01 - Doutorado - Genética e Biologia Molecular

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"Identificação e análise da expressão de genes de soja responsivos ao déficit hídrico e ao ciclo circadiano"
Gomes, Juliana Marcolino; Nepomuceno, Alexandre Lima [Orientador]; Abdelnoor, Ricardo Vilela; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Molinari, Hugo Bruno Correa; Harmon, Frank G. [Coorientador]
Resumo: Em todo o mundo, o déficit hídrico é o fator abiótico com mais impacto na produção de grandes culturas, como a soja O ciclo circadiano desempenha um papel crítico na resposta e adaptação das plantas às diferentes condições ambientais Recentemente, as oscilações circadianas foram associadas às respostas ao déficit hídrico, em nível transcricional Todavia, pouco se sabe sobre a relação entre o ciclo circadiano e as respostas das plantas ao déficit hídrico, principalmente em culturas como a soja Neste estudo, examinamos como o déficit hídrico interfere na oscilação diurna dos principais genes do ciclo circadiano e de resposta ao déficit hídrico em soja Nossos resultados mostraram que o déficit hídrico causa mudanças marcantes na expressão gênica de componentes do ciclo circadiano, como LCL1-, GmELF4- e PRR-like, reduzindo sua expressão As mesmas condições resultaram no avanço de fase na expressão dos genes GmTOC1-like, GmLUX-like e GmPRR7-like O déficit hídrico também resultou em alterações significativas no padrão rítmico de expressão dos genes seca-responsivos tais como DREB-, bZIP-, GOLS-, RAB18- e Remorin-like A fim de selecionar genes referência para a normalização da expressão gênica relativa em estudos sobre o déficit hídrico e as oscilações diurnas, nós validamos experimentalmente um conjunto inédito de genes referência de soja Os genes Fyve, NUDIX e Golgin-84 apresentaram expressão mais estável do que os genes normalizadores, convencionalmente utilizados, ELF1-ß e ß-actina, e foram considerados adequados para a normalização de dados de expressão em estudos sobre as respostas das plantas ao déficit hídrico em diferentes períodos do dia Nossos resultados indicaram a existência de conexão entre as respostas ao déficit hídrico e o ciclo circadiano de soja, uma vez que (i) o estresse afetou a expressão de componentes do ciclo circadiano e que (ii) genes responsivos ao estresse apresentaram oscilação diurna Esses resultados certamente irão incentivar estudos futuros sobre as implicações dessa conexão nas respostas das plantas a estas condições
Diversity and functional analysis of Rap-Phr systems from Bacillus cereus group
Cardoso, Priscilla de Freitas; Vilas-Bôas, Gislayne Fernandes Lemes Trindade [Orientador]; Lereclus, Didier; Mahillon, Jacques; Pontes, Rose Gomes Monnerat Solon de; Slamti, Leyla; Fazion, Fernanda Aparecida Pires; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Lereclus, Didier [Coorientador]
Resumo: O grupo Bacillus cereus é formado por oito espécies de bactérias Gram positivas esporulantes que podem colonizar diversos nichos ecológicos As espécies mais importantes do grupo são B cereus, bactéria ubíqua do solo e patógeno oportunista; B thuringiensis, entomopatógeno amplamente utilizado como biopesticida; e B anthracis, agente etiológico do antraz Embora apresentem fenótipos diferentes, essas espécies são próximas geneticamente e seus principais fatores de virulência são codificados por plasmídeos O ciclo infeccioso de B thuringiensis na larva de inseto é regulado pela ativação consecutiva de sistemas de quorum sensing da família RNPP Dentre eles, o sistema Rap-Phr foi amplamente estudado em B subtilis, porém apenas pontualmente explorado nas espécies do grupo B cereus Os sistemas Rap-Phr regulam vários processos fisiológicos bacterianos, inclusive a esporulação O objetivo deste estudo foi analisar os sistemas Rap-Phr no grupo B cereus, com intuito de conhecer sua distribuição, localização e diversidade a fim de obter um panorama desses sistemas neste grupo Além disso, o possível envolvimento desses sistemas no controle do processo de esporulação foi predito com base nos dados estruturais descritos para RapH de B subtilis Genes rap, sempre associados a um gene phr, estão presentes em todas as 49 linhagens estudadas com uma média de seis alelos rap-phr por linhagem e 3% dos sistemas estão localizados em plasmídeos As linhagens de B thuringiensis possuem seis vezes mais sistemas Rap-Phr plasmidiais do que as linhagens de B cereus Ademais, linhagens filogeneticamente próximas apresentam um perfil similar de genes rap-phr Um terço das proteínas Rap foram preditas como inibidoras da esporulação e estas proteínas estão preferencialmente localizadas em plasmídeos e, portanto, em linhagens de B thuringiensis A predição foi parcialmente validada por ensaios de esporulação sugerindo que os resíduos identificados pelo envolvimento na atividade de fosfatase em B subtilis são conservados no grupo B cereus, porém não são suficientes para predizer a função sobre a esporulação Em seguida, o sistema Rap63-Phr63 codificado pelo plasmídeo pAW63 da linhagem B thuringiensis HD73 foi caracterizado A proteína Rap inibe moderadamente a esporulação e retarda a expressão de genes regulados por SpoA Rap63 é inibida por seu peptídeo cognato Phr63, cuja forma madura corresponde à extremidade carboxi-terminal do pro-peptídeo Ensaios de esporulação em larvas de inseto sugerem uma atividade sinérgica dos sistemas Rap63-Phr63 e Rap8-Phr8 (do plasmídeo pHT8_1 da linhagem B thuringiensis HD73) sobre a esporulação Apesar da similaridade entre Phr63 e Phr8 não foi observado cross-talk entre os dois sistemas, confirmando sua especificidade Desta forma, o conjunto dos resultados demonstra a grande diversidade dos sistemas Rap-Phr no grupo B cereus e destaca o impacto de sistemas plasmidiais no desenvolvimento destas bactérias Consequentemente, reforça a importância dos plasmídeos na adaptação e sobrevivência dessas espécies, particularmente em B thuringiensis
Caracterização molecular, metabólica, fisiológica e agronômica de plantas de soja geneticamente modificadas com os fatores de transcrição GmDREB2AFL e GmDREB2ACA sob condição de déficit hídrico
Marinho, Juliane Prela; Nepomuceno, Alexandre Lima [Orientador]; Mertz-Henning, Liliane Marcia; Melo, Carlos Lásaro Pereira de; Cardoso, Larissa Alexandra; Brito Junior, Salvador Lima; Marcolino-Gomes, Juliana [Coorientadora]
Resumo: O cultivo de soja é de extrema importância para economia agroindustrial no mundo inteiro Atualmente, condições de estresses abióticos, como a seca, têm afetado negativamente a sobrevivência, crescimento e produtividade deste grão A tolerância à seca é um mecanismo complexo, envolvendo modificações fisiológicas e moleculares que atuam na percepção e resposta da planta à condição ambiental adversa Alguns genes têm sido descritos como importantes reguladores transcricionais das respostas a esse estresse O grupo de proteínas Dehydration Responsive Element Binding Proteins 2 (DREB2) inclui fatores de transcrição que contribuem para tolerância à seca ativando a transcrição de genes que contém o elemento cis DRE em resposta a esses estímulos de estresse Dois modos de regulação, transcrição e pós-tradução são importantes para a ativação da expressão gênica por DREB2A em Arabidopsis A função básica e a maquinaria reguladora do DREB2 são conservadas entre Arabidopsis e soja Construções contendo GmDREB2AFL (Glyma14g68) e também sua forma ativa GmDREB2ACA foram previamente estudadas em Arabidopsis No presente estudo, objetivou-se caracterizar as respostas moleculares, metabólicas, fisiológicas e agronômicas de plantas de soja geneticamente modificadas com GmDREB2AFL e GmDREB2ACA sob condições de déficit hídrico Os resultados mostraram que plântulas do evento GmDREB2AFL obtiveram melhor desempenho sob estresse osmótico na germinação Além disso, os eventos transgênicos GmDREB2AFL e GmDREB2ACA-1 apresentaram melhor performance em experimentos de tolerância ao déficit hídrico no período vegetativo Sugere-se que o desempenho superior nesses eventos tenha ocorrido em função de maiores taxas nos parâmetros fisiológicos observados durante o período vegetativo, assim como de maiores níveis de transcritos de genes estresse-induzidos tais como LEA2, LEA6 e HSP7 presentes nas plantas desses eventos submetidas ao estresse Quando o déficit hídrico foi imposto no período reprodutivo, observou-se que o evento GM GmDREB2AFL apresentou maior rendimento quando comparado aos demais Os resultados da análise metabólica também indicaram que as plantas dos eventos GmDREB2AFL e GmDREB2ACA-1 possuíram diferentes ajustes metabólicos em relação a cultivar não transformada o que em parte pode ter contribuído para superioridade destes eventos Portanto, todos estes resultados demonstram que o fator de transcrição GmDREB2A participa de respostas importantes ao déficit hídrico, em diferentes períodos de desenvolvimento da soja (germinativo, vegetativo e reprodutivo)
