02 - Mestrado - Ciência Animal
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Navegando 02 - Mestrado - Ciência Animal por Autor "Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]"
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Item Caracterização molecular de rotavírus genotipo P[6] de origem humana em um foco de diarreia neonatal suínaLorenzetti, Elis; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Takiuchi, Elisabete; Barreiros, Marco Antônio BacellarResumo: Um dos principais problemas sanitarios que acomete as criacoes de leitoes em todo o mundo e a diarreia neonatal O rotavirus suino sorogrupo A (PoRV-A) e uma etiologia viral frequentemente detectada nos episodios de diarreia em leitoes lactentes e recem-desmamados em sistemas de producao intensivo Para controlar a infeccao sao preconizadas varias acoes de manejo sanitario, incluindo a vacinacao das matrizes Entretanto, a grande diversidade antigenica encontrada nas estirpes de PoRV-A podem ser responsaveis por falhas vacinais As proteinas VP7 e VP4, presentes na camada externa do capsideo viral do RV-A, apresentam importante acao na imunidade induzindo anticorpos neutralizantes Com base nas caracteristicas moleculares dos genes que codificam as proteinas VP7 e VP4, os RV-A podem ser classificados em genotipos G e P, respectivamente Dentre os genotipos P identificados em estirpes de PoRV-A, o genotipo P[6] destaca-se pela sua frequencia de ocorrencia e pela grande diversidade Ate o momento foram descritas cinco linhagens (I-V) e oito sublinhagens (Ia-If; Va-Vb) do genotipo P[6] em estirpes de RV-A de origem humana e suina Este estudo teve por objetivo a caracterizacao molecular do genotipo P (gene VP4) presente em estirpes de PoRV-A identificadas em um foco de diarreia neonatal em suinos O foco ocorreu em uma granja altamente tecnificada, localizada no estado de Santa Catarina, com esquema de vacinacao regular contra a rotavirose suina Foram colhidas 8 amostras de fezes sendo 49 diarreicas e 31 normais (controle) As amostras foram colhidas de leitoes lactentes (n=57) e recem-desmamados (n=23) O diagnostico de rotavirus foi realizado por ss-PAGE e RT-PCR As amostras positivas foram genotipadas por multiplex-nested-PCR utilizando primers genotipo P-especificos e sequenciadas para a definicao da epidemiologia molecular da infeccao Foram identificadas 22 (27,5%) amostras fecais positivas para o PoRV-A sendo 16 (72,7%) provenientes de animais com diarreia e 6 (27,3%) de animais assintomaticos O PoRV-A foi identificado em leitoes de todas as faixas etarias incluidas no estudo Vinte estirpes de PoRV-A identificadas foram classificadas como genotipo P[6] de origem humana pois foram amplificadas (267 pb) com o primer desenhado para a amplificar estirpes M37-like de RV-A de origem humana Nenhuma das amostras foi amplificada com o primer desenhado especificamente para amplificacao de estirpes de RV-A genotipo P[6] de origem suína (estirpe Gottfried) A analise da sequencia de nucleotideos e a reconstrucao da arvore filogenetica, realizada em quatro amostras permitiram a classificacao de duas estirpes virais (BRA838/7-Po e BRA844/7-Po) como pertencentes ao genotipo P[6] linhagem I, sublinhagem Ie e outras duas estirpes (BRA843/7-Po e BRA898/7-Po) como sublinhagem If Os genotipos P[6]-Ie e If foram recentemente descritos em estirpes de RV-A de origem humana Essa e a primeira descricao de estirpes de PoRV-A genotipos P[6]-Ie e If identificadas em um foco de diarreia neonatal em suinos Estes resultados sugerem que o foco de diarréia pode ter resultado da transmissão interespecie do RV-A A vacinação intensiva das matrizes com vacina comercial contendo o genótipo P[6] de origem suína (estirpe Gottfried) pode ter influenciado na seleção desses genótipos, ate então somente descritos em estirpes virais de origem humana A possibilidade da ocorrência de infecções heterologas, em situação de pressão imunológica, alerta ainda para a necessidade do constante monitoramento das características antigênicas e moleculares de estirpes de PoRV-A identificadas em surtos de diarreia neonatal em rebanhos suínos regularmente vacinados contra a rotaviroseItem Caracterização molecular do gene L1 de um provável novo tipo de papilomavírus bovino identificado no BrasilLunardi, Michele; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Fungaro, Maria Helena Pelegrinelli; Kano, Flora SatikoResumo: O papilomavírus (PV) constitui um grupo diverso de pequenos oncovírus não-envelopados e com genoma DNA fita dupla circular, classificados na família Papillomaviridae Em bovinos são descritos 1 tipos de papilomavírus bovino (BPV) que, com base na identidade de nucleotídeos da proteína estrutural L1, estão distribuídos nos gêneros Deltapapillomavirus (BPV-1 e -2), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 e -8), Xipapillomavirus (BPV-3, -4, -6, -9 e -1) e em um gênero ainda não definido (BPV-7) A infecção por diversos tipos de BPV tem sido relacionada a diferentes