01 - Doutorado - Microbiologia

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Aderência in vitro de isolados bucais de Candida albicans em diferentes materiais dentários
Camacho, Daiane Pereira; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Silva, Cléverson de Oliveira e; Panagio, Luciano Aparecido; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de
Resumo: Atualmente, diferentes técnicas e materiais têm sido empregados para reabilitação bucal por meio de próteses dentárias ou implantes A aderência inicial e a colonização por micro-organismos às superfícies rígidas como implante é um pré-requisito para a formação do biofilme que pode ocasionar infecções bucais O papel da levedura Candida albicans na patogênese de lesão peri-implantar está associado a sua característica de micro-organismo oportunista Sua transição de comensal para agente infeccioso depende tanto de fatores de virulência da levedura como da susceptibilidade do hospedeiro Entretanto, os processos biológicos que podem levar à falha dos implantes após a confecção das próteses ainda são pouco compreendidos Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo avaliar a aderência in vitro de isolados bucais de Candida albicans em diferentes materiais dentários, diferenciação celular ao nível ultraestrutural, determinar a produção de biofilme e o padrão de expressão de genes ALS Foram utilizados seis isolados clínicos e uma cepa padrão Candida albicans para a avaliação do perfil de aderência e a diferenciação celular dos isolados sobre a superfície de diferentes materiais dentários, produção de biofilme, bem como o padrão de expressão de genes da família ALS Os isolados avaliados apresentam eficiência quanto à formação de biofilme Todos os isolados apresentaram elevado potencial de aderência aos materiais confeccionados em resina composta microhíbridra com nanopartículas e liga metálica de Níquel-Cromo, enquanto que os menores valores de aderência foram observados nos materiais em porcelana feldspática e resinas acrílicas Observou-se uma diversidade no padrão de aderência e diferenciação celular, entre os isolados, de forma isolado-dependente Os isolados foram classificados conforme o perfil de adesão às superfícies dos materiais, seguindo quatro variações sendo estas: aderência difusa, localizada, agregativa e pseudo-hifal As maiores taxas de aderência dos isolados bucais de Candida albicans foram relacionadas principalmente às superfícies hidrofóbicas Foi observado um padrão complexo de expressão de genes da família ALS por isolados em modelo de aderência in vitro em diferentes materiais dentários Considerando os isolados individualmente, os transcritos mais frequentes em células aderidas aos diferentes materiais avaliados foram dos genes ALS1, ALS2 A indução de determinados genes ALS, no nosso caso ALS1 e ALS4, em função do material no qual o isolado estava aderido foi isolado-dependente; já a repressão de genes ALS7 e ALS9 parece ser dependente do material dentário, uma vez que em determinados tipos de materiais nenhum dos seis isolados analisados produziram transcritos relacionados as adesinas Als7 e Als9 Os resultados obtidos no presente estudo confirmam o potencial de aderência e consequente formação de biofilme por Candida albicans de origem bucal Entretanto a variação no padrão de expressão dos genes ALS nos diferentes materiais testados ocorreu de forma isolado- dependente Desta forma, nossos dados podem contribuir para o entendimento do processo da peri-implantite, corroborando com seu caráter multifatorial, sugerindo que este processo é dependente do material dentário utilizado nos implantes, bem como da capacidade do micro-organismo em desenvolver a infecção, via expressão diferenciada de genes associados a patogênese
Avaliação da atividade hemolítica e expressão de possíveis genes relacionados à aquisição de ferro em Candida tropicalis
França, Emanuele Julio Galvão de; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Furlaneto-Maia, Luciana; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Panagio, Luciano Aparecido