Filogeografia, padrões demográficos históricos e diversidade genética de abelhas Euglossini, com ênfase em espécies da Mata Atlântica
Silva, Wilson Frantine da; Sofia, Silvia Helena [Orientador]; Miyaki, Cristina Yumi; Melo, Gabriel Augusto Rodrigues de; Souza-Shibatta, Lenice; Ferreira, Dhiego Gomes
Resumo: A tribo Euglossini compreende um grupo de abelhas neotropicais de cerca de 24 espécies as quais apresentam complexas histórias biológicas pouco exploradas do ponto de vista biogeográfico e filogeográfico Devido uma gama de comportamentos e outras peculiaridades, estas abelhas apresentam uma intrínseca relação com seus ambientes, de modo que suas histórias biológicas são reflexo da própria história de seus respectivos habitats Amplamente distribuídas nas florestas úmidas americanas, as abelhas das orquídeas, como são popularmente conhecidas, apresentam altas taxas de endemismo na Mata Atlântica, onde quase 5% das espécies documentadas são endêmicas a este ambiente Dentre muitos fatores por trás dos processos geradores de diversidade, mudanças climáticas ao longo do Pleistoceno, movimentos neotectônicos e barreiras geológicas, são frequentemente apontadas como os principais agentes históricos por trás da megadiversidade deste bioma No presente estudo, diferentes espécies de abelhas da tribo Euglossini são utilizadas como modelo para investigar os processos por trás da diversificação destas abelhas ao longo das florestas tropicais americanas, com ênfase na Mata Atlântica Para tanto, três espécies e grupos de espécies do gênero Euglossa correspondendo à diferentes modelos distribucionais (E annectans, E iopoecila, e cinco espécies do subgênero Glossurella, grupo crassipunctata) foram selecionados para inferir sobre processos em diferentes escalas latitudinais, longitudinais e temporais Técnicas baseadas em sequenciamento de genes mitocondriais, genotipagem de locos microssatélites e sequenciamento paralelo massivo foram utilizados em associação à modelagem de nicho ecológico e distribuição de espécies para avaliar aspectos genéticos populacionais, filogenéticos e filogeográficos, bem como sua congruência com padrões climáticos atuais e pretéritos, eventos geológicos e neotectonismos Os resultados encontrados apontam que flutuações climáticas foram determinantes para definição da estrutura populacional das espécies de Euglossini na Mata Atlântica, porém os efeitos destes eventos dependem fortemente das idiossincrasias associadas à aspectos ecológicos de cada espécie De acordo com os resultados, espécies associadas às Florestas Estacionais Semideciduais tenderam a migrar parte de suas populações para o interior, se afastando da região litorânea ao longo dos picos glaciares do Pleistoceno Por outro lado, espécies com ampla distribuição latitudinal associadas à Floresta Ombrófila Densa se encaixam nas expectativas da interpretação atual dos refúgios para a Mata Atlântica Os modelos de nicho para as abelhas das orquídeas aqui estudadas apontam de forma recorrente a existência de áreas adequáveis na porção sul da Mata Atlântica no último máximo glacial (21 Ka a p) A cronologia da diversificação filogenética das espécies do grupo crassipunctata indica o aumento da atividade orogênica nos Andes à ~5-6 Ma a p como fator determinante para o surgimento de quatro das seis espécies atuais, e que as flutuações climáticas do Pleistoceno apenas influenciaram a separação entre o clado amazônico e atlântico Os resultados do presente estudo são inéditos e agregam uma importante contribuição para o entendimento dos padrões e processos geradores de diversidade na tribo Euglossini, bem como, na Mata Atlântica
Estudo comparativo do perfil de mRNAs e miRNAs relacionados com câncer de próstata entre indivíduos controles e portadores desta neoplasia
Souza, Marilesia Ferreira de; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Orientador]; Ribeiro, Enilze Maria de Souza Fonseca; Pereira, Tiago Campos; Rodrigues, Marco Aurélio de Freitas; Losi-Guembarovski, Roberta
Resumo: O câncer de próstata (CaP) é o segundo tipo de neoplasia mais incidente no mundo As dificuldades para realização da triagem, assim como a identificação de pacientes com doença agressiva ainda são desafios a serem solucionados Esta é considerada uma doença heterogênea e, portanto, estudos que visem compreender melhor seu desenvolvimento e progressão são importantes Os ácidos nucleicos circulantes têm se destacado por sua possível utilização como “biópsia líquida”, ou seja, como marcadores tumorais minimamente invasivos Sendo assim, este estudo teve como objetivo buscar marcadores baseados em mRNAs e miRNAs circulantes com fins diagnósticos, prognósticos e terapêuticos para CaP, assim como, analisar os efeitos de miRNAs no comportamento de células tumorais de próstata in vitro Foi conduzida uma análise a partir dos dados do TCGA (The Cancer Genome Atlas) a fim de definir genes e miRNAs candidatos Onze genes e dez miRNAs foram avaliados em amostras de plasma de pacientes com CaP virgens de tratamento e de indivíduos controles Dois genes, OR51E2 e SIM2 mostraram-se mais expressos em pacientes quando comparados aos controles e, também, em paciente com antígeno prostático específico (PSA) = 4, ng/mL quando comparados com controles com os mesmos níveis de PSA O miR-2c mostrou-se mais expresso e o miR-2b apresentou menor nível de expressão nos pacientes A associação destes dois gene e dois miRNAs apresentou 67% de sensibilidade e 75% de especificidade para distinguir pacientes de controles (AUC = ,71) A análise de predição de agressividade da doença identificou os genes AMACR, BCL2, GOLM1 TRPM8 e NKX3-1 Destes genes, NKX3-1, TRPM8 e GOLM1, quando combinados, foram capazes de identificar corretamente 71,2% das amostras e quando associados com práticas clínicas já utilizadas, como escore de Gleason da biópsia (= 8) e níveis de PSA (> 2 ng/mL), mostraram sensibilidade de 88% e especificidade de 58% para identificar pacientes de alto risco para doença agressiva Dentre os miRNAs avaliados, dois se destacaram e foram selecionados para as análises funcionais O miR-182 mostrou associação com bilateralidade do tumor Sua superexpressão in vitro foi relacionada com o aumento da proliferação celular, de migração celular, níveis elevados de marcadores de transição epitélio-mesenquimal (EMT) e p-AKT, além de resistência ao docetaxel, indicando que a desregulação deste miRNA é um fator importante para o desenvolvimento do CaP Já o miR-141 apresentou níveis elevados de expressão em pacientes com metástase óssea, PSA > 1 ng/mL e doença de alto risco As análises in vitro demostraram que, no CaP, desempenha função dupla, como oncogene e supressor de tumor, dependendo do contexto celular Também foi demostrado que a inibição deste miRNA está relacionada com resistência a quimioterápicos Assim, o presente estudo demonstrou que mRNAs e miRNAs circulantes podem ser bons marcadores para diagnóstico e prognóstico de CaP e os miR-182 e miR -141 possuem importante papel na modulação das células da próstata e na resistência a quimioterápicos
A Piperlongumina induz aumento de EROs, causando danos ao DNA, parada de ciclo celular e apoptose em células tumorais e não tumorais de mama e pulmão
Baranoski, Adrivanio; Mantovani, Mário Sérgio [Orientador]; Vicentini, Verônica Elisa Pimenta; Maistro, Edson Luís; Sartori, Daniele; Lepri, Sandra Regina
