01 - Doutorado - Patologia Experimental

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Análise da produção de anticorpos IgY das características histológicas do baço e da medula óssea de galinhas poedeiras inoculadas com venenos de serpentes
Andrade, Fábio Goulart de; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Loyola, Wagner; Ramos, Solange de Paula; Itano, Eiko Nakagawa; Pavanelli, Wander Rogério
Resumo: Acidentes ofídicos são causados principalmente por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e tratados pela administração de antissoro de mamíferos Como alternativa a este procedimento, a utilização de anticorpos IgY antiveneno produzidos em galinhas poedeiras tem sido avaliada nos últimos anos Neste trabalho foram realizados dois experimentos No primeiro experimento, foi investigada a participação do baço e da medula óssea na produção de anticorpos IgY em galinhas poedeiras white leghorn (Gallus gallus domesticus) imunizadas com veneno crotálico Amostras de soro e gema foram coletadas durante o experimento, para análise da produção de anticorpos IgY Ao final deste, o baço e a medula óssea dos animais foram coletados e submetidos à análise histológica Os resultados mostraram um aumento dos anticorpos IgY crotálico no soro e na gema, a partir do 32º dia após a primeira imunização Estes níveis permaneceram elevados à medida que foram administradas doses de reforço do veneno usado como antígeno A inoculação de veneno crotálico em galinhas poedeiras induziu a produção de anticorpos IgY, principalmente na polpa branca perielipsoidal do baço e também no espaço extravascular da medula óssea No segundo experimento, galinhas poedeiras foram imunizadas com venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus e observadas durante 367 dias Os anticorpos IgY antiveneno foram coletados no soro e na gema dos ovos e avaliados segundo os seguintes parâmetros: níveis, avidez, padrão de reconhecimento antigênico e eficácia Os níveis de anticorpos IgY antibotrópico anticrotálico produzidos aumentaram significativamente após a segunda imunização e assim permaneceram até o final do experimento Índices significativamente elevados de avidez foram observados para anticorpos IgY antibotrópico no 142º dia e para anticorpos IgY anticrotálico no 232º dia após a primeira imunização Os anticorpos IgY antibotro pico reconheceram antí genos de massa molecular de 25 kDa e 5 kDa, enquanto os anticorpos IgY anticrota lico reconheceram principalmente antí genos de massa molecular de 14 kDa e 3 kDa Os antí genos foram mais bem reconhecidos ao final do perí odo experimental Utilizando amostras de soluções aquosas de anticorpos com concentração proteica de 15 mg/ml verificou-se que a solução contendo IgY antibotrópico apresentou eficiência 29µl/3DL5 e potência ,37mg/ml As amostras de solução aquosa contendo anticorpos IgY anticrotálico apresentaram eficiência 246µl/4DL5 e potência de ,829 mg/ml A produção de anticorpos IgY antibotrópico e anticrotálico pôde ser melhorada mediante administração de sucessivas doses dos venenos durante período de imunização superior a 6 meses, afim de se atingirem níveis de anticorpos e índices de avidez mais elevados A avidez elevada e a maior concentração dos anticorpos IgY antiveneno permitiram a neutralização de componentes tóxicos dos venenos inoculados, impedindo seus efeitos letais, sugerindo que estes anticorpos tenham aplicabilidade no tratamento de acidentes ofídicos
Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo e marcadores inflamatórios sistêmicos de pacientes com Carcinoma Papilífero de tireoide e tireoidite de Hashimoto residentes no Norte do Paraná
(2021-04-09) Lopes, Natália Medeiros Dias; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini; Seiva, Fabio Rodrigues Ferreira; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Andrade, Fábio Goulart de; Montoro, José Raphael de Moura Campos