quadros clínicos em bovinos, destacando-se a papilomatose cutânea A identificação dos tipos virais que determinam sinais clínicos e daqueles que resultam em infecções subclínicas tem sido realizada por meio da técnica da PCR, tanto em bovinos quanto em seres humanos Como a L1 é a proteína mais conservada entre os PVs, foram desenvolvidos oligonucleotídeos iniciadores (primers) consensuais e genéricos, que apresentam alta identidade de nucleotídeos com seqüências conservadas da ORF L1 Esses sistemas de PCR têm sido utilizados para detectar uma grande variedade de tipos virais em amostras clínicas O objetivo deste trabalho foi estabelecer o posicionamento filogenético de um provável novo tipo de BPV (BPV/BR-UEL2), identificado no Brasil, por meio da caracterização molecular de seu gene L1 O DNA do BPV/BR-UEL2 foi isolado a partir de um papiloma cutâneo, localizado na região axilar de uma vaca leiteira do Estado do Paraná Como a análise anterior, envolvendo a seqüência de 475 pb obtida pela PCR utilizando os primers FAP59/FAP64, havia indicado que o BPV/BR-UEL2 era mais relacionado ao BPV tipo 4, os alinhamentos das regiões genômicas L2, L1 e LCR de alguns representantes do gênero Xipapillomavirus (BPV-3, -4 e -6) foram utilizados na elaboração de primers genéricos Adicionalmente, o par de primers FAP também foi empregado, tanto na sua forma original quanto em combinações com os primers desenhados para este estudo O primeiro segmento do gene L1 pôde ser obtido por meio de um sistema semi-nested (SN-PCR) empregando na primeira etapa de amplificação os primers L2Bf/FAP64, e o par de primers L2Bf/L1Br na segunda etapa de amplificação, resultando em um produto de PCR de 435 pb A amplificação das regiões remanescentes do mesmo gene foi obtida a partir dos primers FAP59/FAP64 (475 pb) e L1Bf/LCRBr (1128 pb) Os referidos produtos de PCR foram posteriormente submetidos à clonagem e seqüenciamento A análise filogenética envolvendo seqüências completas da ORF L1 revelou que a amostra BPV/BR-UEL2 estava relacionada aos tipos de BPV agrupados no gênero Xipapillomavirus O provável novo tipo de BPV analisado neste estudo apresentou maior similaridade (78%) com a seqüência de nucleotídeos do gene L1 do BPV tipo 4, o que sugere a sua classificação no gênero Xipapillomavirus No Brasil, apesar do caráter endêmico das infecções pelo BPV, a identificação dos tipos de BPV em rebanhos bovinos ainda é esporádica Recentemente, a utilização do par de primers FAP59/FAP64 permitiu a identificação de quatro prováveis novos tipos virais, ainda não descritos no mundo, e provenientes de bovinos do estado do Paraná No presente estudo, o posicionamento filogenético de um destes tipos virais, detectado a partir de uma lesão cutânea de uma vaca leiteira, foi determinado A realização de estudos complementares envolvendo a epidemiologia molecular das infecções pelo BPV, tanto em rebanhos bovinos brasileiros quanto de diversas regiões geográficas ao redor do mundo, poderiam indicar a prevalência e checar a associação deste isolado com lesões cutâneasItem Desenvolvimento e avaliação da técnica de nested-PCR para a detecção do RNA do Senecavirus A em leitões com síndrome multissistêmica neonatalFeronato, César; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Lunardi, Michele; Freire, Roberta LemosResumo: O Senecavirus A (SenV-A) foi descrito pela primeira vez em 22, nos Estados Unidos O vírus pertence à família Picornaviridae, gênero Senecavirus Inicialmente, o SenV-A não foi associada a uma patologia específica; entretanto desde 28 existem relatos da possível associação desse vírus com quadros clínicos de doença vesicular em suínos Em 215, o SenV-A foi associado a casos de doença vesicular em suínos nas fases de creche e terminação e a sinais clínicos de letargia, hiperemia cutânea, diarreia, sinais neurológicos e/ou morte súbita em leitões de granjas suinícolas brasileiras e estadunidenses Desde então, a infecção pelo SenV-A é considerada uma doença infecciosa emergente que tem sido associada com doença vesicular em suínos desmamados (creche) e adultos (terminação) e com uma síndrome multissistêmica em leitões de diferentes países, como os Estados Unidos, Brasil e China Entre os sistemas diagnósticos disponíveis para a investigação da infecção pelo SenV-A, as técnicas moleculares são as mais utilizadas Entretanto, muitas destas técnicas são de alto custo e exigem conhecimento técnico avançado para a sua execução e/ou interpretação O objetivo deste estudo foi estabelecer a técnica de nested-PCR para o diagnóstico de rotina para a infecção pelo SenV-A em leitões Amostras de tecidos (n=177) foram coletadas de 37 leitões provenientes de 18 granjas localizadas em quatro diferentes estados de três regiões geográficas distintas do Brasil A técnica de RT-PCR foi realizada para amplificar um produto de 542 pb das regiões VP3/VP1 do genoma do SenV-A Para a nested-PCR, um par de primers foi selecionado para amplificar um fragmento interno da VP1 com 