Resumo: No Brasil e em outras regiões de clima tropical, Candida tropicalis é uma das principais espécies relacionadas a episódios de candidemia, provocando elevados índices de morbi-mortalidade A produção de fator hemolítico é reconhecida como um possível atributo de patogenicidade dessa espécie, no entanto, tem sido alvo de poucos estudos Neste trabalho foi avaliado o efeito de diferentes condições de cultivo na produção de fator hemolítico e na expressão de dois genes possivelmente relacionados à aquisição de ferro do grupo heme de C tropicalis - CtHMX1, que possivelmente codifica uma heme-oxigenase e HLPt, que apresenta um papel na determinação da atividade hemolítica dessa espécie Foi verificado que o potencial hemolítico de C tropicalis é influenciado pelas condições ambientais Hemoglobina ou eritrócitos, que representam potenciais fontes de ferro, determinaram o aumento da hemólise promovida pela maioria dos isolados de C tropicalis (p<,5) Por outro lado, para a maioria dos isolados, a privação de ferro não determinou diferença significativa no potencial hemolítico em comparação à condição controle (meio RPMI 164, que também é escasso em ferro) No entanto, os índices de hemólise verificados na condição de privação foram inferiores aos constatados nos cultivos controle A presença de plasma na concentração 7% foi associada à diminuição do potencial hemolítico de todos os isolados (p<,5), porém em concentração inferior (3,8%), o plasma não interferiu no potencial hemolítico de C tropicalis A presença de eritrócitos, independentemente de sua concentração (7 ou 3,1%), determinou aumento da promoção de hemólise pela maioria dos isolados (p<,5) Por outro lado, em 7% de sangue total não foram verificadas diferenças no potencial hemolítico da maioria dos isolados Foi constatada filamentação diferencial de C tropicalis em presença de sangue total, eritrócitos ou plasma, porém não foi verificada correlação entre a diferenciação em formas filamentosas e a atividade hemolítica dessa espécie Os açúcares glicose, sacarose ou manose também determinaram aumento da hemólise promovida por C tropicalis (p<,5), de maneira dependente da concentração A síntese de transcritos de CtHMX1 foi influenciada pela privação de ferro e presença de hemoglobina; as duas situações determinaram indução da expressão do referido gene (p<,1) A presença de plasma das duas concentrações testadas (7 e 3,8%) não interferiu na expressão de HLPt, sendo o mesmo verificado em 7% de sangue para a maioria dos isolados Embora em presença de manose a maioria dos isolados tenha apresentado indução de HLPt (p<,1), o mesmo não foi verificado em presença de glicose e sacarose Os dados deste trabalho indicam que diferentes condições de cultivo influenciam de maneiras distintas a produção de fator hemolítico por C tropicalis e que CtHMX1 possivelmente tem um papel na aquisição de ferro do grupo heme por esta espécie; no entanto a expressão desse gene e a produção de fator hemolítico por C tropicalis parecem ser reguladas de maneira independente
Brevibacillus brevis LABIM 17 : potencial fonte de novos antimicrobianos
Chagas, Larissa de Medeiros; Oliveira Junior, Admilton Gonçalves de [Orientador]; Araújo, Daniela Cristina de Medeiros; Oliveira, José Francis de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Nakazato, Gerson; Lioni, Lucy Megumi Yamauchi [Coorientadora]
Resumo: Com o surgimento das “superbactérias” e a descrição de mecanismos de resistência bacteriana contra diversos medicamentos disponíveis no mercado, se faz necessária a busca por novos bioativos antimicrobianos Bactérias ambientais têm se mostrado valiosas ferramentas nessa busca, uma vez que têm capacidade de produzir compostos bioativos como produtos de seu metabolismo secundário Diante deste cenário o presente estudo teve por objetivo a prospecção de bactérias produtoras de antibióticos, bem como estudar alguns parâmetros de produção e estabilidade Inicialmente, foi feita a caracterização fenotípica de 33 isolados em solo de um fragmento de floresta secundária semidecídua em Londrina-PR, Brasil (23 ° 19'37,8 "S 51 ° 12'22,4" O) Dentre os isolados prospectados, 1% eram Gram positivas, 67% apresentavam a capacidade de produzir endósporos e 94% apresentavam-se na forma de bacilos Deu-se prosseguimento, então aos testes de atividade antagônica por cultura dupla contra os patógenos Acinetobacter baumannii (oxa23-positivo), Staphylococcus aureus ATCC 29213 e Escherichia coli ATCC 8739 apenas com os isolados que apresentavam morfologia de bacilos e capacidade de produzir endósporos Dentre os 22 isolados submetidos ao teste de cultura-dupla, LABIM 17 o único isolado capaz de inibir todos os três marcadores, mostrando assim uma atividade de amplo espectro A identificação molecular por rDNA 16S classificou LABIM17 como Brevibacillus sp LABIM 17 Por fermentação liquida submersa foi avaliado a produção de metabolitos extracelulares antibacterianos por LABIM 17 Os resultados obtidos demostraram a produção de metabólitos extracelulares antibacterianos em meio MAK a partir de 72 h Afim de avaliar a estabilidade dos metabólitos, sobrenadante livre de células foram submetidos a diferentes temperaturas e comprimentos de onda de luz visível e UV Os resultados demostraram que os