01 - Doutorado - Patologia Experimental

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A exposição ao cyantraniliprole prejudica parâmetros reprodutivos masculinos na idade juvenil e parâmetros femininos na idade adulta em ratos wistar
(2021-06-25) Scarton, Suellen Ribeiro da Silva; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Arena, Arielle Cristina; Ceravolo, Graziela Scalianti; Goes, Rejane Maira; Beu, Célia Cristina Leme
O Brasil é um dos países que mais utiliza agrotóxicos no mundo e conta com legislação favorável a liberação de compostos de ação pouco conhecida sobre o organismo de mamíferos ou banidos em outras regiões do mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do inseticida Cyantraniliprole sobre parâmetros reprodutivos masculino e feminino de ratos Wistar púberes e adultos, após autorização OF. CIRC. CEUA nº134/2017, processo n° CEUA-UEL 211.062017-4. Em todos os experimentos o Cyantraniliprole foi utilizado em baixa dose de 10 mg / kg (grupo Low dose – LD) ou alta dose 150 mg / kg (grupo High dose – HD), água de torneira foi utilizada como veículo. No primeiro experimento machos, no dia pós-natal (DPN) 21, foram distribuídos nos grupos LD, HD ou controle (C), que recebeu somente veículo. O exposição se iniciou no DPN25, via intragástrica e a eutanásia ocorreu por saturação anestésica no DPN67. Espermatozoides foram coletados do ducto deferente para as análises de atividade mitocondrial da peça intermediaria, atividade da colinesterase – ChE, peroxidação lipídica – LPO, atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase - G6PD e atividade da malato desidrogenase – MDH. No segundo experimento machos, DPN21, foram distribuídos nos grupos exposição: LD, HD e C. O tratamento se iniciou no DPN25, via intragástrica. A eutanásia de metade dos animais de cada grupo ocorreu por saturação anestésica no DPN67. Os outros animais de cada grupo foram mantidos vivos por mais 42 dias, sem receber o cyantraniliprole, originando os grupos recuperação, a eutanásia desses animais ocorreu por saturação anestésica no DPN110. De todos os grupos foram coletados plasma para determinação da concentração de testosterona. Os testículos foram pesados e utilizados para contagem espermática, avaliação do sistema antioxidante e de parâmetros histológicos e estereológicos. Espermatozoides do ducto deferente foram utilizados para avalição morfológica. No terceiro experimento, os efeitos do cyantraniliprole foram observados em fêmeas adultas, DPN67, distribuídas nos grupos C, LD e HD (n=6 por grupo). A eutanásia ocorreu no DPN95, foram coletados sangue, para dosagem de progesterona, útero e ovários para avaliação morfométrica e histopatológica, contagem de folículos ovarianos e marcadores bioquímicos de estresse oxidativo. Foi realizada a mensuração da massa (g) do fígado, rins, glândulas hipófise e adrenal. A concentração de progesterona e o peso do útero, ovário, fígado, rins, glândula adrenal e a foram maiores em LD. O número de ciclos estrais diminuiu e a duração do ciclo aumentou nos animais HD. O epitélio glandular do útero foi maior e o número de folículos ovarianos, primordial + primário, pré-antral, antral e atrésico foi reduzido em LD. A análise histopatológica revelou a ocorrência de metaplasia do epitélio luminal do útero com presença de mitose e polimorfismo das células do epitélio glandular, além da presença de infiltrado inflamatório no endométrio. Nos ovários, vasos sanguíneos congestos e hiperplasia da rete ovarii foram observados. A atividade da colinesterase no útero foi menor em ambas as doses. Maior ocorrência de lipoperoxidação e da atividade da enzima SOD ocorreram apenas em LD, e a atividade da GST foi aumentada em LD e HD. No ovário, a atividade da colinesterase foi aumentada nos animais tratados com ambas as doses, e a atividade da GPx foi maior apenas com LD. Como resultados observamos que no primeiro experimento a atividade mitocondrial e da MDH diminuíram nos espermatozoides expostos a LD, sem o aumento da peroxidação lipídica. A atividade da G6PDH e da ChE foram similar entre os grupos. No segundo experimento a atividade do sistema antioxidante entre os grupos exposição e recuperação foi similar, no entanto a produção de testosterona