316 pb Quinze (4,5%) e 23 (62,2%) dos 37 leitões avaliados foram positivos para o SenV-A pelas técnicas de RT-PCR e nested-PCR, respectivamente O RNA do SenV-A foi detectado em 61 (34,5%) das 177 amostras de tecidos pela RT-PCR, enquanto a nested-PCR revelou que 84 (47,5%) das 177 amostras foram positivas para o vírus (p<,5) Considerando os resultados de acordo com as granjas, 11 (61,1%) e 16 (88,9%) das 18 granjas foram positivas para o SenV-A na RT-PCR e na nested-PCR, respectivamente A análise de sequenciamento de nucleotídeos revelou similaridade de 98,7% a 1% entre as sequências de SenV-A brasileiras e de 86,6% a 98% com cepas de SenV-A de outros países, confirmando a especificidade dos amplicons A técnica de nested-PCR deste estudo foi capaz de amplificar o RNA do SenV-A em amostras biológicas, leitões e granjas que foram consideradas negativas pela RT-PCR e é proposta para a investigação de rotina da infecção pelo SenV-A, especialmente quando outras técnicas não estão disponíveis ou quando um grande número de amostras devem ser examinadas para a presença viralItem Detecção de RNA de kobuvírus entérico bovino (Aichivirus B) e suíno (Aichivirus C) em rebanhos brasileirosRibeiro, Juliane; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Claus, Marlise Pompeo; Headley, Selwyn ArlingtonResumo: O gênero Kobuvirus pertence à família Picornaviridae e, de acordo com a espécie hospedeira, foi recentemente subdividido em três espécies denominadas Aichivirus A, B e C que infectam seres humanos, bovinos e suínos, respectivamente No Brasil não há relatos da infecção por Aichivirus B em bovinos e apenas um relato de Aichivirus C em suínos e, com isso, o objetivo desse estudo foi avaliar parâmetros da infecção nessas espécies de animais de produção No primeiro estudo foi avaliada a presença do Achivirus B em 222 amostras fecais diarreicas de bovinos coletadas no período de 21-212 A amostragem incluiu amostras fecais de bovinos provenientes de 36 rebanhos de quatro regiões geográficas brasileiras (Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Norte) Para avaliar a frequência de ocorrência do Aichivirus B em diferentes tipos de produção foram avaliadas amostras fecais de rebanhos bovinos de corte (n=15) e leite (n=117) Para determinar a categoria animal mais susceptível à infecção, a amostragem incluiu amostras fecais diarreicas de bezerros (n=182) e de animais adultos (n=4) Um fragmento de 219 pb do gene RdRp de kobuvírus foi amplificado por RT-PCR em 18,2% (4/222) das amostras fecais diarreicas avaliadas Foram encontrados animais positivos em rebanhos de todas as regiões geográficas incluídas no estudo indicando a ampla distribuição desse vírus nos rebanhos bovinos brasileiros A maior (P?5) taxa de infecção (2,9%; 38/182) por Aichivirus B foi encontrada em animais jovens, enquanto que em bovinos adultos o RNA viral foi detectado em 5% (2/4) das amostras avaliadas A análise da sequência de nucleotídeos de três amplicons demonstrou que as cepas de Aichivirus B identificadas nesse estudo agruparam em um ramo distinto na árvore filogenética Esse estudo demonstrou a ampla distribuição das infecções por kobuvírus em rebanhos bovinos e que os animais jovens são mais susceptíveis à infecção No segundo estudo foi avaliada a frequência de infecção do Aichivirus C nas três principais regiões produtoras de suínos no Brasil Foram avaliadas 63 amostras fecais de leitões lactentes (1 a 3 semanas de idade) colhidas no período de 24 a 211 em 46 rebanhos suinícolas localizados nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil A presença de RNA de Aichivirus C nas amostras foi avaliada por meio da técnica de RT-PCR Um fragmento de 219 pb do gene RdRp foi amplificado em 48 (76,2%) amostras fecais provenientes de todas as regiões geográficas incluídas no estudo demonstrando a ampla distribuição da infecção As taxas de detecção do Aichivirus C foram maiores (P<,5) em leitões com duas e três semanas de idade do que na primeira semana de vida A análise da sequência de nucleotídeos (nt) de três amplicons possibilitou agrupar as sequências desse estudo juntamente com as sequências de outras cepas previamente descritas no Brasil, revelando que não houve diferença filogenética nas cepas de Aichivirus C identificadas em diferentes regiões e idadesItem Detecção do coronavírus bovino em episódios de diarréia neonatal em rebanhos bovinos brasileirosStipp, Danilo Tancler; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Garcia, João Luis; Leite, José Paulo GagliardiResumo: A diarréia neonatal é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em bezerros, determinando grandes prejuízos econômicos à pecuária leiteira e de corte em todo o mundo As causas que determinam a diarréia neonatal bovina são complexas e multifatoriais O coronavírus bovino (BCoV) é um importante agente etiológico das diarréias virais de bezerros No entanto, a detecção do vírus a partir de amostras de fezes diarréicas é raramente investigada nos rebanhos