O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia maligna endócrina mais incidente, com maior acometimento entre as mulheres. É dividido em diferentes subtipos, sendo o carcinoma papilífero da tireoide (CPT) o mais frequente. Outras alterações podem se desenvolver na tireoide, como as doenças autoimunes, cuja principal representante é a tireoidite de Hashimoto (TH). Desde 1955, quando foi descrito pela primeira vez uma possível relação entre TH e CT, vários estudos têm sido elaborados na tentativa de elucidar esta correlação, entretanto, ainda não foram totalmente esclarecedores. Sabendo-se que o estresse oxidativo (EO) está relacionado com o desenvolvimento de diversos tipos de câncer, bem como a participação de marcadores inflamatórios, o objetivo deste trabalho foi determinar a participação do EO e dos marcadores inflamatórios sistêmicos em pacientes com CPT e TH residentes no norte do Paraná. Após aprovação ética (CEP-UEL nº 2.793.785), foram coletadas amostras de 115 pacientes, divididos entre os grupos: BENIGNO (n=63), CPT (n=27), TH (n=15) e CPT+TH (n=10). Um questionário para avaliar as características clínico patológicas e uma amostra de tecido também foram coletados. Sessenta e três indivíduos saudáveis foram utilizados como controle. Quanto às análises de EO, foram avaliados nos eritrócitos os parâmetros de defesa antioxidante Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e Glutationa reduzida (GSH), além dos relacionados a lipoperoxidação, como a quimiluminescência induzida por terc-butil hidroperóxido e Malondialdeído (MDA), dosado no plasma. Os marcadores inflamatórios, interleucina-10 (IL-10), TGF-ß1 e TNF-a também foram analisados no plasma. No microambiente tumoral avaliamos marcadores de estresse oxidativo (3-nitrotirosina e 4-hidroxinonenal), além de ki-67 e VEGF. Os resultados da CAT e SOD demonstraram valor maior nos grupos com alteração da tireoide em relação ao grupo controle. Quanto a GSH, os grupos BENIGNO e CPT apresentaram valores reduzidos em relação ao controle. Quando apenas os grupos CPT e CPT+TH foram comparados, nenhuma diferença significativa foi encontrada quanto aos parâmetros de EO, bem como quanto aos resultados dos marcadores inflamatórios. A capacidade de conter a lipoperoxidação induzida foi menor e um alto nível de MDA plasmático foi observado no grupo CPT. Para a análise entre CPT e CPT+TH, a participação do EO foi mais pronunciada no grupo CPT. Na imunohistoquímica, foi encontrado maior marcação no grupo CPT quanto aos parâmetros analisados, quando comparado ao CPT+TH. Pacientes com CPT sem TH apresentam maiores níveis de EO e marcadores de proliferação e angiogênese, assim, apresentam cenário mais favorável a metástases, e possível pior prognóstico, do que pacientes com associação entre CPT e TH.
Marcadores de estresse oxidativo, inflamação e hipóxia no carcinoma papilífero de tireoide
(2025-04-24) Cavalcanti, Liara Freitas; Cecchini, Rubens; Venâncio, Emerson José; Andrade, Fábio Goulart de; Armani, André; Luiz, Rodrigo Cabral
O carcinoma papilífero de tireoide (CPT) é a neoplasia endócrina mais comum, representando de 80% a 90% dos casos de câncer de tireoide. Apesar do bom prognóstico, alguns casos apresentam risco de recorrência e metástases. Evidências sugerem que a patogênese do CPT está associada a fatores como estresse oxidativo, inflamação crônica e hipóxia, que atuam em sinergia para promover danos celulares, instabilidade genômica e adaptação tumoral ao microambiente. A inflamação, frequentemente exacerbada no contexto de estresse, pode levar a secreção de citocinas e quimiocinas que favorecem a proliferação celular, angiogênese e evasão do sistema imune. Nesse contexto, a hipóxia atua como um fator adicional, levando a adaptação metabólica, angiogênese e resistência celular no microambiente tumoral. Portanto, o presente estudo buscou investigar a presença desses fatores no CPT comparando com neoplasias benignas. Como objetivo secundário, buscou-se relatar um caso atípico da doença para contribuir com a literatura acerca do assunto. Para o primeiro objetivo, duas coortes de pacientes foram analisadas, divididas em dois grupos: benigno e CPT. Na primeira, avaliou-se o estresse oxidativo sistêmico em amostras de plasma (carbonilação de proteínas, peróxido de hidrogênio [H2O2], e tiol total), bem como os níveis de citocinas e quimiocinas Na segunda coorte, o estresse oxidativo (catalase, glutationa reduzida [GSH] e hidroperóxidos de membrana) foi analisado em amostras de tecido tireoidiano normal, benigno e CPT. Além disso, a presença de marcadores de estresse foi analisada nesses tecidos por imunofluorescência (fator induzível por hipóxia 1-alfa [HIF-1a], fator nuclear eritróide 2-related factor 2 [Nrf2] e glutationa peroxidase 3 [GPx3]). Os resultados