01 - Doutorado - Ciências da Saúde

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Navegando 01 - Doutorado - Ciências da Saúde por Autor "Amarante, Marla Karine"

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    Análise do polimorfismo CCR5-delta32 e da expressão proteica de CCL5 em amostras de pacientes com carcinoma mamário
    Derossi, Daniela Rudgeri; Cólus, Ilce Mara de Syllos [Orientador]; Oliveira, Carlos Eduardo Coral de; Amarante, Marla Karine; Reiche, Edna Maria Vissoci; Delfino, Vinicius Daher Alvares; Guembarovski, Roberta Losi [Coorientadora]
    Resumo: Diversas moléculas, dentre as quais se destacam as quimiocinas e seus receptores, vêm sendo estudadas para uma melhor compreensão da patogênese do câncer de mama Evidências indicam que estas participam no desenvolvimento dos órgãos, na angiogênese, na mobilidade de células tronco, na recirculação dos leucócitos, na regulação e no desenvolvimento imunológico e hematopoiético, e mais recentemente, na disseminação de células tumorais no processo metastático, inclusive no câncer de mama Relatos atuais levantam a possibilidade de que a análise do eixo quimiocina CCL5 e receptor CCR5 possua um valor prognóstico relevante nesta neoplasia Neste trabalho, foi avaliado um polimorfismo genético (rs333/delta32) no gene CCR5 em um estudo de associação do tipo caso-controle, bem como em relação a parâmetros prognósticos da doença Foi ainda avaliada a expressão proteica de CCL5, tanto em sobrenadante tecidual quanto em cortes de tecidos tumoral e normal da mama, sendo as mesmas também correlacionadas aos parâmetros prognósticos das pacientes Foram utilizadas 167 amostras de sangue periférico de pacientes portadoras de carcinoma de mama e 179 amostras de mulheres livres de carcinoma de mama, para extração de DNA, no estudo de assocciação de caso-controle Para o método de enzimaimunoensaio foram utilizadas 49 amostras de sobrenadante de tecidos tumorais e normais a frescoPara o estudo imunohistoquímico foram utilizados 24 blocos de parafina provenientes de cirúrgicas realizadas nas pacientes com carcinoma de mama A análise da variante genética de CCR5 foi realizada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com primers específicos A análise da expressão proteica foi realizada pelas técnicas de enzima-imuno-ensaio (ELISA) (a partir dos sobrenadantes de tecidos normais e tumorais) e imunohistoquímica (a partir de cortes de tecidos normais e tumorais embebidos em parafina) As análises estatísticas foram realizadas pelos testes de Mann–Whitney e Correlação Tau_b de Kendall Não foi observada associação significativa entre a variante de CCR5 e a suscetibilidade ao câncer de mama (CCR5-delta32: OR=135; CI95%=63-291) As análises em relação aos parâmetros prognósticos indicaram uma correlação significativa entre CCR5-delta32 e acometimento de linfonodos e/ou metástase à distância (p= 2) Com relação à expressão proteica de CCL5 por imunohistoquímica, foi observada predominância de marcação citoplasmática Não foram observadas associações significativas em relação aos parâmetros prognósticos e nem em relação aos genótipos de CCR5-delta32 Com relação a expressão de CCL5 por ELISA, foi observada uma concentração maior da proteína no sobrenadante de tecido tumoral quando comparada àquele do tecido normal adjacente (p<1) Adicionalmente, quando esta expressão foi comparada em diferentes estadiamentos tumorais, foi observada uma diferença significativa entre os estadiamentos I e III (p<2) Ainda, quando a expressão de CCL5 foi averiguada em relação aos parâmetros prognósticos, foi observada uma maior concentração da proteína em relação ao comprometimento linfonodal (p=3) De um modo geral, os resultados do presente estudo indicam que o eixo CCL5/CCR5 pode ter importantes implicações prognósticas no contexto da carcinogênese mamária
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    Avaliação de marcadores imunológicos, metabólicos e de estresse oxidativo e da variante rs3761548 no gene FOXP3 em pacientes com esclerose múltipla
    Flauzino, Tamires; Reiche, Edna Maria Vissoci [Orientador]; Kaimen-Maciel, Damacio Ramón; Almeida, Elaine Regina Delicato de; Oliveira, Sayonara Rangel de; Amarante, Marla Karine; Simão, Andréa Name Colado [Coorientadora]