bovinos brasileiros Dados epidemiológicos quanto a freqüência da infecção do BCoV em rebanhos da América do Sul também são escassos Além disso, a exigência de técnicas de diagnóstico sensíveis e específicas, como a RT-PCR, são fundamentais para o estabelecimento da real prevalência do BCoV em rebanhos bovinos O objetivo deste estudo foi avaliar aspectos epidemiológicos da infecção pelo BCoV em rebanhos bovinos brasileiros A freqüência de detecção do BCoV foi avaliada a partir de amostras fecais diarréicas (n = 221) e não-diarréicas (n = 61) de bezerros com até 6 dias de idade provenientes de rebanhos leiteiros e de corte de quatro estados brasileiros (São Paulo, Paraná, Minas Gerais e Mato Grosso), correspondendo a três regiões geográficas (Sul, Sudeste e Centro-Oeste) A técnica de semi-nested PCR (SN-PCR) foi utilizada para a detecção da região altamente conservada do gene que codifica a nucleoproteína do BCoV A taxa de detecção do BCoV nas amostras de fezes diarréicas (19,8%) foi significantemente superior (p=,27) que em fezes de consistência normal (3,2%) A infecção foi detectada em bezerros de todas as faixas etárias com maior prevalência (p= ,12) em animais com 16 a 3 dias de idade Duas estirpes selvagens do BCoV, detectadas à partir de amostras de fezes diarréicas, foram isoladas em cultura de células de adenocarcinoma retal humano (HRT-18) As estirpes virais isoladas foram identificadas como BCoV por meio da visualização de efeito citopático característico do BCoV na cultura celular, pela SN-PCR, RFLP com a enzima Hae III, e seqüenciamento dos fragmentos amplificados na SN-PCR A detecção do BCoV em infecções de bezerros provenientes de rebanhos de leite e corte em todas as regiões geográficas pesquisadas e o número de amostras diarréicas positivas para o BCoV demonstram que esta infecção entérica é uma importante causa da diarréia neonatal nos rebanhos bovinos brasileirosItem Detecção e caracterização molecular de sapovírus em suínos assintomáticosSouza, Cecília de; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Freire, Roberta Lemos; Vilas-Bôas, Laurival AntônioResumo: A infecção pelo sapovírus suíno (PoSaVs) é frequentemente observada em rebanhos suinícolas das Américas, Europa e Ásia A infecção pode se manifestar da forma sintomática, com sinais clínicos de diarreia Contudo, infecções assintomáticas são descritas com relativa frequência Existe grande diversidade genética do PoSaV; já foram estabelecidos cinco genogrupos e 16 genotipos e propostos cinco novos genogrupos em estirpes virais de campo O objetivo deste estudo foi verificar características epidemiológicas e moleculares da infecção pelo PoSaV em suínos assintomáticos 169 amostras fecais foram coletadas, randomicamente, de 14 rebanhos suinícolas comerciais, sendo cinco unidades produtoras de leitão (UPL) e nove unidades de terminação (UT) na região oeste do estado do Paraná, Brasil Foram coletadas amostras de fezes de animais de maternidade (n=2), creche (n=37), terminação (n=71) e reprodução (n=41) A presença de PoSaV nas amostras fecais foi avaliada pela técnica de RT-PCR com primers desenhados para amplificar o produto com 331 pb do gene da polimerase viral PoSaV foi detectado em 1 (71,4%) dos rebanhos incluídos neste estudo Todas as cinco UPL e cinco (55%) das UT continham animais eliminando o PoSaV pelas fezes A RT-PCR resultou positiva em 4 (23,7%) das 169 amostras fecais avaliadas A taxa de positividade por faixa etária animal variou entre 17,1 a 4,5% A infecção esteve associada à categoria animal, sendo mais frequente em animais de creche (P<,5) A análise filogenética realizada com três estirpes de PoSaV permitiu classificar uma estirpe como genogrupo III genotipo 3 e outras duas como genogrupo IX, recentemente identificado e ainda não descrito no continente americano Esses resultados demonstram que a infecção pelo PoSaV pode estar amplamente disseminada no rebanho suinícola brasileiro, inclusive em animais saudáveis, e que a infecção é mais frequente em animais de creche As estirpes de campo brasileiras de PoSaV apresentam diversidade genéticaItem Diagnóstico molecular de infecções virais e bacterianas associadas a um surto de doença respiratória em bezerras leiteirasOliveira, Victor Henrique Silva de; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Costa, Marcio Carvalho da; Pereira, Ulisses de PáduaResumo: Infecções respiratórias em bovinos caracterizam-se por serem multifatoriais e multietiológicas Na pecuária bovina leiteira as doenças respiratórias são mais frequentes em animais jovens, principalmente nas primeiras semanas de vida Devido à prevalência e às altas taxas de morbidade e mortalidade, as doenças respiratórias podem ser responsáveis por consideráveis prejuízos econômicos para a cadeia produtiva do leite Além da presença de micro-organismos patogênicos para o trato respiratório bovino como vírus e bactérias, condições estressantes como manejo sanitário e nutricional inadequados, falhas nos processos