mostraram que os marcadores de estresse oxidativo na primeira coorte estavam mais elevados no grupo CPT. Contudo, na segunda coorte, não houve diferença significativa entre os grupos. Em relação aos marcadores inflamatórios plasmáticos da primeira coorte, apenas a quimiocina regulada pelo timo e pela ativação (TARC) apresentou níveis plasmáticos mais elevados no grupo benigno, enquanto outras citocinas e quimiocinas não mostraram diferenças significativas entre os grupos. A intensidade de marcação de HIF-1a, Nrf2, e GPx3 foi significativamente mais intensa no grupo PTC da segunda coorte, evidenciando o ambiente de estresse oxidativo nesses tumores. Em conclusão, os achados desse trabalho destacam a importância do estresse oxidativo como potencial marcador para diferenciar tumores benignos do CPT, enquanto o resultado da imunofluorescência ressalta a participação do estresse oxidativo na patogênese dessa doença. Além dos resultados evidenciados nas coortes de pacientes, o presente estudo também contribui com o relato de um caso atípico de carcinoma papilífero de tireoide de variante folicular infiltrativa. O paciente apresentou sinais e sintomas iniciais inespecíficos, evoluindo rapidamente para insuficiência respiratória e parada cardiorrespiratória. A confirmação diagnóstica revelou um tumor invasivo com extensão para estruturas adjacentes. A evolução clínica favorável sugere que, mesmo em casos avançados, intervenções terapêuticas adequadas podem controlar a progressão da doença. Os resultados do primeiro artigo contribuem para uma compreensão mais profunda da interação entre estresse oxidativo, inflamação e progressão tumoral no CPT, fornecendo bases para futuras abordagens terapêuticas e prognósticas. E, por fim, o relato amplia o conhecimento sobre as apresentações clínicas atípicas do CPT, contribuindo para o reconhecimento precoce e manejo clínico mais eficiente
Resposta oxidativa in vitro e in vivo do uso da metformina no tratamento do melanoma murino (B16F10)
Sanches, Larissa Juliani; Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]; Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves; Armani, André; Costa, Idessania Nazareth; Andrade, Fábio Goulart de; Marinello, Poliana Camila [Coorientadora]
Resumo: O melanoma, tem origem nos melanócitos e sua incidência vem crescendo nas últimas décadas, resultado da interação de fatores de risco genéticos (como mutação em BRAF) e ambientais (como exposição à radiação UV, por exemplo) Quando diagnosticado precocemente, o tratamento mais indicado é a remoção cirúrgica, porém quando encontra-se metastizado para linfonodos ou órgãos distantes é comum ser refratário aos tratamentos, levando a uma baixa sobrevida O melanoma é resistente a grande parte dos tratamentos disponíveis até o presente momento e alguns processos estão associados a essa resistência A resistência intrínseca envolve a regulação positiva de receptores tirosina quinase e a reativação de MAPK, enquanto a resistência adquirida tardiamente está relacionada com mutações concorrentes em RAS ou MEK, amplificação da forma mutante de BRAF ou splicing alternativo O estresse oxidativo está intimamente relacionado aos processos de iniciação, proliferação e metástase do câncer bem como na resistência à terapia Estudos com a metformina tem mostrado que esta pode exercer uma ação na inibição do desenvolvimento do câncer A metformina é atualmente o medicamento mais prescrito mundialmente para o tratamento do diabetes tipo 2 No câncer a metformina atua nas vias de sinalização LKB1 – AMPK e mTOR A inibição do mTOR perturba a síntese de proteínas, ocasionando uma ação antineoplásica direta nas células tumorais, através da inibição da progressão do ciclo celular e indução da apoptose e autofagia Outros estudos, mostram que a metformina desencadeia a apoptose através da regulação negativa de Bcl-2, ativando Bax, p53, desencadeando apoptose através de sinalização da ERK, dependentes e independentes de caspases, inibindo o proto-oncogene c-MYC e HIF-1a via AMPK Com base nos efeitos promissores da metformina e na resistência do melanoma aos tratamentos disponíveis, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da metformina em células de melanoma murino metastático B16F1 em dois modelos experimentais: in vitro e in vivo No modelo in vitro, analisamos a participação da metformina