Resumo: As plantas são fontes de diversas moléculas que apresentam propriedades terapêuticas e destacam-se na busca por drogas quimioterápicas alvo-especificas e/ou seletivas A Piperlongumina (PLN), um alcaloide derivado da Piper longum Linn, apresenta importantes propriedades biológicas, entre elas, a seletividade antiproliferativa para células tumorais Neste trabalho, avaliou-se diferentes parâmetros como a citotoxicidade, danos a membrana celular, interferência na cinética de proliferação e ciclo celular, indução de apoptose, danos ao DNA, capacidade de gerar estresse oxidativo e o padrão de expressão de mRNA e proteínas relacionados a esses processos em células não tumorais e tumorais de mama (HB4a e MCF-7) e pulmão humano (IMR-9 e NCI-H46), também foram avaliados a capacidade de PLN e ela combinada com Olaparib (inibidor de PARP) em gerar quebras de fita dupla no DNA, além de seus mecanismos de ação em linhagens tumorais de pulmão P53 positiva e negativa A PLN apresentou citotoxicidade para todas as linhagens com concentrações e tempos distintos Induziu danos a membrana celular e reduziu a proliferação celular em todas as linhagens estudadas, com efeitos mais pronunciados em células não tumorais e P53 negativas Ocasionou retenção de ciclo celular na fase G2/M em todas as linhagens excetuando-se a linhagem não tumoral de pulmão, na qual observamos retenção em G1 Além disso, induziu estresse oxidativo nas linhagens de mama, IMR-9 e NCI-H46, danos ao DNA e apoptose, sendo o estresse oxidativo a possível causa dos danos encontrados nas linhagens de pulmão A549 (p53 +/+) e H1299 (p53 -/-) Em linhagens de mama, a PLN induziu aumento de expressão de mRNA relacionados a apoptose, danos ao DNA e estresse oxidativo e diminuiu a expressão de mRNA de genes relacionados ao ciclo celular e do gene TP53, não havendo mudança na quantidade desta proteína após 24 h na linhagem HB4a e ativação na linhagem MCF-7 Em nível proteico, a PLN induziu redução das proteínas Catalase, TRx1, PRx1 e ATR e aumento de p21 nestas linhagens, em MCF-7, as proteínas Chk1 e p53 apresentaram redução e aumento de regulação respectivamente A ação antiproliferativa apresentada em ambas linhagens, principalmente HB4a, se deve pela capacidade de PLN em causar inibição de proteínas relacionadas a proteção contra estresse oxidativo, levando a geração de danos ao DNA, inibindo o ciclo celular Nas linhagens de pulmão IMR-9, vários genes relacionados ao ciclo celular tiveram expressão reduzidas assim como TP53, nesta linha, a retenção de ciclo foi mediada pelo gene CDKN1B, um precursor da proteína p27 que controla a progressão do ciclo celular na fase G1 Em IMR-9 também encontramos a proteína SOD2 aumentada além de redução em TRx1 Desta maneira, as mudanças nos padrões de índice celular observados foram atribuíveis à prisão do ciclo celular e apoptose devido ao aumento do estresse oxidativo e danos no DNA Foi evidenciado que a PLN causa quebras de fita dupla, principalmente em células P53 negativas suplementadas com 1% de soro bovino fetal (SBF), ao mesmo tempo, observamos que a PLN potencializou sua ação com o Olaparib, provavelmente devido a capacidade de suprimir mecanismos da recombinação homologa Estes resultados nos chama a atenção para os efeitos colaterais que a PLN pode causar nas células não tumorais, principalmente in vivo, visto que é descrita em muitos artigos como seletiva para células tumorais
Estudos em transplantados renais : avaliação da instabilidade genômica, expressão gênica e análise de variantes polimórficas associadas ao risco de rejeição do enxerto e ao desenvolvimento de câncer
Cilião, Heloísa Lizotti; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Orientador]; Tavares, Denise Crispim; Oliveira, Jaqueline Carvalho de; Sartori, Daniele; Serpeloni, Juliana Mara
Resumo: O transplante renal é a melhor opção terapêutica para pacientes com doença renal crônica Após a realização do transplante, é necessário o uso constante de drogas imunossupressoras para evitar a rejeição do enxerto Porém, o uso prolongado destes medicamentos acarreta alguns efeitos adversos Entre os pacientes transplantados é observada uma grande variabilidade da concentração plasmática dos imunossupressores, o que se deve à influência de diversos fatores, entre eles, a presença de variantes alélicas que pode levar a respostas distintas ao tratamento Os objetivos do presente estudo foram estudar pacientes transplantados renais para: (i) avaliar se o uso prolongado de imunossupressores pode induzir efeitos mutagênicos; (ii) associar a presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes do metabolismo, transporte de drogas e sistema imunológico com a ocorrência de episódios de rejeição; (iii) associar SNPs com a concentração plasmática de tacrolimo; (iv) avaliar se a presença de SNPs em genes de reparo e sistema imunológico está associada com a ocorrência de câncer Os resultados obtidos não demonstraram associação entre a frequência de micronúcleos em linfócitos com o tempo decorrido após o transplante Por outro lado, os danos observados no ensaio do cometa aumentaram com o tempo de imunossupressão Na análise de associação dos SNPs com episódios de rejeição em 246 pacientes foi observada associação de SNPs em genes do metabolismo rs766229 (UGT2B7) com proteção (1,85 vezes) e rs6714486 (UGT1A9) com aumento de risco de rejeição de 1,6 vezes Entre os genes de transportadores de drogas, apenas o rs2231142 (ABCG2) demonstrou diminuição em 1,92 vezes no risco de rejeição O rs1889677 do gene do sistema imune IL-23R foi associado com o aumento de 1,9 vezes no risco de rejeição do enxerto Entre os pacientes, 145 faziam uso do imunossupressor micofenolato de mofetil (MMF) Foram avaliados neste grupo SNPs em genes que influenciam a farmacocinética deste medicamento e observou-se associação do rs117652 (IMPDH2) com proteção de 4,2 vezes, e do rs7438135 (UGT2B7) com proteção de 2,4 vezes contra episódios de rejeição O rs224149 (CES2) foi associado com o aumento de risco à rejeição de 7,2 vezes Dos 246 pacientes avaliados 1,2 % desenvolveram câncer após 15±8,9 anos de transplante, sendo que destes, 68% eram constituídos por carcinoma de pele não melanoma O rs18872 (IL-1) foi associado com o risco de 3,5 vezes de desenvolver câncer Foi avaliada a associação de 11 SNPs em genes do metabolismo e transporte de drogas com a concentração plasmática de tacrolimo em 55 pacientes transplantados renais que faziam uso, nos três primeiros meses de transplante, deste medicamento associado com MMF e corticóide, sendo observado que apenas os SNPs rs4646437 (CYP3A4) e rs776746 (CYP3A5) influenciaram a farmacocinética deste imunossupressor Este estudo demonstrou que os pacientes tranplantados renais apresentam maior quantidade de dano no material genético em comparação com controles saudáveis e que o uso prolongado dos medicamentos imunossupressores pode induzir instabilidade genética Os SNPs nos genes UGT2B7, UGT1A9, ABCG2, IL-23R, IMPDH2 e CES2 podem ser usados como marcadores candidatos para a triagem do risco de rejeição e o SNP no gene IL-1 pode ser utilizado para a triagem do risco de desenvolvimento de câncer em pacientes transplantados renais Também foi confirmado o impacto dos SNPs rs4646437 (CYP3A4), rs776746 (CYP3A5) na farmacocinética do imunossupressor tacrolimo
Marcadores moleculares para detecção de espécies de Aspergillus produtoras de aflatoxinas, ocratoxinas e fumonisinas
Massi, Fernanda Pelisson; Fungaro, Maria Helena Pelegrinelli [Orientador]; Taniwaki, Marta Hiromi; Furlaneto-Maia, Luciana; Sartori, Daniele; Hirooka, Elisa Yoko
Resumo: Produtos destinados ao consumo humano e animal podem apresentar-se contaminados com micotoxinas, destacam-se as aflatoxinas, ocratoxinas e fumonisinas produzidas por espécies de fungos do gênero Aspergillus Atualmente, detectar e identificar espécies micotoxigênicas é crucial para garantir a qualidade do alimento Neste âmbito, as informações presentes nas sequências de nucleotídeos de alguns loci do genoma fúngico, têm contribuído para o desenvolvimento de marcadores moleculares utilizados para a identificação de espécies toxigênicas, eliminando a necessidade de cultivo O objetivo deste trabalho foi desenvolver e utilizar marcadores moleculares para detectar espécies de Aspergillus produtoras de micotoxinas Os resultados obtidos são apresentados na forma de três artigos científicos O primeiro artigo apresenta o desenvolvimento de um marcador molecular para detecção da espécie aflatoxigênica Aspergillus nomius Esta espécie pertence à Aspergillus section Flavi e tem sido descrita como uma das principais responsáveis pela contaminação de castanha do Brasil com aflatoxinas O par de primer espécie-específico foi desenvolvido para detectar a presença de A nomius em visitantes florais da castanheira (Bertholletia excelsa), trazendo à luz uma possível via de contaminação da castanha A nomius foi detectado em Xylocopa frontalis, Bombus transversalis, Centris denudans, Centris ferruginea e Epicharis flava No segundo trabalho foi desenvolvido um sistema de PCR multiplex para analisar uma grande coleção de isolados de Aspergillus niger e Aspergillus welwitschiae quanto à presença ou ausência de genes essenciais para a biossíntese