in vitro aumentou em LD e HD e diminuiu em LDR e HDR. O número de células de Sertoli foi menor em todos os grupos que receberam cyantraniliprole tanto na fase de exposição como na recuperação. A fase I-V do ciclo do epitélio seminífero foi aumentada e a fase VII-VIII, diminuída nos grupos que receberam o tratamento nos dois períodos. A proporção do lúmen e estroma foi maior, e do epitélio menor, apenas em LD, no entanto o número de espermatozoides por grama de testículo e a produção diária de espermatozoides foi diminuiu nos animais que receberam ambas as doses de cyantraniliprole, independente da fase do experimento. Como consequência o número de espermatozoides normais foi menor nos grupos que receberam Cyantraniliprole em relação ao controle. As principais anormalidades morfológicas observadas nos espermatozoides foram: falta de curvatura e cabeças isoladas, caudas quebradas e enroladas, e falta de integridade do acrossoma. No terceiro experimento, a concentração de progesterona e o peso do útero, ovário, fígado, rins, glândula adrenal foram maiores em LD. O número de ciclos estrais diminuiu e a duração do ciclo aumentou nos animais HD. O epitélio glandular do útero foi maior e o número de folículos ovarianos, primordial + primário, pré-antral, antral e atrésico foi reduzido em LD. A análise histopatológica revelou a ocorrência de metaplasia do epitélio luminal do útero com presença de mitose e polimorfismo das células do epitélio glandular, além da presença de infiltrado inflamatório no endométrio. Nos ovários, vasos sanguíneos congestos e hiperplasia da rete ovarii foram observados. A atividade da colinesterase no útero foi menor em ambas as doses. Maior ocorrência de lipoperoxidação e da atividade da enzima SOD ocorreram apenas em LD, e a atividade da GST foi aumentada em LD e HD. No ovário, a atividade da colinesterase foi maior nos animais tratados com ambas as doses, e a atividade da GPx foi maior apenas com LD. Esses resultados mostram que a baixa dose de cyantraniliprole prejudicou a membrana celular e a produção de energia dos espermatozoides e que os danos gerados pela exposição ao cyantraniliprole na puberdade foram mantidos ou acentuados, mesmo após o período de recuperação, ou seja, na vida adulta. O trato genital feminino também sofreu alterações, o que pode representar prejuízos fertilidade a esses indivíduos.
Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo e marcadores inflamatórios sistêmicos de pacientes com Carcinoma Papilífero de tireoide e tireoidite de Hashimoto residentes no Norte do Paraná
(2021-04-09) Lopes, Natália Medeiros Dias; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Seiva, Fabio Rodrigues Ferreira; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Andrade, Fábio Goulart de; Montoro, José Raphael de Moura Campos
O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia maligna endócrina mais incidente, com maior acometimento entre as mulheres. É dividido em diferentes subtipos, sendo o carcinoma papilífero da tireoide (CPT) o mais frequente. Outras alterações podem se desenvolver na tireoide, como as doenças autoimunes, cuja principal representante é a tireoidite de Hashimoto (TH). Desde 1955, quando foi descrito pela primeira vez uma possível relação entre TH e CT, vários estudos têm sido elaborados na tentativa de elucidar esta correlação, entretanto, ainda não foram totalmente esclarecedores. Sabendo-se que o estresse oxidativo (EO) está relacionado com o desenvolvimento de diversos tipos de câncer, bem como a participação de marcadores inflamatórios, o objetivo deste trabalho foi determinar a participação do EO e dos marcadores inflamatórios sistêmicos em pacientes com CPT e TH residentes no norte do Paraná. Após aprovação ética (CEP-UEL nº 2.793.785), foram coletadas amostras de 115 pacientes, divididos entre os grupos: BENIGNO (n=63), CPT (n=27), TH (n=15) e CPT+TH (n=10). Um questionário para avaliar as características clínico patológicas e uma amostra de tecido também foram coletados. Sessenta e três indivíduos saudáveis foram utilizados como controle. Quanto às análises de EO, foram avaliados nos eritrócitos os parâmetros de defesa antioxidante Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e Glutationa