metabólitos foram estáveis a temperaturas abaixo de 7°C e sob todos os comprimentos de onda testados Em antecipação a futuras análises genômicas em profundidade e suas aplicações potenciais, realizamos o sequenciamento completo do genoma da LABIM 17 e foi identificada como Brevibacillus brevis Em análises preliminares de agrupamentos gênicos envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários antibacterianos foram identificados agrupamentos para produção de Petrobactina, Octapeptina, Tirocidina, Gramicidina, Zwittermicin e Aurantinina Todos estes resultados sugerem que B brevis LABIM 17 tem um bom potencial para uso como agente produtor de antibacterianos, porém mais estudos são necessários para purificação, caracterização e aumento de produção dos compostos antibacterianos
Formação de biofilme por isolados clínicos de Candida parapsilosis stricto sensu em superfícies distintas
Stipp-Abe, Aline Tancler; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Panagio, Luciano Aparecido; Furlaneto-Maia, Luciana; Moralez, Alane Tatiana Pereira
Resumo: As infecções causadas por Candida parapsilosis stricto sensu representam um grave problema de saúde, principalmente quando relacionadas à adesão e formação de biofilme em superfícies abióticas, como dispositivos médicos A adesão e produção de biofilme têm sido apontadas como fatores de virulência para o desenvolvimento de candidíases e candidemias, pois tratam-se de mecanismos primários de infecção, principalmente em pacientes imunocomprometidos Estudos indicam que a presença de biofilme se constitui um mecanismo de resistência a ação dos antifúngicos dificultando o tratamento dessas infecções Este estudo avaliou a capacidade de adesão e formação de biofilme, em superfícies distintas, poliestireno e elastômero de silicone, bem como em quatro tipos diferentes de cateteres utilizados na prática médica Foram utilizadas 41 isolados de Candida parapsilosis stricto sensu provenientes de isolados clínicos de sangue (14), sangue via cateter (5), ponta de cateter (12) e secreção traqueal (1) Os ensaios de adesão e formação de biofilme em poliestireno e elastômero de silicone foram analisados pelas técnicas de mensuração de biomassa total (CV) e viabilidade celular (XTT) Nove desses isolados foram escolhidos aleatoriamente, e a viabilidade celular foi analisada de acordo com a adesão e formação de biofilme em quatro diferentes dispositivos médicos, Vialon® BD, Silicone, teflon e poliuretano Os ensaios de adesão e formação de biofilme nos quatro diferentes dispositivos médicos foram analisadas pela técnica de viabilidade celular A adesão em elastômero de silicone e poliestireno, foram predominantes nos isolados com alta atividade metabólica A adesão em poliestireno de isolados de secreção traqueal foi significativamente superior aos isolados de ponta de cateter e de sangue (p<,1 e p<,5, respectivamente) Nas duas superfícies analisadas quanto a formação de biofilme, a maioria dos isolados apresentaram elevada produção de biomassa No teste de viabilidade celular, a superfície de elastômero de silicone demonstrou predominância de isolados com elevada produção de biofilme, enquanto em poliestireno o predomínio foi de isolados com média produção Isolados de sangue apresentaram maior formação de biofilme em poliestireno (p<,1) A viabilidade celular na adesão em cateter de poliuretano foi superior em todos os isolados provenientes de sangue, ponta de cateter e sangue via cateter, e significantemente superior apara isolados de ponta de cateter (p<,1) Tanto a adesão como a formação de biofilme por C parapsilosis stricto sensu foram variáveis dependendo dos locais de isolamento, bem como nas diferentes superfícies testadas, indicando assim que não existe um padrão específico de adesão e formação de biofilme Os resultados dessas análises servirão de base para novos estudos utilizando elastômero de silicone bem como a utilização de dispositivos médicos, para verificar a formação de biofilme, uma vez que é mais confiável por serem materiais utilizados na prática médica, fornecendo assim, subsídios para o desenvolvimento de novos dispositivos médicos que apresente menor adesão, difucultando assim a formação de biofilme, reduzindo as altas taxas de mortalidade por infecções relacionadas à esses dispositivos, como a candidemia
Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas
(2021-03-31) Souza, Patricia Canteri de; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de; Kobayashi, Renata Katsuko Takayama; Ogatta, Sueli Fumie Yamada; Pavanelli, Wander Rogério; Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José
O ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.