da ocratoxina e fumonisina Ambas espécies pertencem à Aspergillus section Nigri e são frequentemente encontradas em alimentos Isolados destas espécies podem produzir ocratoxina A (OTA) e/ou fumonisina B2 (FB2) Um total de 175 linhagens foram obtidas de frutas secas, castanha do Brasil, grãos de café, frutos de uva, cacau e cebola e investigadas Entre os isolados de A niger, aproximadamente 32% foram produtores de OTA; em contraste, apenas 1% dos isolados de A welwitschiae foram capazes de produzir OTA Em relação a produção de FB2, houve maior frequência dos isolados de A niger (74%) serem capazes de produzir FB2 quando comparados com A welwitschiae (34%) O uso da PCR multiplex revelou que a frequência dos isolados contendo os genes essenciais de biossíntese de micotoxinas também é marcadamente diferente entre A niger e A welwitschiae Todos os isolados de A niger e A welwitschiae produtores de OTA portavam os genes radH e pks no genoma e 95,2% dos isolados não-produtores de OTA não continham esses genes Isto sugere que a incapacidade de produção de OTA está associada à deleção de genes do cluster de biossíntese da OTA Sobre o gene relacionado à produção de fumonisinas, a-oxoamina sintase (fum8), observou-se que 1% dos isolados de A niger e 36% dos isolados de A welwitschiae o possuem no genoma A incapacidade de produção de FB2 em A welwitschiae está associada a deleções de genes do cluster de biossíntese de fumonisina Porém, esta associação não ocorre para a espécie A niger No terceiro trabalho foi investigada a incidência de Aspergillus section Nigri em cebolas adquiridas mensalmente em supermercados, em um período de dois anos Foi analisado por meio da PCR multiplex isolados das espécies A niger/A welwitschiae a fim de separar linhagens destas espécies das outras linhagens de black aspergilli não produtoras de micotoxinas, além de detectar genes envolvidos com a biossíntese de OTA e FB2 Aspergillus section Nigri foi detectado em 98% das amostras, e 97,4% dos isolados foram pertencentes às espécies toxigênicas A niger ou A welwitschiae Outras espécies encontradas em menor frequência foram A brasiliensis, A japonicus, A tubingensis, A luchuensis, A neoniger e A heteromorphus Aproximadamente 36% dos isolados identificados como A niger ou A welwitschiae foram portadores do gene fum8, envolvido na biossíntese de FB2 Aproximadamente 3% dos isolados foram portadores dos genes radH e pks, ambos envolvidos na biossíntese de OTA A welwitschiae é a principal espécie encontrada em cebolas na pós-colheita contemplando linhagens portadoras de genes essenciais para a biossíntese de micotoxinas Conclui-se que marcadores moleculares podem ser eficientemente utilizados para identificação e/ou detecção de espécies de Aspergillus, bem como para a avaliação da capacidade de risco de linhagens tóxicas pertencentes ao gênero Aspergillus
Análise da diversidade genética, fenotípica e mapeamento por associação em um painel de C. arabica, incluindo acessos do centro de origem
Silva, Bruna Silvestre Rodrigues da; Pereira, Luiz Filipe Protasio [Orientador]; Marcelino-Guimarães, Francismar Corrêa; Gonçalves, Leandro Simões Azeredo; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Sant’Ana, Gustavo César; Micheletti, Diego [Coorientador]
Resumo: A exploração da diversidade genética e fenotípica dos acessos do centro de origem de uma espécie é fundamental para estimar o potencial ganho genético e efetiva conservação de seus recursos genéticos Coffea arabica é uma espécie recente e com pouca variabilidade genética, o que torna mais importante a caracterização destes materiais do centro de origem para busca de genótipos com características que possam ser incorporadas pelos programas de melhoramento O objetivo deste trabalho foi analisar a diversidade e estrutura genética com base nos marcadores SSRs e SNPs de cafeeiros provenientes da Etiópia, como também fenotipar e realizar estudos de associação para características relacionadas à qualidade bioquímica dos grãos Para o estudo de diversidade genética de C arabica com base nos SSRs, 37 genótipos incluindo acessos da Etiópia, cultivares tradicionais e variedades, e seus dois parentais, C canephora e C eugenioides foram genotipados com 3 marcadores SSRs Um total de 26 alelos foram polimórficos e vinte desses, com conteúdo de informação polimórfica (PIC) acima de 7 As estimativas de diversidade genética como a média da heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade corrigida pelo tamanho amostral (uHe) e proporção de loci polimórficos (P%) demonstraram alta diversidade genética entre os acessos do lado Oeste do Vale do Rift em relação aos outros grupos genéticos estudados, como também 34 alelos privados foram observados nesse grupo Duas subpopulações foram identificadas pelo estudo de estrutura populacional e Análise de Coordenadas Principais, uma correspondente aos acessos da Etiópia e o outro correspondente às cultivares tradicionais e variedades A comparação da dissimilaridade genética entre os acessos de C arabica com seus dois parentais diplóides demonstrou que as cultivares em estudo são geneticamente mais próximas de C eugenioides do que os acessos etíopes Todo o painel apresentou alta variabilidade quanto aos 8 compostos analisados por espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS) Significativas correlações positivas entre ácidos clorogênicos (ACGs) e Lipídeos Totais (LT), Poteínas Totais (PT), Sacarose e Açúcares Totais (AT) bem como Cafeína e PT; Sacarose e AT; e LT e Caveol foram observadas Significativa correlação negativa foi encontrada entre LT e Sacarose/AT e entre Cafestol e Caveol A análise de agrupamento hierárquico identificou 3 grupos entre os acessos com características a serem exploradas para a qualidade da bebida e/ou para a produção de cafés com teores diferenciados de diterpenos Maior diversidade fenotípica foi observada entre os acessos do lado Oeste do Vale do Rift Foi realizada genotipagem por sequenciamento (GBS) de 159 genótipos incluindo acessos da histórica coleção Etíope da FAO, além de cultivares tradicionais e variedades de C arabica e os dois parentais diploides da espécie O Pipeline TASSEL-GBS foi realizado afim de montar os contigs, mapeá-los e identificar marcadores SNPs de C arabica nos dois parentais diploides da espécie (C canephora e C eugenioides) Foram identificados um total de 1719 e 2949 SNPs em ambos subgenomas com uma cobertura média de 68X e 47X que subdividiu os genótipos em 2 e 3 subpopulações Para investigar as variações genotípicas subjacentes aos traços relacionados com a qualidade da bebida, GWAS foi realizado para identificar variantes SNPs e genes candidatos nos acessos de C arabica da Etiópia com um total de 4517 SNPs e 11 genótipos para 5 replicatas de fenotipagem (ano 211, 212, 215, 216 e média 211/215) e 8 modelos de associação Um total de 33 SNPs de C arabica foram significativamente associados aos compostos relacionados com a qualidade da bebida de café em ambos subgenomas Dos 22 SNPs mapeados em C canephora e significativamente associados, 17 são co-localizados a 13 genes candidatos envolvidos nas vias metabólicas dos compostos bioquímicos Onze SNPs de C arabica mapeados em C eugenioides foram significativamente associados aos compostos bioquímicos Nossos resultados confirmam que há uma grande riqueza alélica e fenotípica presente nos acessos da Etiópia, especialmente nos acessos originados de florestas do lado Oeste do grande Vale do Rift, ainda não explorados pelo melhoramento genético Por fim, identificamos SNPs associados às caracteristicas fenotípicas que podem ser úteis no desenvolvimento de estratégias de seleção assistida objetivando melhorar a qualidade bioquímica de grãos de café verde, e genes candidatos para o melhoramento da qualidade da bebida de café
Diversidade e relações filogenéticas de Aspergillus section Nigri isolados de produtos agrícolas
Silva, Josué José da; Fungaro, Maria Helena Pelegrinelli [Orientador]; Vieira, Maria Lúcia Carneiro; Glienke, Chirlei; Ono, Elisabete Yurie Sataque; Ferreira, Dhiego Gomes