    Resumo: Introdução: A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica, desmielinizante, imuno-mediada, com envolvimento de muitos mecanismos fisiopatológicos que acometem o sistema nervoso central Sua etiologia é complexa e multifatorial com a interação entre fatores genéticos, falha da tolerância imunológica e fatores ambientais A EM apresenta heterogeneidade no seu curso clínico, progressão da incapacidade, formas clínicas e resposta ao tratamento Portanto, a busca por biomarcadores que possam ser úteis para auxiliar o diagnóstico, predizer incapacidade e sua progressão ao longo do tempo, tem sido objeto de estudos Objetivo: Avaliar um conjunto de biomarcadores imuno-inflamatórios, metabólicos, de estresse oxidativo/nitrosativo e a variante rs3761548 no gene FOXP3 em pacientes com EM Metodologia: O estudo incluiu 17 pacientes com EM de ambos os sexos, com idade entre 18 a 7 anos atendidos no Ambulatório de Doenças Desmielinizantes do Ambulatório de Especialidades do Hospital Universitário de Londrina e 182 indivíduos saudáveis Os pacientes foram classificados com EM remitente-recorrente (EMRR) e EM progressiva, que compreende as formas clínicas EM primariamente progressiva e EM secundariamente progressiva A incapacidade foi avaliada pela Escala Expandida do Estado de Incapacidade (EDSS), sendo catagorizada em leve (EDSS <3,) e moderada/grave (EDSS =3,) A progressão da doença foi avaliada pela escala Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS) e foi considerada progressão quando MSSS =5, Os dados sociodemográficos, antropométricos, epidemiológicos e clínicos foram obtidos utilizando um questionário padronizado Amostras de sangue periférico foram coletadas para a determinação de biomarcadores imuno-inflamatórios, tais como interleucina (IL)-6, IL-17, IL-1 e fator de transformação do crescimento (TGF)-ß1 e biomarcadores metabólicos como presença de síndrome metabólica (SM), níveis plasmáticos de glicose, níveis séricos de ácido úrico, homocisteína; insulina, colesterol total (CT), lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de alta densidade (HDL) e triglicerídeos; biomarcadores de estresse oxidativo e nitrosativo como peroxidação lipídica (hidroperóxidos), produtos avançados de oxidação proteica (AOPP), dosagem de proteínas carbonílicas e metabólitos do óxido nítrico (NOx) A identificação dos genótipos da variante rs3761548 do gene FOXP3 foi realizada em amostras de DNA genômico extraído das células do sangue periférico Uma sequência de 155 pares de bases do gene FOXP3 foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) Resultados: Os resultados foram apresentados em dois artigos No primeiro artigo científico, foram incluídos 122 pacientes com EM Pacientes com EDSS =3, tinham idade mais avançada e apresentaram níveis elevados de homocisteína, ácido úrico, AOPP, LDL e maior proporção de SM, enquanto os níveis de HDL foram mais baixos quando comparados aos pacientes com EDSS <3, Um modelo de análise demonstrou que 36,3% da variação no escore EDSS pode ser explicado pela idade, pelo escore da resposta Th17/T regulatória (Treg), LDL/HDL e homocisteína (todos positivamente) e inversamente ao índice de massa corpórea (IMC) Após ajustar pelos diferentes esquemas de tratamento para EM usados pelos pacientes, os efeitos da idade, homocisteína e dos scores Th17/Treg e LDL/HDL na incapacidade continuaram significativos, enquanto que os efeitos do IMC não foram mais associados Além disso, as proteínas carbonílicas foram associadas com o aumento no EDSS No segundo artigo, foram incluídos 17 pacientes com EM (121 mulheres e 49 homens) e 182 controles saudáveis (13 mulheres e 52 homens), controlados pela idade, sexo, etnia, índice de massa corporal (IMC) e tabagismo A mediana do EDSS nesta coorte de paciente com EM foi 3,, utilizado como ponto de corte para a categorização dos pacientes para este artigo Os pacientes com EM apresentaram níveis mais altos de TGF-ß1 e IL-1 quando comparado aos controles (p <,1) Em análise multivariada com TGF-ß1 e IL-1 como variáveis dependentes e o diagnóstico como variável explanatória ajustando-se à idade, sexo, IMC, etnia e tabagismo, constataram que o diagnóstico de EM, idade e tabagismo apresentaram efeitos significativos no níveis de TGF-ß1 e IL-1 Testes para efeitos entre indivíduos mostraram que o diagnóstico de EM