02 - Mestrado - Ciência Animal
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Navegando 02 - Mestrado - Ciência Animal por Autor "Alfieri, Amauri Alcindo"
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Item Avaliação molecular parcial do gene da hemaglutinina do vírus da cinomose caninaNegrão, Fábio Juliano; Alfieri, Alice Fernandes [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Alfieri, Amauri Alcindo [Coorientador]Resumo: Urina e leucócitos de 56 cães com diagnóstico clínico de cinomose foram avaliados comparativamente pela técnica de Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR) para o gene da hemaglutinina (Gene H) do vírus da cinomose canina, urina e leucócitos de 56 cães com diagnóstico clínico de cinomose De acordo com a predominância dos sinais clínicos os cães foram distribuídos em três grupos (17=sistêmicos; 8=neurológicos e 31=sistêmicos e neurológicos) A amplificação do segmento de 721 pares de base foi possível em 45/56 cães Em 34/45 cães o CDV foi detectado tanto em urina e quanto em leucócito Em 11/45 cães somente um tipo de material biológico foi positivo (urina 1/45 e leucócito 1/45) A variedade de sinais clínicos da cinomose canina e a escolha do material pode gerar resultados falso negativos, principalmente em cães com sinais clínicos somente sistêmicos, grupo A onde 7/17 animais foram negativos quando comparados com 1/8 do grupo B e 3/31 do grupo C, é aconselhado o uso de no mínimo duas amostras biológicas para detectar o CDV Em outro estudo 27 cães positivos e 5 cães negativos pela técnica de RT-PCR para o gene da nucleoproteína do CDV (Gene N) foram distribuídos em quatro grupos (A= sinais clínicos sistêmicos; B= sinais clínicos neurológicos 8; sinais clínicos sistêmicos e neurológicos 9 e D= controle 5 cães) Para o ensaio de polimorfismo no tamanho dos fragmentos de restrição as enzimas Hinf I e Rsa I foram selecionadas para determinar o perfil de restrição do produto amplificado de 721 pb do gene H diretamente das amostras biológicas e das estirpes padrão Onderstepoort, Rockborn e Snyder Hill do CDV Todos os produtos da RT-PCR geraram com a enzima Hinf I dois fragmentos visualizados com 32 e 25 pb Com a enzima Rsa I todas as amostras de campo geraram dois fragmentos visualizados de 32 e 23 pb A estirpe Onderstepoort após a digestão com a enzima Rsa I foi cortado em 363 pb e 327 pb O perfil de restrição das estirpes Rockborn e Snyder Hill foi o mesmo com dois fragmentos de 363 e 358 pb, confirmando a análise computacional A estirpe Rockborn não apresenta a seqüência do gene H depositada em banco de dados público Os produtos da RT-PCR e da RFLP foram determinados por eletroforese em gel de agarose corado a 2% com brometo de etídio e os fragmentos de menor peso molecular não puderam ser visualizados A relação molecular demonstrada pela RFLP sugere que as amostras do CDV circulantes na região norte do Paraná seja diferente das estirpes padrão do CDV e essas diferenças no perfil de restrição podem caracterizar diferenças molecularesItem Detecção e quantificação de RNA de astrovírus suíno 3 em sistema nervoso central de suínos com polioencefalomielite no Brasil(2025-02-26) Yasumitsu, Carolina Yuka; Alfieri, Amauri Alcindo; Dall’Agnol, Alais Maria; Headley, Selwyn Arlington; Lorenzetti, Elis; Agnol, Alais Maria DallResumo: Astrovírus suíno 3 (PAstV3) é um vírus emergente na suinocultura mundial responsável por causar polioencefalomielite e sinais clínicos neurológicos em suínos. O objetivo deste estudo foi relatar a identificação de RNA de PAstV3 no sistema nervoso central (SNC) de suínos desmamados, provenientes de um rebanho do estado de São Paulo, sudeste do Brasil, apresentando tetraplegia, opistótono, nistagmo e febre ocasional, compatíveis com doença neurológica associada à polioencefalomielite. Fragmentos em duplicata de SNC de três animais com 24 a 26 dias de idade foram submetidos a avaliação histopatológica pela técnica de hematoxilina e eosina. As amostras de SNC foram também avaliadas por cultura bacteriana e técnicas moleculares (PCR e suas variações) para identificar os principais agentes de doenças infecciosas associados à