limpeza e desinfecção das instalações, criação coletiva incluindo animais de diferentes faixas etárias, condições ambientais desfavoráveis como extremos de temperaturas, entre outros são fatores predisponentes que contribuem para o aumento no número de casos e, principalmente, da gravidade das infecções respiratórias em bezerras leiteiras Com relação à etiologia viral, os principais agentes associados às infecções respiratórias primárias em bovinos jovens são o vírus da diarreia viral bovina (BVDV), vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), herpesvírus bovino-1 (BoHV-1), coronavírus bovino (BCoV) e vírus da parainfluenza bovina 3 (BPIV-3) A Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni e Mycoplasma bovis são os principais agentes bacterianos envolvidos em casos clínicos de doença respiratória em bezerros sendo geralmente responsáveis por infecções secundárias do trato respiratório ocasionando às pneumonias Vírus e bactérias podem agir de forma independente ou, mais frequentemente, em associação dificultando o diagnóstico etiológico definitivo das infecções do trato respiratório bovino O objetivo deste estudo foi identificar os agentes infecciosos envolvidos em um surto de doença respiratória em bezerras de uma unidade de criação de bezerras leiteiras A unidade avaliada localizava-se na região Oeste do Estado do Paraná e recebia bezerras provenientes de 4 pequenos rebanhos leiteiros em sistema de produção familiar Na ocasião, a unidade mantinha, aproximadamente, 125 bezerras sem raça definida que chegaram à unidade com 2 a 5 dias de idade e que foram mantidas em abrigos coletivos Excetuando-se o controle compulsório de brucelose e tuberculose bovina, o manejo sanitário em cada rebanho de origem não era monitorado Para o diagnóstico etiológico foram coletadas 21 amostras de lavados broncoalveolares (BALs) de bezerras com 2 a 9 dias de idade, sendo 15 BALs provenientes de bezerras com sinais clínicos evidentes de doença respiratória e seis BALs colhidos de bezerras assintomáticas no momento da colheita Para o rápido diagnóstico dos principais agentes etiológicos envolvidos no surto, na dependência do microorganismo, foram utilizadas técnicas moleculares como RT-PCR, PCR e nested-PCR Pelo menos um micro-organismo foi detectado em 85,7% dos BALs avaliados As coinfecções foram mais frequentes (72,2%) do que as infecções singulares (27,7%) Nas coinfecções a interação de vírus com bactéria foi a mais frequente (55,5%) A frequência dos agentes infecciosos envolvidos no surto de doença respiratória em bezerras deste estudo foi: BRSV (38,1%), BCoV (33,3%), BVDV (28,6%), P multocida (42,85%), M bovis (33,3%) e H somni (19%) Esses resultados evidenciam a etiologia múltipla de infecções respiratórias em bezerras de uma unidade de criação de bezerras leiteiras e demonstraram a importância do diagnóstico etiológico da enfermidade com o objetivo de direcionar as medidas terapêuticas, de controle e prevenção das infecções bacterianas e virais responsáveis pelo desencadeamento das infecções respiratórias que muitas vezes são negligenciadas nos rebanhos bovinos leiteiros brasileirosItem Diversidade dos genes VP6, VP7 e VP4 de cepas de rotavírus C identificadas em rebanhos suínos brasileirosPossatti, Flávia; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Vidotto, Marilda Carlos; Takiuchi, ElisabeteResumo: O rotavírus C (RVC) suíno é uma importante causa de enterite, principalmente em leitões lactentes e elevada incidência desta infecção tem sido demonstrada em rebanhos suínos brasileiros Para investigar a diversidade genética do RVC suíno em rebanhos de seis estados das três principais regiões brasileiras produtoras de suíno, os genes VP6, VP7 e VP4 de 15 amostras de fezes diarreicas positivas para RVC foram amplificados, sequenciados e a filogenia foi analisada em comparação com outras sequências de RVC disponíveis em bases públicas de dados A análise do gene VP6 demonstrou heterogeneidade considerável entre as 15 amostras, que apresentaram 83,2-1% de identidade de nucleotídeo (nt) entre elas e 82,6-98% de identidade com outras cepas de RVC suíno Na árvore filogenética as cepas de campo do RVC suíno agruparam em duas linhagens distintas (Porcine I e Porcine II) do genotipo suíno I1 A análise do gene VP7 revelou que a maioria das amostras (n = 14) pertence ao genotipo G6 e demonstrou alta identidade de nt entre elas (88,2-1%) No entanto, a amostra de RVC BRA57/11 não apresentou alta similaridade (74,5-76,7% de identidade de nt) com as demais amostras e agrupou com a cepa protótipo Cowden, que representa o genotipo G1 Na análise do gene VP4 as 15 amostras de RVC demonstraram grande heterogeneidade genética, com 6,7-1% de identidade de nt entre elas Com base em um ponto de corte de =8%, além do genotipo P[1] representado pela cepa Cowden, outros três genotipos suínos podem ser descritos Sugerimos nomear como genotipo P[4] as cepas sul-coreanas (CUK-5 e CUK-6) anteriormente identificadas e como