estava positivamente associado com os níveis de TGF-ß1 e IL-1 e exercia um efeito em seus níveis de 4,3% e 32,5%, respectivamente A distribuição dos genótipos CC, CA e AA em modelos codominantes, dominantes e recessivos, assim como do alelo A, diferiu de pacientes com EM e controles em mulheres, sendo associados com a suscetibilidade à EM No modelo dominante, a frequência dos genótipos CA + AA em mulheres com EM foi maior do que em mulheres saudáveis, com odds ratio (OR) de 2,57 [intervalo de confiança (IC) de 95%: 1,5-4,37] TGF-ß1 (OR 1,26, IC95%: 1,1-1,53, p = ,45) e incapacidade moderada/grave incapacidade (EDSS> 3) (OR: 2,678, IC 95%: 1,26-6,995, p = ,44) foram positivamente associados aos genótipos CA + AA Após ajuste com os fatores confundidores (idade, etnia, tabagismo, idade de diagnóstico e tratamento para EM), somente os valores de TGF-ß1 permaneceram associados aos genótipos CA + AA (OR 1,27, 95%IC: 1,1-1,54, p=,43 Conclusão: No primeiro artigo, os resultados demonstraram que a relação entre a resposta Th17/Treg, juntamente com a idade, níveis aumentados de proteína carbonílica e homocisteína e o escore LDL/HDL foram associados com a incapacidade No segundo artigo, nossos resultados demonstraram que a variante rs3761548 FOXP3 foi associada ao diagnóstico de EM em mulheres Além disto, em mulheres com EM, os genótipos CA+AA foram associados aos níveis mais elevados de TGF-ß1 quando comparadas com as do genótipo CC Esses dados sugerem que o alelo A da variante FOXP3 -3279 C> A pode exercer um papel no número e função das células Treg e pode ser um dos fatores envolvidos na suscetibilidade das mulheres à EM Estes resultados reforçam que o perfil imuno-inflamatório, metabólico, o estresse oxidativo e nitrosativo, e as variantes genéticas desempenham um papel fundamental no curso clínico da doença e podem ser possíveis novos alvos para o tratamento desses pacientes
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    Estudo de biomarcadores inflamatórios, metabólicos, de estresse oxidativo e genéticos em pacientes com acidente vascular encefálico isquêmico agudo
    Alfieri, Daniela Frizon; Reiche, Edna Maria Vissoci [Orientador]; Amarante, Marla Karine; Lehmann, Marcio Francisco; Oliveira, Sayonara Rangel de; Delfino, Vinícius Daher Alvares; Simão, Andréa Name Colado [Coorientadora]
    Resumo: Introdução: O acidente vascular encefálico isquêmico (AVEi) agudo é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo É uma doença complexa e apresenta interação entre fatores não modificáveis (sexo, idade, genético) e modificáveis (hipertensão, dislipidemia, diabetes mellitus tipo 2, obesidade, tabagismo, entre outros) As vias inflamatória, metabólica e de estresse oxidativo e nitrosativo (IMO&NS) têm um papel importante durante o AVEi agudo e estão correlacionadas com a gravidade do evento e o prognóstico do paciente Muitos biomarcadores inflamatórios têm sido considerados úteis no auxílio ao diagnóstico e prognóstico do AVEi, sendo a Proteína C reativa (PCR) um dos mais amplamente utilizados na prática clínica Estudos sugerem uma associação entre variantes no gene da PCR, como o rs113864, em que há maior produção de PCR e risco para AVEi No entanto, resultados inconsistentes em relação a este polimorfismo têm sido descritos e muitos destes estudos têm sido realizados em populações etnicamente homogêneas Além disto, até presente data, não temos conhecimento da avaliação concomitante destes biomarcadores de IMO&NS em pacientes com AVEi agudo na população brasileira Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar os biomarcadores IMO&NS e o polimorfismo rs113864 no gene da PCR que possam predizer a suscetibilidade ao AVEi agudo, assim como a incapacidade funcional na admissão e o prognóstico a curto prazo Métodos: O estudo incluiu 176 pacientes com AVEi agudo atendidos no Pronto Socorro do Hospital Universitário da Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, e 176 controles sem histórico de AVEi e infarto agudo do miocárdio Foram coletados dados demográficos, antropométricos, epidemiológicos e clínicos Os subtipos de AVEi foram classificados segundo os critérios de TOAST em 5 categorias: aterosclerose de grandes artérias (LAAS), lacunar (LAC), cardioembólico (CEI), outras etiologias (ODE) e etiologia indeterminada (UDE) A