Resumo: Aspergillus section Nigri é um importante grupo de fungos que abriga espécies toxigênicas, fitopatogênicas, bem como, espécies de interesse biotecnológico A presença de algumas espécies de A section Nigri em alimentos é tida como sinal de alerta devido à possibilidade de contaminação com micotoxinas Dessa forma, o conhecimento da diversidade de espécies de A section Nigri em alimentos produzidos no Brasil é uma agenda estratégica nas esferas científica, econômica e sanitária O objetivo deste estudo foi investigar a diversidade de A section Nigri isolados de 5 produtos agrícolas produzidos no país (grãos de café, bagas de uvas, bulbos de cebola, erva-mate e castanha-do-brasil) Os resultados obtidos são apresentados na forma de dois artigos científicos O primeiro artigo relata a diversidade de Aspergillus e a produção de ocratoxina A (OTA), fumonisina B2 e aflatoxinas (séries B e G) de isolados de erva-mate (elaborada para chimarrão) A contaminação fúngica variou de ,2 x 13 a 1,55 x 14 UFC/g, sendo que A section Nigri foi o grupo taxonômico predominante constituindo cerca de 8% da incidência fúngica total A análise molecular com base nos genes CaM ou BenA permitiu identificar 13 espécies de Aspergillus, sendo A luchuensis a espécie predominante Espécies potencialmente toxigênicas, tais como A niger, A welwitschiae, A novoparasiticus e A flavus foram encontradas em baixa frequência, cerca de metade dos isolados analisados (47%) foram capazes de produzir alguma das micotoxinas (OTA, FB2, AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), sendo as aflatoxinas do tipo B a classe de micotoxinas que apresentou o maior número de isolados produtores A ocorrência de A pallidofulvus, A europaeus e A novoparasiticus foi descrita pela primeira vez em ervas O segundo artigo investigou a diversidade genética de linhagens do clado A niger Dois conjuntos de dados, um proveniente de isolados de produtos agrícolas (n= 43) e outro do GenBank (n= 292), foram analisados filogeneticamente com base no gene CaM Os dois conjuntos de dados foram submetidos a análises de haplótipos, Median-joining network, máxima verossimilhança e de parâmetros descritivos tais como diversidade haplotípica e nucleotídica Um total de 31 haplótipos foi identificado, 17 desses pertenciam indubitavelmente à espécie A welwitschiae, 8 à espécie A niger e os demais haplótipos não tiveram uma identificação conclusiva Representantes dos haplótipos presentes no conjunto de dados brasileiro foram submetidos a análises morfológicas, fisiológicas, e filogenéticas com base em três loci (BenA, CaM e RPB2), conforme preconiza a taxonomia polifásica de Aspergillus As análises filogenéticas foram fortalecidas pelo Reconhecimento de Espécie Filogenéticas por Concordância Genealógica (GCPSR) e pela análise de estruturação genética usando marcadores de RAPD Com base no conceito de espécie pluralista, dentre 4 espécies filogenéticas reconhecidas, uma delas foi validada como uma nova espécie pertencente ao clado A niger Essa nova espécie será descrita como Aspergillus paraniger
Análise do transcriptoma de cultivares de soja com níveis de tolerância contrastantes em condições de estresse por déficit hídrico
Reis, Rafaela Ribeiro; Nepomuceno, Alexandre Lima [Orientador]; Fuganti-Pagliarini, Renata; Vanzela, André Luís Laforga; Rincão, Michele Pires; Moreira, Renata Stolf; Henning, Liliane Marcia Mertz [Coorientadora]
Resumo: A soja, será fortemente afetada pela mudança climática, que projeta uma contenção de área plantada de 41%, em todo o país para 27 Dentre os estresses abióticos, o déficit hídrico é o principal fator que leva a perdas de rendimento em importantes culturas O desenvolvimento de materiais tolerantes ao déficit hídrico é significativamente vantajoso em áreas sujeitas à ocorrência do estresse Recentemente, alguns avanços foram obtidos na identificação de genes responsivos ao déficit hídrico, potencialmente capazes de aumentar a tolerância das plantas em condições de restrição hídrica Compreender os mecanismos moleculares na resposta ao déficit hídrico é importante na definição de estratégias biotecnológicas e de melhoramento As tecnologias genômicas, como o RNA-seq são ferramentas úteis para essa finalidade, podendo oferecer um melhor entendimento sobre os mecanismos ativados pelas plantas em resposta ao estresse Objetivou-se avaliar o transcriptoma de duas cultivares de soja contrastantes na resposta de tolerância ao déficit hídrico, BR 16 (sensível) e Embrapa 48 (tolerante), em folhas e raízes submetidas a dois níveis de déficit hídrico (moderado e severo) Genes diferencialmente expressos, foram identificados e categorizados, sendo alguns selecionados para validação via RT-qPCR Duas importantes famílias de fatores de transcrição (AP2/EREBP e WRKY) foram selecionadas para melhor entendimento de seus mecanismos de resposta e oscilações da expressão gênica em resposta ao déficit hídrico Foram detectadas diferenças nos perfis de expressão entre os materiais avaliados, sendo possível inferir que a cultivar Embrapa 48 responde mais rapidamente ao estresse do que a cultivar BR 16, apresentando maior número de genes diferencialmente expressos (up-regulados) já no primeiro nível (moderado) de estresse, enquanto BR 16 exibiu um perfil de expressão predominantemente down-regulado no mesmo período Esse comportamento persiste em todas as classes de genes relatados, sendo ainda mais evidente nas folhas, reforçando a ideia de que a resposta sob a influência do estresse ocorre especialmente nas folhas para ambas as cultivares Os resultados mostram, que a cultivar Embrapa 48 além de exibir uma modulação gênica inicial mais acelerada, ainda mantém genes associados aos processos de desenvolvimento, inerente ao metabolismo primário, ativo por mais tempo Adicionalmente, foram identificados e selecionados os 1 principais genes de cada uma das famílias de fatores de transcrição (AP2/EREBP e WRKY) na resposta de tolerância ao déficit hídrico
Fenotipagem bioquímica e estudos de associação genômica ampla em uma coleção de Coffea arabica
Ferreira, Rafaelle Vecchia; Pereira, Luiz Filipe Protasio [Orientador]; Padilha, Lilian; Sant’Ana, Gustavo César; Gonçalves, Leandro Simões Azeredo; Scholz, Maria Brígida dos Santos
Resumo: O Brasil ocupa a posição de maior produtor de café do mundo Essa liderança mundial é resultado, em parte, dos esforços desenvolvidos pela pesquisa brasileira para colocar à disposição dos agricultores, cultivares com altas capacidades produtivas O melhoramento tradicional do cafeeiro tem mostrado resultados expressivos, entretanto, sua eficiência é restringida devido às características botânicas do gênero Coffea e à complexidade das características alvo da seleção como qualidade da bebida Coffea arabica apresenta maior importância econômica e apesar dessa espécie apresentar baixa diversidade genética dentre os genótipos cultivados, uma variabilidade genética maior é encontrada em coleções provenientes do centro de origem, a Etiópia Neste trabalho, os genótipos de uma coleção C arabica originários da Etiópia foram submetidos a uma avaliação bioquímica pela metodologia da Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIRS), com o objetivo de explorar a composição química da espécie Nós avaliamos os teores de ácidos clorogênicos, cafeína, açúcares totais, sacarose, lipídios, proteínas e taninos de 66 genótipos, nos anos de 212 e 215 Essa avaliação confirmou a variabilidade genética existente nesse material e apresentou, nos dois anos analisados, um grupo de genótipos com baixos níveis de ácidos clorogênicos e cafeína, além de um teor maior de açúcar, podendo ser útil aos programas de melhoramento Ainda foi verificada a importância de uma coleta mais homogênea de frutos maduros, a fim de não haver diferenças entre os teores químicos avaliados no mesmo material em diferentes anos Visando à produção de ferramentas biotecnológicas que facilitem o melhoramento de cafeeiros, esses dados fenotípicos foram utilizados em estudos de associação com marcadores moleculares Marcadores SNPs foram identificados a partir da genotipagem por sequenciamento, utilizando como genoma de referência um dos ancestrais diploides de C arabica, o Coffea canephora Um total de 62192 tags produzidas pelos reads single-end, a partir das bibliotecas formadas pelo GBS, foi mapeado no genoma de referência identificando 6696 SNPs, com profundidade média de 39X Os SNPs foram filtrados para MAF >5, Call Rate >8 e heterozigosidade < 9, fornecendo 246 marcas que foram usados nas análises nas análises de associação da coleção da Etiópia do IAPAR A estratégia de GWAS pelo software TASSEL 522, em um conjunto de 66 genótipos de C arabica, foi utilizada para identificar marcas associadas aos conteúdos bioquímicos dos genótipos dessa coleção Foram encontrados 44 SNPs significativos associados a ácidos clorogênicos, cafeína, açúcares totais, sacarose, lipídios, proteínas e taninos Também foram identificadas marcas que estariam associadas às vias de ácidos clorogênicos, cafeína, lipídios, proteínas e sacarose, respon sáveis pela qualidade da bebida, dentro de uma coleção de genótipos com maior variabilidade genética