genotipo P[5] a cepa norte-americana RV143/1 recentemente identificada Na árvore filogenética a amostra brasileira BRA77/11 agrupou no mesmo ramo das cepas P[4], CUK-5 e CUK-6 A amostra BRA57/11 agrupou no mesmo ramo da cepa Cowden, mas apresentou menos de 8% de identidade nt (74,4%), representando um possível novo genotipo, provisoriamente denominado P[6] As outras 13 amostras agruparam com a cepa RV143/11, com identidade de nt de 83,3-87,3%, indicando que a maioria das cepas de RVC suíno deste estudo pertence ao genotipo provisoriamente denominado P[5] Esses resultados evidenciam grande diversidade nos genes VP6, VP7 e VP4 de cepas de campo de RVC suíno no Brasil, incluindo a descrição de um potencial novo genotipo VP4 Esse estudo contribui com informações moleculares para o estabelecimento de um sistema formal de classificação e para obtenção de conhecimento sobre a ecologia e evolução das cepas de RVC circulantes em todo o mundoItem Epidemiologia molecular de Torque teno sus virus em rebanhos suinícolas brasileirosLeme, Raquel de Arruda; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Lunardi, MicheleResumo: O Torque teno sus virus (TTSuV) pertence à família Anelloviridae, gêneros Iotatorquevirus para as espécies torque teno sus virus 1a (TTSuV1a) e torque teno sus virus 1b (TTSuV1b), e Kappatorquevirus, para a espécie torque teno sus virus k2 (TTSuVk2) Este estudo visou avaliar a infecção natural pelo TTSuV nos rebanhos suinícolas brasileiros Para isso foram realizados três estudos, utilizando a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) que teve como alvo a região não traduzida (UTR) do genoma viral O primeiro estudo teve como objetivo avaliar a frequência da infecção natural pelo TTSuV nas três principais regiões produtoras de suínos do Brasil Amostras de fezes (n=135) de leitões de maternidade foram analisadas para a presença do vírus Foi possível demonstrar que a infecção tanto pelo TTSuV1 quanto pelo TTSuVk2 ocorre em leitões de 1 a 3 semanas de idade nas regiões Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil, com frequências de ocorrência que variaram de 4,5% a 51,1% para o TTSuV1 e de 8,8% a 24,3% para o TTSuVk2 O segundo estudo teve como objetivo avaliar a distribuição da infecção pelo TTSuV1 e TTSuVk2 nas diferentes categorias do ciclo de produção de suínos em rebanhos do estado do Paraná Foram analisadas amostras de fezes de animais em maternidade (1 a 3 semanas, n=35), creche (4 a 8 semanas, n=43), terminação (9 a 24 semanas, n=71) e de reprodutores (n=41) Os resultados revelaram que a infecção pelo TTSuV está disseminada em todo o ciclo de produção de suínos nas granjas paranaenses As frequências de detecção do vírus entre as categorias variaram de 5,6% a 28,6% (TTSuV1), 8,6% a 54,9% (TTSuVk2) e 7,3% a 29,5% (TTSuV1+TTSuVk2 em co-infecção) Pode-se observar que animais jovens são mais comumente infectados pelo TTSuV1, enquanto suínos na fase de terminação são mais comumente infectados pelo TTSuVk2 O objetivo do terceiro estudo foi avaliar a presença do TTSuV em amostras de orgãos e, concomitantemente, a viremia em suínos adultos assintomáticos de abatedouro e avaliar a presença de infecção simultânea por cepas distintas dos mesmos gêneros de TTSuV Amostras pareadas (n=116) de fragmentos de orgãos (fígado ou pulmão) e soro foram analisadas para a presença do vírus As cepas de TTSuV encontradas em amostras de orgãos apresentaram diferenças na similaridade dos fragmentos de nucleotídeos amplificados quando comparadas aos fragmentos de nucleotídeos de cepas obtidas a partir das amostras de soro nos mesmos animais e entre os animais, o que demonstra que infecções mistas simultâneas por cepas distintas de TTSuV1 e TTSuVk2 são comuns em suínos em idade de abate de rebanhos paranaenses Portanto, foi possível demonstrar que a infecção pelo TTSuV está disseminada nos rebanhos suinícolas do Brasil e que leitões e suínos adultos são mais frequentemente infectados pelo TTSuV1 e TTSuVk2, respectivamente Foi demonstrado que as estirpes de TTSuV1 e TTSuVk2 circulantes no Brasil apresentam importante variabilidade genética e que infecções simultâneas por cepas distintas dos mesmos gêneros de TTSuV são comunsItem Estudo longitudinal da excreção fecal de Teschovirus A, Sapelovirus A e Enterovirus G em leitões provenientes de uma granja localizada em Guarapuava, Paraná, BrasilSilva, Danilo Ratti da; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Barreiros, Marco Antônio Bacellar; Headley, Selwyn ArlingtonResumo: A família Picornaviridae é, atualmente, dividida em 29 gêneros que agrupam espécies virais de importância para humanos e animais Entre os picornavírus de importância para suínos, encontram-se o Teschovirus A (TV-A), Sapelovirus A (SV-A) e Enterovirus G (EV-G), também conhecidos como picornavírus entéricos suínos As principais patologias associadas a estes vírus são doenças neurológicas, reprodutivas, respiratórias e/ou entéricas, na dependência da presença de diferentes