02 - Mestrado - Ciência Animal
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Navegando 02 - Mestrado - Ciência Animal por Autor "Alfieri, Amauri Alcindo"
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Item Avaliação molecular parcial do gene da hemaglutinina do vírus da cinomose caninaNegrão, Fábio Juliano; Alfieri, Alice Fernandes [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Alfieri, Amauri Alcindo [Coorientador]Resumo: Urina e leucócitos de 56 cães com diagnóstico clínico de cinomose foram avaliados comparativamente pela técnica de Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR) para o gene da hemaglutinina (Gene H) do vírus da cinomose canina, urina e leucócitos de 56 cães com diagnóstico clínico de cinomose De acordo com a predominância dos sinais clínicos os cães foram distribuídos em três grupos (17=sistêmicos; 8=neurológicos e 31=sistêmicos e neurológicos) A amplificação do segmento de 721 pares de base foi possível em 45/56 cães Em 34/45 cães o CDV foi detectado tanto em urina e quanto em leucócito Em 11/45 cães somente um tipo de material biológico foi positivo (urina 1/45 e leucócito 1/45) A variedade de sinais clínicos da cinomose canina e a escolha do material pode gerar resultados falso negativos, principalmente em cães com sinais clínicos somente sistêmicos, grupo A onde 7/17 animais foram negativos quando comparados com 1/8 do grupo B e 3/31 do grupo C, é aconselhado o uso de no mínimo duas amostras biológicas para detectar o CDV Em outro estudo 27 cães positivos e 5 cães negativos pela técnica de RT-PCR para o gene da nucleoproteína do CDV (Gene N) foram distribuídos em quatro grupos (A= sinais clínicos sistêmicos; B= sinais clínicos neurológicos 8; sinais clínicos sistêmicos e neurológicos 9 e D= controle 5 cães) Para o ensaio de polimorfismo no tamanho dos fragmentos de restrição as enzimas Hinf I e Rsa I foram selecionadas para determinar o perfil de restrição do produto amplificado de 721 pb do gene H diretamente das amostras biológicas e das estirpes padrão Onderstepoort, Rockborn e Snyder Hill do CDV Todos os produtos da RT-PCR geraram com a enzima Hinf I dois fragmentos visualizados com 32 e 25 pb Com a enzima Rsa I todas as amostras de campo geraram dois fragmentos visualizados de 32 e 23 pb A estirpe Onderstepoort após a digestão com a enzima Rsa I foi cortado em 363 pb e 327 pb O perfil de restrição das estirpes Rockborn e Snyder Hill foi o mesmo com dois fragmentos de 363 e 358 pb, confirmando a análise computacional A estirpe Rockborn não apresenta a seqüência do gene H depositada em banco de dados público Os produtos da RT-PCR e da RFLP foram determinados por eletroforese em gel de agarose corado a 2% com brometo de etídio e os fragmentos de menor peso molecular não puderam ser visualizados A relação molecular demonstrada pela RFLP sugere que as amostras do CDV circulantes na região norte do Paraná seja diferente das estirpes padrão do CDV e essas diferenças no perfil de restrição podem caracterizar diferenças molecularesItem Mudanças na microbiota fecal de bovinos de corte causadas pelo confinamento e pela ingestão de virginiamicinaBessegatto, José Antonio; Lisbôa, Júlio Augusto Naylor [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Costa, Marcio Carvalho daResumo: Antibióticos são frequentemente fornecidos como promotores de crescimento para animais de produção Entretanto, as consequências desta prática sobre a microbiota intestinal e as mudanças ao longo do tempo são pouco entendidas O objetivo deste estudo foi caracterizar as mudanças na microbiota intestinal de bovinos de corte induzidas pelo confinamento e pelo uso da virginiamicina como antibiótico promotor de crescimento (APC) Dois grupos de bovinos em início de confinamento (G1 e G2) foram divididos em dois lotes de tratamento: um deles com virginiamicina (ATB) e outro como controle (CON) recebendo a mesma alimentação, sem o antibiótico O G1 era composto por 5 animais (machos e fêmeas) e o G2 por 36 animais, todos machos Amostras fecais foram coletadas na chegada, no meio (após período de adaptação de 25 dias) e na saída para o abate Cento e quarenta e quatro amostras foram utilizadas para a extração de DNA e sequenciamento da região V4 do gene 16S bacteriano utilizando a plataforma Illumina MiSeq Os animais foram pesados na entrada e na saída do confinamento para o cálculo de ganho médio diário (GMD), usado para comparação entre os animais CON e ATB de cada grupo Uma alíquota de cada amostra da chegada (36) e da saída (36) dos animais do G2 foi utilizada para determinar a susceptibilidade da bactéria Escherichia coli a diferentes antibióticos As bactérias do filo Firmicutes foram as mais abundantes durante todo o período experimental O filo Verrucomicrobia apresentou alta abundância relativa na chegada ao confinamento, mas foi suprimido pelas mudaças da dieta Proteobactérias aumentaram estatisticamente até o momento da saída Houve maior abundância relativa de Spirochaetes no meio do confinamento nos animais que recebiam virginiamicina no G1, enquanto no G2 Actinobacteria teve maior abundância relativa no meio e na saída nos animais do CON No G1, maior abundância relativa no meio do confinamento dos generos Treponema spp, Clostridium sensu stricto spp e Clostridium XI spp foi presente nos animais do ATB Enquanto no G2, maior abundância relativa de Bifidobacterium spp e menor de Clostridium XIVa spp foi observada no meio do confinamento nos animais que recebiam a dieta sem virginiamicina Na saída, houve maior abundância relativa das bactérias Clostridiales, Ruminococcaceae e Clostridium XIVa spp e menor abundância de Bifidobacterium spp nos animais que recebiam virginiamicina O confinamento causou mudanças importantes na composição e na estrutura da microbiota fecal, porém, a virginiamicina teve efeito mais evidente na composição, sugerindo que o antibiótico afetou as espécies raras presentes no intestino dos bovinos, mas não as espécies mais abundantes O GMD e o peso final não diferiram entre os animais suplementados com virginiamicina e os animais que não recebiam antibiótico Apenas 2% das E coli isoladas da chegada e ,2% da saída apresentaram resistência a algum antibiótico, sendo que o uso de virginiamicina não influenciou a taxa de resistência As diferenças encontradas entre os grupos G1 e G2 sugerem que as variações nas condições do estudo são importantes e podem afetar a microbiota intestinal Portanto, deve-se ter cautela quando da interpretação e da extrapolação dos resultados de diferentes estudosItem Produção, caracterização e avaliação da imunogenicidade do complexo protéico MSP1 recombinante (rMSP1a erMSP1b) de isolado paranaense do anaplasma marginaleTamekuni, Katia; Vidotto, Odilon [Orientador]; Garcia, João Luis; Alfieri, Amauri Alcindo; Vidotto, Marilda Carlos [Coorientadora]Resumo: O Anaplasma marginale (ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina Esta doença ocorre mundialmente, com maior freqüência nas regiões tropicais e subtropicais, determinando perdas econômicas consideráveis à pecuária bovina O A marginale possui seis proteínas principais de superfície designadas de MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 A proteína MSP1a tem massa molecular de 15kDa e a MSP1b de 1kDa Os objetivos deste trabalho foram clonar, produzir, caracterizar as MSP1a e MSP1b recombinantes (rMSP1a e rMSP1b) e avaliar a resposta imune humoral de camundongos imunizados com a Escherichia coli BL21 recombinante expressando estas proteínas Os genes msp1a e msp1b foram obtidos pela PCR de um isolado Paranaense de A marginale e clonados em vetores pET12 e pET11/D-TOPO, respectivamente Após a certificação