doença neurológica em suínos (teschovírus suíno, sapelovírus suíno, enterovírus G suíno, pestivírus suíno atípico, senecavírus A, vírus da encefalomiocardite e PAstV3). As principais alterações neuropatológicas ocorreram na substância cinzenta da medula espinhal e tronco encefálico, sendo semelhantes em intensidade e distribuição e apresentando rombencefalite aguda, moderada, multifocal a coalescente, não supurativa e polioencefalomielite. Na cultura bacteriana nenhuma bactéria foi isolada. O RNA do PAstV3 foi detectado por nested-PCR, confirmado por sequenciamento de nucleotídeos (Sanger) e quantificado por RT-qPCR (Cq 24,55 a 32,51) nas amostras de SNC dos três suínos com evidência histopatológica de polioencefalomielite. Outros vírus já descritos em infecções no SNC de suínos não foram detectados pelas técnicas moleculares utilizadas. Esta é a primeira confirmação molecular de PAstV3 em suínos com doença neurológica e lesões consistentes com polioencefalomielite no Brasil e destaca a importância do monitoramento de eventos de saúde animal como a emergência de novos agentes etiológicos, que podem comprometer a produtividade da suinocultura e o bem-estar animalItem Identificação molecular de Scutavirus chelonidalpha5 em tartaruga-de-pente (Eretmochelys imbricata) de vida livre no Brasil(2025-03-11) Cesário, Gabriela Donini; Alfieri, Amauri Alcindo; Santos, Marcelo Renan de Deus; Lunaridi, Michele; Miguel, CamilaA tartaruga-de-pente (Eretmochelys imbricata) é a única espécie de tartaruga presente na costa brasileira que se encontra criticamente ameaçada de extinção globalmente e em perigo nacionalmente. Apesar desta espécie ter distribuição global em águas tropicais, os estudos relacionados ao seu ciclo de vida e suas patologias são ainda muito escassos. A fibropapilomatose (FP) é a doença de maior impacto em tartarugas-marinhas, principalmente nas populações de tartaruga-verde que é a espécie mais afetada. FP é uma doença epizoótica de ocorrência mundial, que promove o crescimento de tumores benignos em todas as áreas do corpo. A etiologia da FP é considerada multifatorialrelacionada à infecção de tartarugas com Chelonid alphaherpesvirus 5 (ChAHV5), atualmente denominado Scutavirus chelonidalpha5. Também foi relacionada à infecção com Caretta caretta papillomavirus 1 (CcPV-1) e Chelonia mydas papillomavirus 1 (CmPV-1). O objetivo deste estudo foi identificar ChAHV5 em tartarugas-de-pente de vida livre, capturadas intencionalmente no Recife de Coroa Vermelha, Bahia, região nordeste do Brasil. Foram capturados 13 animais que passaram por exames físicos, morfométricos e colheita de sangue, fragmentos de pele e de swabs ocular e cloacal. O DNA extraído do material biológico foi submetido à técnica de PCR para a detecção dos genes UL27 (glicoproteína B) e UL30 (DNA polimerase) de ChAHV5 e E1 de papilomavírus. Em dois indivíduos, um com lesão de FP e outro sem, foi obtida a amplificação parcial do gene que codifica a DNA polimerase de ChAHV5. Análises filogenéticas realizadas na sequência de nucleotídeos dos amplicons revelaram que as cepas de ChAHV5 identificadas neste estudo em E. imbricata diferem das já descritas no Brasil em outras espécies de tartarugas marinhas. Os animais positivos para ChAHV5, apesar de estarem com boa condição corporal, apresentaram-se com hipocalcemia, hipomagnesemia, diminuição nos valores de globulina, sódio e linfócitos. Valores aumentados de eosinófilos, heterófilos, ácido úrico, albumina, além de um aumento acentuado de ferro sérico também foram encontrados. Este é o primeiro relato da identificação de ChAHV5 e de lesão de FP nesta espécie de tartaruga marinha de vida livre na costa brasileira. Os achados sugerem uma dieta deficiente ou incapacidade de assimilar os nutrientes, e um sistema imune comprometido. Foi observado anemia na tartaruga CV478, podendo ser secundária FP e leucopenia na tartaruga CV477, possivelmente secundária a má-nutrição ou a infecção viral.Item Mudanças na microbiota fecal de bovinos de corte causadas pelo confinamento e pela ingestão de virginiamicinaBessegatto, José Antonio; Lisbôa, Júlio Augusto Naylor [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Costa, Marcio Carvalho daResumo: Antibióticos são frequentemente fornecidos como promotores de crescimento para animais de produção Entretanto, as consequências desta prática sobre a microbiota intestinal e as mudanças ao longo do tempo são pouco entendidas O objetivo deste estudo foi caracterizar as mudanças na microbiota intestinal de bovinos de corte induzidas pelo confinamento e pelo uso da virginiamicina como antibiótico promotor de crescimento (APC) Dois grupos de bovinos em início de confinamento (G1 e G2) foram divididos em dois lotes de tratamento: um deles com virginiamicina (ATB) e outro como controle (CON) recebendo a mesma alimentação, sem o antibiótico O G1 era composto por 5 animais (machos e fêmeas) e o G2 por 36 animais, todos machos Amostras fecais foram coletadas na chegada, no meio (após período de adaptação de 25 dias) e na saída para o abate Cento e quarenta e quatro amostras foram utilizadas para a extração de DNA e sequenciamento da região V4 do gene 16S bacteriano utilizando a plataforma Illumina MiSeq Os animais foram pesados na entrada e na saída do confinamento para o cálculo de ganho médio diário (GMD), usado para comparação entre os animais CON e ATB de cada grupo Uma alíquota de cada amostra da chegada (36) e da saída (36) dos animais do G2 foi utilizada para determinar a susceptibilidade da bactéria Escherichia coli a diferentes antibióticos As bactérias do filo Firmicutes foram as mais abundantes durante todo o período experimental O filo Verrucomicrobia apresentou alta abundância relativa na chegada ao confinamento, mas foi suprimido pelas mudaças da dieta Proteobactérias aumentaram estatisticamente até o momento da saída Houve maior abundância relativa de Spirochaetes no meio do confinamento nos animais que recebiam virginiamicina no G1, enquanto no G2 Actinobacteria teve maior abundância relativa no meio e na saída nos animais do CON No G1, maior abundância relativa no meio do confinamento dos generos Treponema spp, Clostridium sensu stricto spp e Clostridium XI spp foi presente nos animais do ATB Enquanto no G2, maior abundância relativa de Bifidobacterium spp e menor de Clostridium XIVa spp foi observada no meio do confinamento nos animais que recebiam a dieta sem virginiamicina Na saída, houve maior abundância relativa das bactérias Clostridiales, Ruminococcaceae e Clostridium XIVa spp e menor abundância de Bifidobacterium spp nos animais que recebiam virginiamicina O confinamento causou mudanças importantes na composição e na estrutura da microbiota fecal, porém, a virginiamicina teve efeito mais evidente na composição, sugerindo que o antibiótico afetou as espécies raras presentes no intestino dos bovinos, mas não as espécies mais abundantes O GMD e o peso final não diferiram entre os animais suplementados com virginiamicina e os animais que não recebiam antibiótico Apenas 2% das E coli isoladas da chegada e ,2% da saída apresentaram resistência a algum antibiótico, sendo que o uso de virginiamicina não influenciou a taxa de resistência As diferenças encontradas entre os grupos G1 e G2 sugerem que as variações nas condições do estudo são importantes e podem afetar a microbiota intestinal Portanto, deve-se ter cautela quando da interpretação e da extrapolação dos resultados de diferentes estudosItem Produção, caracterização e avaliação da imunogenicidade do complexo protéico MSP1 recombinante (rMSP1a erMSP1b) de isolado paranaense do anaplasma marginaleTamekuni, Katia; Vidotto, Odilon [Orientador]; Garcia, João Luis; Alfieri, Amauri Alcindo; Vidotto, Marilda Carlos [Coorientadora]Resumo: O Anaplasma marginale (ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina Esta doença ocorre mundialmente, com maior freqüência nas regiões tropicais e subtropicais, determinando perdas econômicas consideráveis à pecuária bovina O A marginale possui seis proteínas principais de superfície designadas de MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 A proteína MSP1a tem massa molecular de 15kDa e a MSP1b de 1kDa Os objetivos deste trabalho foram clonar, produzir, caracterizar as MSP1a e MSP1b recombinantes (rMSP1a e