sorotipos de cada uma das espécies virais durante a infecção O objetivo deste estudo foi realizar a avaliação longitudinal da dinâmica da excreção fecal do TV-A, SV-A e EV-G em animais lactentes e desmamados As amostras fecais incluídas neste estudo foram coletadas de suínos provenientes de uma granja localizada em Guarapuava, estado do Paraná, em 212, armazenadas a -8°C Amostras fecais de 17 animais cuja consistência variava de sólida a líquida foram aleatoriamente selecionadas, exceto pelo critério idade, sendo incluídas amostras de animais que foram amostrados inicialmente na fase de maternidade e reamostrados durante a fase de creche, totalizando 34 amostras fecais A presença do TV-A, SV-A e EV-G foi investigada utilizando a reação em cadeia da polimerase seguida da transcrição reversa (RT-PCR) e a nested-PCR O alvo foi a região 5’ não traduzida do genoma de cada um dos vírus pesquisados Os resultados revelaram que não havia excreção de nenhum dos picornavírus entéricos suínos enquanto os animais estavam na idade de maternidade (duas a três semanas de idade) entretanto, entre as 17 amostras fecais coletadas dos mesmos animais durante o período de creche (quatro a seis semanas de idade), 12 foram positivas para o TV-A, nove para o SV-A e 14 para o EV-G A excreção singular (EV-G, n=2) e mista (TV-A e EV-G, n=3; TV-A, SV-A e EV-G, n=9) foi detectada A análise de sequenciamento confirmou a especificidade dos amplicons obtidos para cada um dos vírus, revelando identidade as sequências de nucleotídeos do banco de dados variando entre 96,1 e 99,3% para o TV-A, 96,1 e 99% para o SV-A e 88,4 e 99,6% para o EV-G Este é o primeiro estudo longitudinal realizado no Brasil para a avaliação da excreção fecal dos picornavírus entéricos suínos Os resultados mostraram que a infecção pelo TV-A, SV-A e EV-G em animais de até três semanas de idade não foi um evento comum e que as infecções pelos picornavírus entéricos suínos apareceram de acordo com a idade dos animais Adicionalmente, os resultados sugerem que a transmissão horizontal pelo contato direto entre os animais exerce importante papel na epidemiologia das infecções pelos picornavírus entéricos suínos, mantendo a circulação viral dentro dos rebanhosItem Freqüência de diagnóstico e caracterização molecular do calicivírus entérico suíno em rebanhos brasileirosBarry, Aline Fernandes; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Leite, José Paulo Gagliardi; Vidotto, Marilda CarlosResumo: Os membros do gênero Sapovirus (SaV) são divididos em cinco genogrupos com base na similaridade do gene da proteína principal do capsídeo Estirpes de quatro desses genogrupos podem ocasionar diarréia em seres humanos e apenas o genogrupo III (GIII) é relacionado à infecções entéricas em suínos O protótipo do GIII é a estirpe Cowden, que é a única estirpe de SaV adaptada em cultivo celular Os calicivírus entéricos suínos foram descritos em poucos países, e embora a freqüência da infecção seja variável, é considerado um importante agente etiológico de diarréia O objetivo desse estudo foi detectar o SaV em fezes diarréicas e não-diarréicas de leitões e correlacionar a presença do vírus com sinais clínicos de diarréia e faixa etária dos animais infectados, além de observar a taxa de ocorrência e analisar filogeneticamente uma estirpe representante de cada Estado incluído neste estudo Foram testadas 113 amostras de fezes de leitões com idade de um a 28 dias, provenientes de rebanhos dos Estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, durante os anos de 24 e 25 Foi utilizada a técnica da RT-PCR com os primers p289/29 desenvolvidos para amplificar uma região do gene da polimerase viral O fragmento de 331 pb esperado para SaV foi encontrado em 3,1% (34/113) das amostras Não houve correlação entre a infecção e o quadro clínico de diarréia (p=,59), mas foi demonstrada uma proporção de infecção maior (p=,1) em animais de 22 a 28 dias de idade do que nos outros grupos etários (p>,5) A análise filogenética revelou que as estirpes dos Estados do Mato Grosso do Sul e Paraná seqüenciadas são pertencentes ao GIII, tendo grande similaridade genética com a estirpe Cowden As mesmas estirpes também revelaram alta identidade (72,2 a 9,2%) com isolados da Venezuela e Coréia Já as estirpes dos outros Estados apresentaram pouca similaridade com o protótipo, mas alta identidade com estirpes detectadas no Japão e Holanda, demonstrando grande variabilidade genética das estirpes circulantes nos rebanhos suínos brasileirosItem Identificação molecular do genótico 3b do vírus da hepatite E em fígado, bile e amostras fecais de suínos assintomáticos de rebanhos brasileirosGardinali, Noemi Rovaris; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Pinto, Marcelo Alves; Vilas-Bôas, Laurival AntônioResumo: A hepatite E, causada pela infeccao pelo virus da hepatite E (HEV), e um problema de saude publica em paises industrializados e em desenvolvimento Suinos domesticos sao reservatorios do virus e alguns