incapacidade funcional dos pacientes foi avaliada no momento da admissão e após três meses de evolução pela Escala de Rankin Modificada (mRS) Amostras de sangue periférico foram coletadas em até 24 horas após o diagnóstico de AVEi para a determinação de biomarcadores inflamatórios, tais como contagem de leucócitos periféricos e plaquetas, velocidade de hemossedimentação (VHS), níveis séricos de PCR por metodologia de alta sensibilidade (usPCR), ferritina, fator de necrose tumoral (TNF)-a, interleucina (IL)-6, IL-1, 25-hidroxivitamina D [25(OH)D] e homocisteína; glicose, insulina, colesterol total (CT), lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de alta densidade (HDL) e triglicerídeos (TG) para os biomarcadores metabólicos; peroxidação lipídica (hidroperóxidos) e metabólitos do óxido nítrico (NOx) para os biomarcadores de estresse oxidativo e nitrosativo, respectivamente Para identificação dos genótipos do rs113864, o DNA genômico foi extraído das células do sangue periférico e uma sequência de 744 pares de bases do gene PCR foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) O produto obtido pela PCR foi submetido à digestão com a enzima de restrição HpyCH4III e analisado pelo método do polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) Resultados: Os resultados obtidos foram apresentados e discutidos em dois artigos originais Para o primeiro artigo científico, foram incluídos 176 pacientes e 176 controles Todos os resultados foram ajustados para possíveis efeitos de variáveis ou covariáveis em análises multivariadas Modelos lineares gerais (GLM) com todos os IMO&NS e dados demográficos/clínicos mostraram que o melhor conjunto de preditores para AVEi agudo foi sexo (masculino), pressão arterial sistólica, glicose, NOx, hidroperóxidos, IL-6, leucócitos periféricos (todos positivamente associados) e 25(OH)D (negativamente associado) (p<,1) Na análise multivariada, sexo (homens) (p<,1), hipertensão (p<,1), tabagismo (p=,15) e usPCR (p<,1) foram estimados como preditores independentes AVEi Com este conjunto de biomarcadores, 89,4% de todos os pacientes com AVEi foram corretamente classificados com sensibilidade de 86,2% e especificidade de 93,% Na admissão do estudo, os valores de ferritina, IL-6, usPCR, leucócitos periféricos, VHS e glicose foram maiores entre aqueles com maior incapacidade (mRS=3) (p<,1) Além disso, níveis elevados de ferritina, IL-6, usPCR, VHS e glicose e menores níveis de 25(OH)D foram independetemente associados com pior prognóstico (mRS=3) após 3 meses (p<,1) Para o segundo artigo, foram analisados 168 pacientes e 166 controles A mediana (intervalo interquartílico) da usPCR foi de 7,5 mg/L (2,6-24,8) em pacientes com AVEi e 1,6 (,7-3,7) mg/L em controles (p<,1) A distribuição dos genótipos do rs113864 estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>,5) Nos pacientes, a frequência dos genótipos CC, CT e TT foi de 95 (56,55%), 6 (35,71%) e 13 (7,74%), respectivamente No grupo controle, a frequência destes genótipos foi de 91 (54,58%), 63 (37,95%) e 12 (7,23%), respectivamente Não foram observadas diferenças na distribuição do genótipo rs113864 entre pacientes e controles; além disso, os genótipos não foram associados às características epidemiológicas e clínicas, assim como à usPCR e outros biomarcadores inflamatórios no início do estudo em pacientes com AVEi (p>,5) Por outro lado, controles portadores do alelo T (genótipos CT + TT) apresentaram maiores níveis de usPCR (p=,5) e maior frequência de usPCR =3 mg/L que os portadores do genótipo CC [odds ratio (OR): 2,31; intervalo de confiança (IC) 95%: 1,1- 4,1, p=,45] Além disso, a idade, os valores de mRS no início do estudo e a usPCR contribuíram positivamente para o pior prognóstico (mRS=3) após três meses apenas em pacientes portadores do alelo T (p<,1) Conclusão: Estes resultados sugerem que um conjunto de biomarcadores IMO&NS pode ser útil para o auxílio na previsão da ocorrência de AVEi, assim como na avaliação precoce do prognóstico a curto prazo Além disso, a variante localizada no gene PCR, rs113864, por si só, não se mostrou um fator determinante para a susceptibilidade ao AVEi; no entanto, em pacientes portadores do alelo T, os níveis de usPCR foram preditores independentes para um pior desfecho após três meses do evento isquêmico