"Avaliação toxicogenética do exopolissacarídeo botriosferana secretado por Botryosphaeria rhodina MAMB-05"
Lima, Maressa Cristiane Malini de; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Orientador]; Kvitko, Katia; Spanó, Mário Antônio; Mantovani, Mário Sérgio; Serpeloni, Juliana Mara; Figueiredo, Suely Gomes de [Coorientadora]
Resumo: ß-glucanas fúngicas têm apresentado propriedades imunomoduladora e anticâncer O presente estudo avaliou os potenciais mutagênico, genotóxico, protetor e antioxidante de um exopolissacarídeo obtido do fungo Botryosphaeria rhodina MAMB-5, o botriosferana Também foram investigadas as possíveis alterações promovidas por este exopolissacarídeo na expressão gênica e cinética do ciclo celular A mutagenicidade foi avaliada em linhagens de Salmonella typhimurium Os demais ensaios foram realizados em culturas de linfócitos humanos normais e tumorais (células Jurkat) Em todas as condições avaliadas o botriosferana não foi mutagênico, genotóxico e não reduziu espécies reativas geradas por H2O2 Entretanto, protegeu o DNA de linfócitos normais e tumorais contra danos causados pelo metilmetanosulfonato em condição de pós-tratamento e tratamento simultâneo A citometria de fluxo detectou uma população de células Jurkat tetraplóides em fase G1 após tratamento com botriosferana associado à doxorrubicina Este efeito antiproliferativo pode estar associado à modulação negativa da expressão de genes envolvidos no checkpoint em G1 A repressão do gene CCR5 em linfócitos tumorais tratados com o botriosferana sozinho ou combinado com DXR indica uma possível afinidade do exopolissacarídeo com este receptor Portanto, o botriosferana parece estar envolvido no checkpoint da fase G1 do ciclo e possivelmente com a inibição da expressão do gene CCR5
"Análise da viabilidade celular, genotoxicidade e modulação da expressão gênica em células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) submetidas a tratamentos com metacrilatos e peróxido de hidrogênio utilizados na prática odontológica"
Bello, Valéria Aparecida; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Orientador]; Fernandes, Karen Barros Parron; Serpeloni, Juliana Mara; Losi-Guembarovski, Roberta; Paiva, Wagner José Martins; Poli-Frederico, Regina Célia [Coorientadora]
Resumo: O presente trabalho avaliou a toxicidade, genotoxicidade e modulação da expressão gênica dos trietilenoglicol metacrilato (TEGDMA), 2-hidroxietil metacrilato (HEMA), 2,2,2-trifluoroetil metacrilato (TFEMA) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em células de ovário de hamster Chinês (CHO-K1) No ensaio do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólico (MTT) foram avaliadas concentrações de 1 a 1 mM dos metacrilatos nos tempos de tratamento de 24, 48 e 72 horas, sendo escolhidas para serem avaliadas nos ensaios subsequentes, as concentrações de 1, 2 e 3 mM para o TEGDMA, 2, 4 e 6 mM para o HEMA e 1, 2 e 4 mM para o TFEMA Para o H2O2 foram testadas concentrações crescentes de ,5 a 5,5 mM nos tempos de tratamento de 1, 3, 6 e 12 horas Nos ensaios do cometa e da apoptose/necrose os metacrilatos e o H2O2 foram avaliados, respectivamente, nos tempos de 3 e 24 horas de tratamento As análises de expressão gênica foram realizadas por meio da técnica de RT-qPCR apenas na menor concentração para os metacrilatos e nas concentrações de 1,5 e 2,5 mM para o H2O2Os dados sem distribuição normal foram analisados por meio dos testes estatísticos Kruskal-Wallis/Dunn e análise de regressão não linear, enquanto que os dados com distribuição normal foram avaliados pelos testes ANOVA/Tukey Os dados da modulação da expressão gênica foram analisados estatisticamente pelo programa REST Os resultados obtidos nestes ensaios revelaram que todos os materiais avaliados reduziram a viabilidade celular, sendo que nos tratamentos com metacrilatos este efeito manifestou-se preferencialmente por meio da indução de apoptose em todas as concentrações avaliadas HEMA, TFEMA e H2O2 induziram aumento significativo de células necróticas nas maiores concentrações O H2O2 apresentou severo potencial genotóxico em todas as concentrações testadas, mas os metacrilatos foram genotóxicos apenas nas maiores concentrações As análises de expressão gênica não permitiram inferir seguramente sobre o envolvimento dos genes Tp53, Bax, Bcl-xL, Casp-8, Casp-9, Ercc1, Xpf e Top2 na toxicidade dos metacrilatos aqui avaliados Os metacrilatos modularam negativamente a expressão de alguns genes, TEGDMA modulou os genes Casp8, Tp53, Bax, Bcl-xL e Top2; HEMA modulou apenas o gene Tp53 e TFEMA interferiu negativamente no gene Top2 Entretanto, o H2O2 aumentou significativamente a expressão dos genes Tp53, Bax, Bcl-xL e Ercc1, sugerindo que a toxicidade deste composto seja dependente desses genes Nossos dados demonstraram que os materiais dentários avaliados apresentaram, nas condições deste estudo, um alto potencial tóxico, sugerindo que a utilização dos mesmos em produtos odontológicos deva ser mais cuidadosa e criteriosa
"Aplicação de marcadores cromossômicos e DNA barcoding para estudo da evolução cariotípica e resolução de conflitos taxonômicos em Doradidae (Pisces-Siluriformes)
Takagui, Fábio Hiroshi; Giuliano-Caetano, Lucia [Orientador]; Swarça, Ana Cláudia; Rubert, Marceléia; Vênere, Paulo Cesar; Lui, Roberto Laridondo; Almeida, Fernanda Simões de [Coorientadora]
Resumo: A família Doradidae é atualmente constituída por 95 espécies de peixes que ocorrem apenas em ecossistemas dulcícolas da América do Sul, sendo mais abundantes na bacia amazônica, onde desempenham papeis ecológicos fundamentais para a homeostasia do ecossistema Nas últimas décadas diversos estudos filogenéticos baseados em marcadores morfológicos e moleculares corroboraram o monofiletismo do grupo, entretanto algumas divergências permanecem, principalmente em alguns clados onde a abordagem taxonômica tradicional não foi suficiente para diagnostica-los Nesse sentido, o presente estudo busca resolver alguns desses problemas taxonômicos, utilizando marcadores citogenéticos associados ao DNA barcoding, assim como propor tendências sobre a evolução cariotípica em Doradidae Foram analisadas 15 espécies de thorny catfishes, provenientes de diferentes sistemas hidrográficos, os dados obtidos foram distribuídos em três capítulos, cada qual explorando a eficiência dos estudos cariotípicos para compreender questões biogeográficas, citotaxonômicas e evolutivas O capítulo 1 traz informações sobre as caracteríticas cariotípicas da subfamília Wertheimerinae: Wertheimeria maculata, Kalyptodoras bahiensis e Franciscodoras marmoratus As três espécies exibiram 2n=58 e a mesma fórmula cromossômica com diferenças apenas no padrão de distribuição dos DNAr e principalmente na disposição dos blocos heterocromáticos Tal variação microestrutural parece estar relacionada com a atividade saltatória de elementos transponíveis, dentre os quais o retrotransposon Rex3 merece destaque Também foi sugerida uma hipótese biogeográfica para explicar a diversificação cariotípica de Wertheimerinae, sendo essa baseada em eventos de captura de cabeçeira no Complexo do Espinhaço que proporcionou um dinâmico intercâmbio de ictiofauna entre o rio São Francsisco e a drenagem costeira do Leste O capítulo 2 trata de questões citaxonômicas, com ênfase no gênero Anadoras, que embora seja um dos mais amplamente distribuídos dentre aqueles alocados em Doradidae, possui apenas duas espécies formalmente descritas: Anadoras grypus e Anadoras weddellii, sendo que no presente estudo o status taxonômico de uma possível nova espécie endêmica do Alto rio Araguaia foi testado, utilizando marcadores citogenéticos e algoritmos de delimitação de espécies baseado no DNA barcoding Os dados cromossômicos foram eficientes somente para diferenciar A grypus de seus congeneres, evidenciando uma notável similaridade entre A weddelli e Anadoras sp “araguaia” Entretanto o DNA barcoding separou claramente as três espécies, identificando três unidades taxonômicas moleculares operacionais (MOTUs), com alto valor de divergência genética e suportadas pelas inferências Bayesianas,Verossimilhança e por todos os algorítmos de delimitação de espécies Foi observado também uma baixa distância genética entre populações de A weddelli do Alto, Médio rio Paraguai e Baixo amazonas, sugerindo