casos de hepatite E podem ser adquiridos pelo consumo de visceras de suinos, contato com as fezes de animais portadores do virus ou por contaminacao ambiental A exposicao ocupacional (granjeiros, veterinarios e trabalhadores de abatedouros) e considerada fator de risco para a infeccao pelo HEV O objetivo desse estudo foi avaliar a presenca do HEV em fezes, bile e no figado de suinos assintomaticos Foram colhidas 17 amostras de fezes de suinos de diferentes categorias (reproducao, leitoes lactentes e desmamados e animais de terminacao) e 118 amostras de bile e figado de animais em idade de abate As amostras foram provenientes de 24 rebanhos suinicolas da regiao oeste do estado do Parana, sendo as amostras fecais colhidas em 14 rebanhos e as amostras de bile e figado, colhidas em um frigorifico, provenientes de 1 rebanhos A identificacao do HEV nas amostras biologicas foi realizada por nested PCR Nas amostras fecais foram utilizados dois sistemas de nested PCR sendo um direcionado para a ORF2 do HEV e utilizado como triagem e outro direcionado para a ORF1 Esse ultimo, tambem utilizado nas amostras de bile e figado Os produtos amplificados foram sequenciados para a identificacao e realizacao das analises filogeneticas O RNA do HEV foi identificado em 26/17 (15,3%) das amostras fecais de animais e em 1/14 (71,4%) rebanhos Em animais provenientes de abatedouro o virus foi detectado em 1 (,84%) amostra de bile e em 2 (1,7%) amostras de figado Por analises filogeneticas, todas as estirpes de HEV foram identificadas como pertencentes ao genotipo 3b Os resultados demonstram a ampla distribuicao do HEV nos rebanhos avaliados e a presenca da infeccao em suinos assintomaticos provenientes da regiao oeste do estado do Parana O genotipo (3b) do HEV identificado nesse estudo, apresentou alta similaridade com estirpes virais de origem humana Considerando o aspecto zoonotico da infeccao, a identificacao do HEV em excrecoes e em visceras de suinos assintomaticos pode apresentar reflexos principalmente em saude publicaItem Primeira descrição de rotavírus suíno grupo H no continente americanoMolinari, Bruna Letícia Domingues; Alfieri, Amauri Alcindo [Orientador]; Leite, José Paulo Gagliardi; Alfieri, Alice FernandesResumo: Na criação comercial de suínos a diarreia do pré e do pós-desmame dos leitões representa o principal problema sanitário nessas fases de criação O rotavírus (RV) é um importante agente etiológico de gastroenterites virais em suínos lactentes e recém-desmamados Dentre os sete grupos de RV (A-G), os grupos A, B e C determinam infecções que, por sua frequência, podem ser consideradas de importância epidemiológica para seres humanos e animais Recentemente, com base na análise molecular do gene VP6, foi proposta a criação de um novo grupo de RV denominado grupo H (RVH) Entre os RVH descritos até o momento, somente as cepas J19 e B219 de origem humana já tiveram seus genomas completos determinados Por sua vez, a única cepa de RVH detectada em suínos (SKA-1), apresenta apenas os genes VP4, VP6, VP7 e NSP4 caracterizados Análises filogenéticas comparativas mostram que as cepas de RVH não se agrupam com nenhuma das espécies de RV já estabelecidas (RVA-RVG), no entanto, parecem estar relacionadas com os RVB A epidemiologia e a caracterização antigênica e molecular do RVH, tanto de origem humana quanto suína permanecem pouco elucidadas Os objetivos deste estudo foram descrever a primeira identificação de RVH em rebanho suíno brasileiro e caracterizar molecularmente a proteína VP6 das cepas virais encontradas Três amostras fecais provenientes de um surto de diarreia em leitões lactentes e recém-desmamados ocorrido em uma granja do estado de Mato Grosso do Sul em 212, inicialmente caracterizadas como RVB pelas técnicas de eletroforese em gel de poliacrilamida e RT-PCR, foram submetidas a novas amplificações por RT-PCR utilizando-se primers específicos para o gene da proteína NSP2 de RVB Os produtos obtidos, menores do que o esperado, foram sequenciados e a análise filogenética revelou que as maiores identidades encontradas foram com o gene VP4 das cepas SKA-1, B219 e J19 pertencentes ao RVH Para confirmar a similaridade das três amostras com RVH, uma nova série de RT-PCR foi realizada com primers selecionados para a amplificação do gene VP6 de RVH suíno a partir da sequência de nucleotídeos da cepa suína SKA-1 Na análise filogenética as três amostras brasileiras apresentaram maior similaridade com RVH, ficando agrupadas no mesmo cluster das cepas pertencentes a este grupo de RV Em adição, similaridades relativamente altas foram encontradas entre as cepas de RVH suíno descritas nesse estudo e cepas de RVB e RVG Os resultados encontrados confirmam a presença de RVH no Brasil e fornecem novos dados que auxiliarão no entendimento da filogenia e epidemiologia viral, bem como no esclarecimento dos padrões de evolução viral e propriedades biológicas do RVH Esta é a primeira descrição de RVH suíno fora do continente asiático