reduzida (GSH), além dos relacionados a lipoperoxidação, como a quimiluminescência induzida por terc-butil hidroperóxido e Malondialdeído (MDA), dosado no plasma. Os marcadores inflamatórios, interleucina-10 (IL-10), TGF-ß1 e TNF-a também foram analisados no plasma. No microambiente tumoral avaliamos marcadores de estresse oxidativo (3-nitrotirosina e 4-hidroxinonenal), além de ki-67 e VEGF. Os resultados da CAT e SOD demonstraram valor maior nos grupos com alteração da tireoide em relação ao grupo controle. Quanto a GSH, os grupos BENIGNO e CPT apresentaram valores reduzidos em relação ao controle. Quando apenas os grupos CPT e CPT+TH foram comparados, nenhuma diferença significativa foi encontrada quanto aos parâmetros de EO, bem como quanto aos resultados dos marcadores inflamatórios. A capacidade de conter a lipoperoxidação induzida foi menor e um alto nível de MDA plasmático foi observado no grupo CPT. Para a análise entre CPT e CPT+TH, a participação do EO foi mais pronunciada no grupo CPT. Na imunohistoquímica, foi encontrado maior marcação no grupo CPT quanto aos parâmetros analisados, quando comparado ao CPT+TH. Pacientes com CPT sem TH apresentam maiores níveis de EO e marcadores de proliferação e angiogênese, assim, apresentam cenário mais favorável a metástases, e possível pior prognóstico, do que pacientes com associação entre CPT e TH.
Baixas doses de malation prejudicam o desenvolvimento pós-natal dos sistema genital masculino e feminino de ratos: modelos in vitro e in vivo
(2022-07-07) Erthal, Rafaela Pires; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Perobelli, Juliana Elaine; Siervo, Glaucia Eloisa Munhoz de Lion; Delella, Flávia Karina
O malation é um inseticida da classe dos organofosforados amplamente utilizado na cultura agrícola e no meio urbano para controle das arboviroses, causados pelo mosquito transmissor Aedes aegypt. Crianças e adolescentes estão sendo expostos a esses compostos através da ingestão de alimentos contaminados ou inalação de gotículas. Diante da falta de informações específicas na literatura e da relevância clínica, social e política do assunto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se a exposição a baixas doses de malation pode comprometer a qualidade de espermatozoides, de folículos ovarianos, a função de células de Leydig e o desenvolvimento do sistema genital feminino. Para avaliar a qualidade espermática, 24 ratos machos foram organizados em 3 grupos experimentais: controle (veículo) e malation 10 (M10) ou 50 mg/kg (M50), doses consideradas baixas para a exposição animal. Os animais foram expostos do dia pós natal (DPN) 25-65. Ao final, foram submetidos à eutanásia para coleta de testículos, destinados à avaliação da expressão gênica, e de espermatozoides a partir dos epidídimos para posterior avaliação da função espermática e perfil oxidativo. Foi observada redução na expressão dos genes 17-ßHSD e de Receptores de Andrógenos (AR) em testículos, bem como comprometimento da integridade acrossômica de espermatozoides associado a perturbação na atividade de enzimas antioxidantes. Para avaliar o impacto do malation sobre a função de células de Leydig, células de Leydig da linhagem murina TM3 foram expostas às concentrações de 1, 10 ou 100 µM de malation por 24 horas. Após a exposição, foram avaliadas a viabilidade celular, concentrações de testosterona e de citocinas a partir do meio de cultura, bem como avaliação do perfil redox das células. Nessas condições experimentais, o malation comprometeu a viabilidade celular, reduziu a produção de testosterona pelas células de Leydig nas menores concentrações experimentais, desequilibrou os níveis de citocinas e o perfil oxidativo dessas células. Concluímos portanto que, o malation compromete a função das células de Leydig através da alteração do estado redox celular. Para avaliar os efeitos específicos do malation sobre o desenvolvimento de folículos pré-antrais, foi utilizado modelo in vitro em que fragmentos ovarianos provenientes de vacas Nelore foram cultivados por 44 horas em MEM suplementado com malation (500 ou 1000 µM). Após o cultivo, os fragmentos foram destinados à avaliação histológica e de perfil oxidativo, enquanto que o MEM foi utilizado para dosagem