Switching fenotípico em C. tropicalis : caracterização ultraestrutural de colônias e associação com virulência
Moralez, Alane Tatiana Pereira; Furlaneto, Márcia Cristina [Orientador]; Svidzinski, Terezinha Inez Estivalet; Negri, Melyssa Fernanda Norman; Furlaneto-Maia, Luciana; Almeida, Ricardo Sérgio Couto de
Resumo: Candida tropicalis é um patógeno humano associado a altas taxas de mortalidade O switching fenotípico é um importante fator de virulência desta espécie Este estudo foi realizado para avaliar, primeiramente, o efeito do switching fenotípico em C tropicalis quanto a dano celular em células FaDu e virulência em Galleria mellonella Para isso foram utilizados o isolado 497 e seus variantes e revertentes derivados de switching O variante crepe e seu revertente promoveram maior dano celular em células FaDu comparativamente ao do isolado parental Variantes de switching apresentaram virulência distinta em G mellonella Larvas infectadas com o variante crepe tiveram morte mais rápida comparada às larvas infectadas com o isolado parental Além disso, a carga fúngica foi 6,1 superior em larvas infectadas com o variante crepe comparada a de larvas infectadas com o parental O variante rugoso foi o menos virulento comparado ao parental Além disso, foi avaliado o efeito do switching na formação de biofilme, e verificadas a filamentação e a virulência em larvas de G mellonella por células planctônicas e sésseis recuperadas de biofilmes formados por morfotipos distintos O efeito do switching na formação de biofilme foi variável entre os sistemas de switching testados Células sésseis foram mais filamentosas do que células planctônicas para o revertente de crepe (497) Filamentação entre células sésseis do variante rugoso (497) foi maior comparativamente a do seu respectivo parental Virulência foi superior para larvas infectadas com células sésseis comparativamente à células planctônicas obtidas do revertente de crepe (isolado 497) e do isolado parental (isolado 711) Diferentemente, células planctônicas do variante enrugado (711) foram mais virulentas que células sésseis Células sésseis do variante crepe, e revertentes de crepe e enrugado apresentaram virulência superior à do seu respectivo isolado parental Por fim, colônias de padrões morfológicos liso e estruturado foram caracterizadas quanto a ultraestrutura e composição de matriz extracelular (carboidratos e proteínas) O variante rugoso (isolado 497) exibiu níveis superiores de ambos componentes do que seu respectivo parental Colônias de padrão estrutural liso do isolado 11 apresentaram quantidades superiores de carboidratos e proteínas, comparadas a colônias de mesmo fenótipo do isolado 497 Diferenças significativas foram observadas entre os níveis de carboidratos comparando os variantes crepes de ambos isolados Concluindo, foi demonstrado que o switching fenotípico tem efeito na virulência e em fatores de virulência de C tropicalis Este estudo relatou pela primeira vez a ocorrência de switching durante a infecção em G mellonella Pela primeira vez foi comparada a virulência de células sésseis e planctônicas a partir de biofilmes formados por isolados de switching fenotípico e avaliada a composição de matriz extracelular de colônias switching

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