uma baixa varibilidade entre populações distantes geograficamente Curiosamente, a distância intraespecífica observada em indivíduos de uma mesma população de A grypus foi maior do que aquela observada em populações de bacias distintas de A weddellii, no entanto o valor obtido não suporta a hipótese de espécies crípticas em simpatria no Lago Catalão e sugere que a variação descrita no padrão de NORs é um polimorfismo intrapopulacional No capítulo 3, inferências evolutivas utilizando o software Mesquite foram propostas para explicar a origem da atual diversidade cariotípica de Doradidae Nesse estudo, 9 espécies foram analisadas evidenciando uma acentuada variação no número de diplóide: 2n= 44 em Amblydoras nheco, 2n= 46 em Amblydoras affinis, 2n=52 em Astrodoras asterifrons, 2n= 58 em Platydoras hancockii, Pterodoras granulosus, Centrodoras brachiatus, Oxydoras niger, Hemidoras stenopeltis e 2n=6 em Trachtdoras steindachneri Espécies crípticas foram identificadas em Amblydoras affinis assim como um inédito sistema de NORs múltiplas em P hancockii A reconstrução do caracter ancestral corroborou estudos anteriores e estimou como 2n basal 58 cromossomos e NORs simples terminais no braço curto de subtelocêntricos, essas característica permanecem conservadas em diferentes clados de Doradidae, porém cariótipos derivados também ocorrem devido á rearranjos cromossômicos (inversões pericêntricas, Fissão e Fusão cêntrica, Translocações) e também pelo acúmulo diferencial de regiões heterocromáticas
Identificação de polimorfismos de nucleotídeo único no genoma da soja e seu uso no mapeamento associativo de características simples e complexas
Passianotto, André Luiz de Lima; Abdelnoor, Ricardo Vilela [Orientador]; Belzile, François; Sakiyama, Ney Sussumu; Vilas-Bôas, Laurival Antônio; Marcelino-Guimarães, Francismar Corrêa
Resumo: A soja Glycine max (L) Merrill, é uma oleaginosa com grande destaque na economia mundial O Brasil é o segundo maior produtor de soja, e na safra 212/213 apresentou produtividade média de 2933 kg/ha, totalizando 81 milhões de toneladas, contribuindo para o desenvolvimento de inúmeras regiões e sendo um dos pilares chefes do agronegócio brasileiro O sucesso desta cultura se baseia no seu progresso genético, adaptação ao ambiente brasileiro e melhoria nas técnicas de cultivo Cultivares foram melhoradas ao longo dos anos com o intuito de se obter materiais aclimatados as fronteiras agrícolas brasileiras e com melhor produtividade As doenças são um dos fatores que acometem a cultura e impactam diretamente na produtividade da soja brasileira caso com o do nematóide Meloidogyne incógnita o qual acomete lavouras de soja e seu parasitismo pode causar severos danos à lavoura, variando de acordo com o grau de infestação Recentemente, com as técnicas de sequenciamento de nova geração, novas metodologias visando a rápida identificação de polimorfismos e seu uso nos estudos de mapeamento associativo surgiram Entre elas destaca-se a Genotipagem por Sequenciamento (GBS) Este trabalho teve por objetivo a identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) e a validação da tecnologia de GBS para mapeamento de características simples e complexas em soja Utilizando uma população de 165 cultivares brasileiros, características como cor da pubescência, cor da flor e tolerância a glifosato foram mapeadas nos cromossos 6, 13 e 2 respectivamente corroborando com os estudos prévios de mapeamento apresentados por estas características Além disso, utilizando 194 genótipos de soja resistentes e suscetíveis ao nematóide Meloidogyne incógnita , foi possível a identificação de 1753 SNPs e o mapeamento de um QTL para resistência ao nematoide de galha, no cromossomo 1
Alterações na resposta celular ao tratamento com clorofilina associada a agentes citotóxicos in vitro
D’Epiro, Gláucia Fernanda Rocha; Mantovani, Mário Sérgio [Orientador]; Ribeiro, Lúcia Regina; Maistro, Edson Luís; Sartori, Daniele; Lepri, Sandra
Resumo: A clorofilina (Chl) é um corante de alimentos derivado da clorofila que apresenta atividade quimioprotetora Entretanto, seus mecanismos de ação não estão totalmente elucidados O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade quimioprotetora da clorofilina em células expostas aos agentes antitumorais doxorrubicina (Dox) e edelfosina (EDLF) e ao mutágeno ambiental benzo(a)pireno (BaP) No primeiro capítulo, as células HepG2/C3A (linhagem metabolizadora de hepatoma humano) foram expostas à Chl (25, 5, 1 e 2 µM) associada à Dox (3 ou ,1 µM) ou ao BaP (2 µM) A análise do ciclo celular mostrou que a Chl (2 µM) foi capaz de restabelecer a distribuição normal do ciclo celular e de inibir a morte celular induzida pela Dox (,1 µM) e o BaP (2 µM) A Dox e o BaP reprimiram a expressão dos genes envolvidos na progressão do ciclo celular (CCNA2, CCNB1, CCND1 e CCNE1, CDK1 e CDK2) e apoptose (BAX, CASP7 e TP53), entretanto, a associação com clorofilina não causou alteração dessa resposta No segundo capítulo, a linhagem HeLa (linhagem não metabolizadora de câncer cervical humano) recebeu os tratamentos com a Chl (1 e 2 µM) combinada com a Dox (,1µM), EDLF (1µM) e BaP (2 µM) por 24, 48 e 72 h A Chl não apresentou citotoxicidade e nos tratamentos associados com os três agentes (Dox, EDLF e BaP) foi capaz de atenuar o efeito citostático e reduzir a população de células apoptóticas (subG1) Porém, a Chl não foi eficaz em inibir a expressão do marcador de autofagia, LC3-II, e do marcador de apoptose, PARP clivada, induzida pelos agentes citotóxicos Portanto, em ambos os casos, a Chl atenuou os efeitos citotóxicos e citostáticos dos agentes Dox, EDLF e BaP, o que sugere sua atividade quimioprotetora mediante à toxicidade induzida por diferentes compostos
Caracterização de microrganismos isolados do xisto pirobetuminoso da área de mineração em São Mateus do Sul, Paraná
Goes, Kelly Campos Guerra Pinheiro de; Fungaro, Maria Helena Pelegrinelli [Orientador]; Mehta, Yeshwant Ramchandra; Morello, Luis Gustavo; Oliveira, André Luiz Martinez de; Barcellos, Fernando Gomes; Andrade, Diva de Souza [Coorientadora]
Resumo: Os finos de xisto (FX) e o xisto retortado (XR) são coprodutos sólidos gerados respectivamente, pela mineração e pela retortagem do xisto pirobetuminoso Em função da produção de FX e XR em grande quantidade durante o processo de extração do óleo e gás de xisto, há interesse em fazer uso desses coprodutos como, por exemplo, na formulação de fertilizantes e como veículos de inoculantes sólidos A identificação das comunidades microbianas presentes nos coprodutos do xisto pode fornecer informações sobre os microrganismos a serem incorporados em áreas cultiváveis, além de revelar isolados com potencial biotecnológico Este trabalho teve como objetivo isolar representantes da comunidade microbiana, identificar e caracterizar por técnicas morfofisiológicas, bioquímicas e moleculares os microrganismos do FX e XR O plaqueamento dos coprodutos permitiu isolar 4 bactérias, duas leveduras e 56 fungos filamentosos As bactérias identificadas pertencem aos gêneros, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus, Ralstonia, Serratia, Sphigomonas, Terrabacter e Xanthobacter Dentre os isolados fúngicos foram identificados os gêneros Acidiella, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Talaromyces, Ochroconis, Trichoderma e Pseudozyma pelo sequenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 Algumas estirpes bacterianas isoladas do FX e XR apresentaram potencial como promotoras de crescimento de plantas em Brachiaria ruziziensis utilizando os coprodutos como veículos inoculantes Esse estudo fornece o primeiro panorama sobre a ocorrência de microrganismos cultiváveis presentes nos coprodutos do xisto da Formação Irati, Paraná, Brasil
Mapeamento físico de genes ribossomais e pequenos DNAs nucleares em Bryconamericus (Characidae)
Santos, Angélica Rossotti dos; Dias, Ana Lúcia [Orientador]; Portela-Castro, Ana Luiza de Brito; Lui, Roberto Laridondo; Swarça, Ana Cláudia; Almeida, Fernanda Simões de