da inserção dos genes nos vetores, as proteínas foram induzidas com IPTG e purificadas em colunas de resina ligadas ao níquel As proteínas rMSP1a e rMSP1b separadas em SDS-PAGE, reagiram com soros anti-rMSP1a e anti-rMSP1b produzidos em coelhos, pelo Western blotting, mostrando massas moleculares de 7kDa a 15kDa e 1kDa, respectivamente A BL21/rMSP1a e a BL21/rMSP1b aglutinaram as hemácias de bovinos e esta hemaglutinação foi inibida na presença de IgY anti-rMSP1a e anti-rMSP1b, confirmando a função de adesão destas proteínas A reação de IFI realizada com as IgY anti-rMSP1a e IgY anti-rMSP1b, produzidas em galinhas, demonstraram a presença destas proteínas na membrana externa das E coli BL21 recombinantes As BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b também foram utilizadas para imunizar camundongos Balb/c para avaliação de produção de IgG total e IgG2a, por meio de técnica de ELISA Os animais imunizados com BL21/rMSP1a tiveram uma forte resposta humoral (IgG total e IgG2a), enquanto que os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1b apresentaram uma fraca resposta após as três primeiras imunizações Pelo Western blotting foi detectado, resposta de IgG total contra as proteínas rMSP1a e rMSP1b Soros de camundongos imunizados com BL21/rMSP1a reagiram com a BL21 e rMSP1a com massas moleculares variando de 7 a 15 kDa e uma banda de 2 kDa sugerindo a quebra da proteína Soros de animais imunizados com a BL21/rMSP1b reagiram com a BL21 e rMSP1b com massa molecular de 1 kDa Os resultados deste trabalho confirmam o papel das MSP1a e MSP1b como adesinas no processo de invasão de eritrócitos e evidenciam a importância destas proteínas na elaboração de uma vacina de subunidades para o controle da anaplasmose bovina Também demonstram que as BL21 expressando as rMSP1a e a rMSP1b na membrana externa são capazes de produzir resposta imune em camundongosItem Utilização da PCR para o diagnóstico da leptospirose em cães naturalmente infectados por Leptospira sppAnzai, Eleine Kuroki; Freitas, Julio Cesar de [Orientador]; Alfieri, Amauri Alcindo; Vasconcellos, Sílvio ArrudaResumo: A leptospirose canina é uma das principais zoonoses de distribuição mundial Nos cães, os sinais clínicos podem ser vagos ou inaparentes, não apresentando um quadro característico A gravidade das manifestações clínicas depende não somente da dose e virulência do sorovar infectante, como também da susceptibilidade do hospedeiro e dos órgãos e sistemas atingidos O diagnóstico da leptospirose pode ser realizado por diferentes técnicas laboratoriais, baseadas na detecção direta ou indireta do agente ou do material genético, porém todas elas apresentam inconvenientes para a sua utilização O presente trabalho teve como objetivo avaliar a técnica da PCR com os primers Lig1 e Lig2, que amplificam o fragmento de 468 pb da região amino-terminal dos genes ligA e ligB da Leptospira spp, em amostras de urina, fragmentos de rim, fígado e pulmão de 19 cães com suspeita clínica de leptospirose Amostras de sangue e urina foram coletadas durante o exame físico As amostras de sangue foram submetidas à técnica de soroaglutinação microscópica e as amostras de urina, ao exame direto da urina em microscopia de campo escuro e à técnica da PCR Os fragmentos de rim, fígado e pulmão coletados durante a necropsia foram processados e utilizados na PCR Resultados positivos foram encontrados na SAM , CE e PCR de fragmentos de rim e fígado de dois cães; na SAM, CE e PCR de fragmento de rim e amostra de urina de um cão, somente na PCR de fragmento de rim de um cão e somente na SAM de quatro cães Resultados negativos em todas as técnicas foram encontrados em 1 animais Este estudo mostrou a viabilidade do diagnóstico da leptospirose pela PCR utilizando os primers Lig1 e Lig2 em amostras biológicas de cães infectados naturalmente