de estradiol. Nesse modelo, embora o perfil oxidativo não tenha sido alterado pela exposição ao malation, os níveis de estradiol foram reduzidos e foi observado comprometimento na integridade e morfometria de folículos pré-antrais. O último experimento abordou os efeitos de baixas doses de malation sobre o desenvolvimento pós-natal do sistema genital feminino. Para tanto, 30 ratas foram organizadas nos grupos controle, M10 ou M50 e expostas entre o DPN 22 e 60. Durante esse período, foi avaliada a instalação da puberdade. Ao final do período experimental, os animais foram submetidos à eutanásia para coleta de sangue destinado à dosagem de estradiol e de ovários e útero destinados à avaliação histológica, de perfil oxidativo e expressão gênica. Nesse modelo, embora a instalação da puberdade e os níveis de estradiol não tenham sido prejudicados pela exposição a baixas doses de malation, o inseticida comprometeu a integridade e morfometria ovariana e uterina através da alteração do perfil oxidativo e da expressão de genes relacionados com a regulação do ciclo celular, antiapoptóticos e de ação endócrina. A partir dos estudos supracitados, concluímos que o malation pode prejudicar a integridade de folículos e o desenvolvimento pós-natal dos sistemas reprodutor feminino e masculino através da alteração de perfil oxidativo e expressão de genes envolvidos nas vias de sinalização endócrina e de controle de proliferação celular.
Influência do consumo de sacarose e frutose sobre a morfologia e função do sistema reprodutor masculino de ratos Wistar
(2020-02-27) Alvarenga, Daniele Sapede; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Pinge, Marli Cardoso Martins; Gerardin, Daniela Cristina Ceccatto; Uchôa, Ernane Torres; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini
O aumento do consumo de açúcar é responsável pela incidência de hipertensão, obesidade e diabetes em crianças e adolescentes. O estilo de vida pode resultar em alterações nesses indivíduos quando adultos, afetando o desenvolvimento pós-natal do sistema reprodutor e prejudicando a fertilidade. O estresse oxidativo é o desequilíbrio entre elementos antioxidantes e oxidantes como os radicais livres. Dessa forma, níveis elevados de radicais livres estão envolvidos em diferentes processos patológicos. Alimentos ricos em componentes antioxidantes estão associados com uma melhor qualidade de vida. Pterostilbeno é um componente antioxidante das blueberries e tem demonstrado benefícios terapêuticos em várias doenças. Sendo assim, nós levantamos as hipóteses: se o alto consumo de frutose no período puberal poderia afetar a fase adulta; e se a administração alta de sacarose na fase adulta afeta o sistema reprodutor e o uso de antioxidantes melhora os efeitos gerados. Para isso, ratos Wistar machos (30 dias de idade) foram distribuídos em quatro diferentes grupos: Fr30, que receberam frutose (20%) na água por 30 dias; Re-Fr60, que receberam frutose (20%) por 30 dias e permaneceram por mais 60 dias sem o tratamento; e dois grupos controles C30 e Re-C60, com água ad libitum. No segundo modelo experimental, ratos Wistar machos (60 dias de idade) foram tratados com solução de sacarose (40%) ou água por 150 dias e distribuídos em quatro grupos: grupo Controle; Pterostilbeno (40mg/kg por gavagem); Sacarose (40%) na água; Sacarose (40%) + Pterostilbeno (40mg/kg) por mais 45 dias. Frutose induziu um aumento de túbulos seminíferos anormais com vacúolos epiteliais, degeneração e células imaturas no lúmen, além disso, aumentou a produção diária de espermatozoides (DSP). Após descontinuar o tratamento, a DSP e o número de espermatozoides diminuiu significativamente. Sacarose induziu estresse oxidativo reduzindo túbulos seminíferos normais, células de Leydig e Sertoli e o número de espermatozoides normais. No entanto, o tratamento com pterostilbeno não foi eficiente em reduzir a peroxidação lipídica nos testículos. Nós concluímos que o consumo de frutose em ratos peribuberais leva a alterações no sistema reprodutor observadas na fase adulta; e o tratamento com pterostilbeno não foi eficiente em reduzir os danos oxidativos nos testículos causados pelo alto consumo de sacarose.

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