Resumo: Characidae compreende cerca de 11 espécies válidas de peixes extremamente diversificados e distribuídos por toda região neotropical O gênero Bryconamericus é conhecido por não apresentar relações filogenéticas bem definidas e, atualmente, esse gênero está inserido na subfamília Stevardiinae Sondas de DNAs repetitivos vem sendo cada vez mais aplicadas no estudo de peixes com a finalidade de auxiliar na compreensão de problemas taxonômicos, bem como na diferenciação de populações Apesar de poucas espécies de Bryconamericus terem sido analisadas citogeneticamente, o número diploide parece estar bem estabelecido nesse grupo de peixes, entretanto a presença de variações na macro e micro-estrutura cariotípica tem sido comum em várias populações A maioria dos estudos relacionados ao mapeamento de sítios de DNAs repetitivos no genêro, se restringe ao mapeamento de DNAr 18S e, até o momento, apenas três espécies apresentam resultados para o DNAr 5S É característico a presença de AgRONs múltiplas nesse gênero, sendo estas regiões confirmadas com o mapeamento dos sítios de DNAr 18S todavia, já foram relatadas espécies com presença de cístrons ribossômicos 18S em apenas 1 par cromossômico Dessa forma, no presente trabalho, foi realizada a caracterização citogenética e mapeamento de sítios de DNAs repetitivos em Bryconamericus ecai do rio Forquetinha-RS, Bryconamericus sp ribeirão vermelho, Bryconamericus sp rio Cambuta e Bryconamericus aff iheringii do ribeirão Três Bocas, visando melhor entendimento da estrutura e evolução cariotípica desse grupo de peixes Em todas as populações foi observado o número diploide igual a 52, com variação nas suas fórmulas cariotípicas Bryconamericus ecai apresentou três novos citótipos: citótipo V com fórmula cariotípica (FC) =8m+16sm+14st+14a e número fundamental (NF) igual a 9; citótipo VI com FC=1m+16sm+8st+18a e NF= 86 e citótipo VII com FC=8m+18sm+1st+16a e NF=88, sendo então caracterizados sete citótipos nesse população Nestes três citótipos foram observadas AgRONs múltiplas, confirmadas pela hibridação fluorescente in situ, com sonda de DNAr 18S, assim como sítios múltiplos de DNAr 5S no entanto, apenas um par de cromossomos portador do de DNAsn U2 (pequenos DNA nucleares) foi observado Os exemplares de Bryconamericus sp, ribeirão Vermelho, não apresentaram variação intrapopulacional mantendo a FC=16m+14sm+1st+12a e NF igual a 92 para todos os indivíduos No entanto, diferenças entre os indivíduos foram observadas quando aplicadas as técnicas de impregnação de nitrato de prata e a hibridação in situ com sondas de DNAr 18S e 5S e de DNAsn U2, separando essa população em dois grupos Bryconamericus sp rio Cambuta apresentou FC=2m+12sm+2st+2a e NF=88, com sítios múltiplos de DNAr 18S e apenas um par portador dos cístrons de DNAr 5S e DNAsn U2 Estes são os primeiros dados utilizando esta sonda de DNAsn U2 em Characidae Com a utilização da ferramenta de identificação molecular CO1, pela construção da árvore filogenética, foi possível observar diferença genética significativa entre essas populações de Bryconamericus, formando dois diferentes grupos: um formado pelas duas populações de Bryconamericus sp, subdivididos em espécimes ribeirão Vermelho e rio Cambuta e um segundo grupo, mais distante, formado pelos indivíduos de B ecai No entanto, não foi possível separar os dois grupos do ribeirão Vermelho, onde foi observada variação intrapopulacional nas análises citogenéticas Em Bryconamericus aff iheringii do ribeirão Três Bocas foi realizado o mapeamento dos sítios de DNAr 5S, dando continuidade aos dados anteriormente obtidos para essa população apresentou cinco citótipos: citótipo II FC= 18m+14sm+1st+1a e NF = 94; citótipo III FC=2m+18sm+4st+1a e NF = 94; citótipo IV com 2m+14sm+12st+6a e NF = 98; citótipo V com 22m+18sm+8st+4a e NF = 1 e citótipo VI com FC= 18m+24sm+6st+4a e NF = 1 Foram observados sítios múltiplos de DNA ribossômico 5S para os cinco citótipos analisados, sendo que em todos foram observadas marcações terminais, além de um par com marcação intersticial nos citótipos II, IV e V Todos os resultados confirmaram a grande diversidade cariotípica estrututral em Bryconamericus evidenciando ainda um polimorfismo de sítios de DNAs ribossômicos Dessa forma pode-se inferir que, está ocorrendo um processo evolutivo divergente ou mesmo que essa variabilidade seja devido à natureza polimórfica desse grupo de peixes
Citogenética de peixes das famílias Heptapteridae e Pseudopimelodidae (Siluriformes) : contribuição para estudos com DNAs repetitivos
Gouveia, Juceli Gonzalez; Dias, Ana Lúcia [Orientador]; Fenocchio, Alberto Sérgio; Silva, Carlos Roberto Maximiano da; Caetano, Lucia Giuliano; Vicari, Marcelo Ricardo
Resumo: Os Peixes das famílias Heptapteridae e Pseudopimelodidae, são peixes de couro, endêmicos dos neotrópicos e possuem uma ampla distribuição nos cursos d’água na América Central e do Sul A família Heptapteridae apresenta cerca de 26 gêneros e 28 espécies válidas e Pseudopimelodidae com 5 gêneros e aproximadamente 37 espécies válidas Os estudos citogenéticos são escassos nessas duas famílias diante da quantidade de espécies, sendo que apenas 41 espécies de Heptapteridae e 7 espécies de Pseudopimelodidae apresentam dados com este tipo de análise, até o momento Em Heptapteridae os estudos estão voltados para os gêneros Imparfinis, Pimelodella e Rhamdia, e em Pseudopimelodidae apenas poucos gêneros possuem descrição cariotípica, onde a maioria dos estudos apresentam apenas dados de citogenética clássica, não possuindo muitas análises cito-moleculares como o mapeamento físico de DNAs repetitivos Neste estudo foram descritos os primeiros dados com isolamento e caracterização de sequências de um elemento transponível Tc1-Mariner do genoma de Imparfinis schubarti, além do mapeamento cromossômico deste e de outros DNAs repetitivos como DNAr 18S, 5S e microssatélites em duas espécies do gênero Imparfinis, da família Heptapteridae, com o objetivo de discutir a composição genômica desse gênero, que é considerado o mais diversificado dentro de Heptapteridae As sequências isoladas de Tc1-mariner mostraram similaridade de aproximedamente 7% com sequências não autônomas da superfamília Mariner, com domínios característicos deste transposon O mapeamento físico de Tc1- mariner nos cromossomos de Imparfinis borodini e I schubarti, mostrou que esse elemento ocorre em abundância no genoma dessas duas espécies, com localização em regiões heterocromáticas e com um padrão diferenciado de distribuição nos cromossomos entre essas duas espécies Esse transposon também apresentou marcação nos cromossomos portadores de sítios ribossômicos 18S e 5S, assim como sequências curtas de microssatélites, o que pode ser um indício que a dispersão e evolução de genes de DNAs ribossômicos podem ser mediadas por DNAs repetitivos, devido a organização desses elementos no genoma de peixes Entre essas duas espécies de Imparfinis, também foi obsevada diferente localização das AgRONS, sítios de DNAr 18S e 5S em seus genomas, além de apresentarem uma grande diferença no número diplóide, onde I borodini mostrou o primeiro 2n=5 entre os Heptapterídeos e I schubarti com 2n=58, que é o mais comum nas espécies desse gênero Os dados sugerem que I borodini e I schubarti mostram uma evolução cromossômica mais divergente do que conservativa Foi realizado também um estudo com diferentes gêneros e espécies de heptapterídeos e pseudopimelodídeos, com a utilização de diferentes marcadores cromossômicos, visando discutir as relações citogenéticas entre essas duas famílias, juntamente com dados da literatura Foram analisadas três espécies de heptapterídeos (Cetopsorhamdia iheringi, Phenacorhamdia tenebrosa e Pimelodella meeki) e duas de pseudopimelodídeos (Microglanis cibelae e Microglanis cottoides) Os resultados revelaram o primeiro 2n=48 para a família Heptapteridae em Phenacorhamdia tenebrosa já em Microglanis cibelae que apresenta o primeiro dado citogenético neste trapabalho, mostrou o 2n=54 que é característico de Pseudopimelodidae Foram observadas características citogenéticas compartilhadas entre esses dois grupos como a presença de cromossomos com dois braços, a localização das RONs em região terminal de 1 par de cromossomos, na maioria das espécies estudadas, com uma variação de sítios de DNAr 18S e 5S em diferentes populações, inclusive da mesma espécie, como em Microglanis cottoides Os dados apresentados mais os da literatura confirmam a proximidade entre essas duas famílias por meio de diferentes marcadores citogenéticos e também revelam que existem características específicas de cada grupo, como a variabilidade cariotípica de Heptapteridae e o conservado 2n em Pseudopimelodidae Este trabalho também corrobora com a hipótese de que rearranjos cromossômicos estão ocorrendo nas espécies de Heptapteridae e Pseudopimelodidae, podendo ser mediada por diferentes mecanismos, o que reflete a organização genômica dentro deste grupo

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