rMSP1b) e avaliar a resposta imune humoral de camundongos imunizados com a Escherichia coli BL21 recombinante expressando estas proteínas Os genes msp1a e msp1b foram obtidos pela PCR de um isolado Paranaense de A marginale e clonados em vetores pET12 e pET11/D-TOPO, respectivamente Após a certificação da inserção dos genes nos vetores, as proteínas foram induzidas com IPTG e purificadas em colunas de resina ligadas ao níquel As proteínas rMSP1a e rMSP1b separadas em SDS-PAGE, reagiram com soros anti-rMSP1a e anti-rMSP1b produzidos em coelhos, pelo Western blotting, mostrando massas moleculares de 7kDa a 15kDa e 1kDa, respectivamente A BL21/rMSP1a e a BL21/rMSP1b aglutinaram as hemácias de bovinos e esta hemaglutinação foi inibida na presença de IgY anti-rMSP1a e anti-rMSP1b, confirmando a função de adesão destas proteínas A reação de IFI realizada com as IgY anti-rMSP1a e IgY anti-rMSP1b, produzidas em galinhas, demonstraram a presença destas proteínas na membrana externa das E coli BL21 recombinantes As BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b também foram utilizadas para imunizar camundongos Balb/c para avaliação de produção de IgG total e IgG2a, por meio de técnica de ELISA Os animais imunizados com BL21/rMSP1a tiveram uma forte resposta humoral (IgG total e IgG2a), enquanto que os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1b apresentaram uma fraca resposta após as três primeiras imunizações Pelo Western blotting foi detectado, resposta de IgG total contra as proteínas rMSP1a e rMSP1b Soros de camundongos imunizados com BL21/rMSP1a reagiram com a BL21 e rMSP1a com massas moleculares variando de 7 a 15 kDa e uma banda de 2 kDa sugerindo a quebra da proteína Soros de animais imunizados com a BL21/rMSP1b reagiram com a BL21 e rMSP1b com massa molecular de 1 kDa Os resultados deste trabalho confirmam o papel das MSP1a e MSP1b como adesinas no processo de invasão de eritrócitos e evidenciam a importância destas proteínas na elaboração de uma vacina de subunidades para o controle da anaplasmose bovina Também demonstram que as BL21 expressando as rMSP1a e a rMSP1b na membrana externa são capazes de produzir resposta imune em camundongosItem Utilização da PCR para o diagnóstico da leptospirose em cães naturalmente infectados por Leptospira sppAnzai, Eleine Kuroki; Freitas, Julio Cesar de [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Vasconcellos, Sílvio ArrudaResumo: A leptospirose canina é uma das principais zoonoses de distribuição mundial Nos cães, os sinais clínicos podem ser vagos ou inaparentes, não apresentando um quadro característico A gravidade das manifestações clínicas depende não somente da dose e virulência do sorovar infectante, como também da susceptibilidade do hospedeiro e dos órgãos e sistemas atingidos O diagnóstico da leptospirose pode ser realizado por diferentes técnicas laboratoriais, baseadas na detecção direta ou indireta do agente ou do material genético, porém todas elas apresentam inconvenientes para a sua utilização O presente trabalho teve como objetivo avaliar a técnica da PCR com os primers Lig1 e Lig2, que amplificam o fragmento de 468 pb da região amino-terminal dos genes ligA e ligB da Leptospira spp, em amostras de urina, fragmentos de rim, fígado e pulmão de 19 cães com suspeita clínica de leptospirose Amostras de sangue e urina foram coletadas durante o exame físico As amostras de sangue foram submetidas à técnica de soroaglutinação microscópica e as amostras de urina, ao exame direto da urina em microscopia de campo escuro e à técnica da PCR Os fragmentos de rim, fígado e pulmão coletados durante a necropsia foram processados e utilizados na PCR Resultados positivos foram encontrados na SAM , CE e PCR de fragmentos de rim e fígado de dois cães; na SAM, CE e PCR de fragmento de rim e amostra de urina de um cão, somente na PCR de fragmento de rim de um cão e somente na SAM de quatro cães Resultados negativos em todas as técnicas foram encontrados em 1 animais Este estudo mostrou a viabilidade do diagnóstico da leptospirose pela PCR utilizando os primers Lig1 e Lig2 em amostras biológicas de cães infectados naturalmente