmente infectadospt_BR
dc.typeTesept_BR

Arquivos

Pacote Original
Agora exibindo 1 - 1 de 1
Imagem de Miniatura
Nome:
303.pdf
Tamanho:
1.96 MB
Formato:
Adobe Portable Document Format
Baixar

Coleções

01 - Doutorado - Ciência Animal