no processo de indução de resistência à dacarbazina (DTIC) Para isso um fenótipo de resistência à DTIC foi induzido em células B16F1 A indução da resistência foi feita através da exposição das células a concentrações crescentes de DTIC As células foram plaqueadas em garrafas de 25cm2 na concentração de 1x16 e expostas a DTIC (1µg / mL, 1µg / mL, 25µg / mL, 5µg / mL, 75µg / mL, 1 µg / mL e 125 µg / mL) As células foram consideradas resistentes quando a exposição a DTIC não causava sua morte Para analisar a interferência da metformina no processo de indução de resistência, as células foram pré-tratadas com metformina (6 µM) durante 7 passagens e então foram induzidas à resistência a DTIC, grupo denominado MET-DTIC As células foram coletadas em todas as passagens, para a análise de marcadores de estresse oxidativo 8-OH-DG, p53, Nrf2 e NF-kB Os resultados revelam que o fenótipo de resistência a DTIC nas células B16F1 foi induzido com o protocolo experimental utilizado e que a metformina é capaz de atenuar este processo de indução de resistência Além de prevenir a indução de resistência a metformina atua aumentando os níveis de antioxidantes celulares e modula vias de sinalização importantes para a quimiorresistência, aumentando a marcação nuclear de p53 e reduzindo a marcação nuclear de NF?B e Nrf2 Na avaliação do efeito da metformina no melanoma in vivo, dois objetivos distintos foram trabalhados: primeiramente foi avaliado o efeito da metformina no tratamento do melanoma metastático, bem como sua ação em conjunto com o quimioterápico DTIC, em um segundo momento, avaliamos a ação da metformina na implantação das células tumorais no pulmão Para responder o primeiro objetivo, os animais foram inoculados com células B16F1 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo (C+), onde os animais não foram tratados; grupo Metformina (MET), tratado com metformina na concentração de 2mg ip do 1o ao 14o dia; Grupo Dacarbazina (DTIC), tratado com dacarbazina concentração de 5mg/kg ip do 5º ao 1º dia; grupo Metformina + Dacarbazina (MET-DTIC), tratado com metformina e dacarbazina nas mesmas condições mencionadas acima; e grupo controle negativo (C-), em que os animais foram inoculados com meio de cultura (DMEM) sem soro e não receberam tratamento Para o segundo objetivo, todos os animais foram tratados com metformina na concentração de 2mg ip durante 5 dias, após esse período os animais foram inoculados com células B16F1 4x16 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo PTM (C+), PTM (MET), PTM (DTIC) e PTM (MET-DTIC), seguindo os mesmos protocolos de tratamento descritos para o primeiro objetivo Nos dois protocolos experimentais, os animais foram pesados durante todo o tempo experimental e o consumo de ração por animal em cada grupo foi calculado Após os 14 dias de experimento, os animais foram eutanásiados e foi realizada a punção cardiaca para a análise sistêmica e a retirada cuidadosa dos pulmões Foram realizadas as contagens de nódulos metástaticos em todos os pulmões Foram realizadas análises de estresse oxidativo no microambiente tumoral e sistêmico A arquitetura pulmonar e marcadores de vias de sinalização envolvidas com proliferação, estresse oxidativo e morte celular também foram analisados devido à sua relação com a resistência aos tratamentos disponíveis Os resultados demonstram que a metformina tem um importante papel na modulação de importantes vias de sinalização, como a p53, PCNA e Nrf2, interferindo assim no estresse oxidativo e culminando em uma ação antitumoral e antimetastática Diminuindo assim o número de nódulos metastáticos quando utilizada isoladamente e potencializando o efeito da DTIC, além de diminuir os efeitos colaterais do quimioterápico Dessa forma pode-se concluir que a metformina tem um potencial terapêutico por apresentar atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo de melanoma murino, estudados com as células B16F1 Essa atividade é acompanhada pela modulação de vias importantes para a viabilidade de células tumorais como, estresse oxidativo, crescimento e morte celular resposáveis, em parte, pela resistência do melanoma a quimioterápicos atualmente disponíveis
Tratamento com benznidazol em combinação com aspirina durante a fase aguda da doença de Chagas experimental : avaliação cardiovascular e lesões cardíacas típicas na fase crônica
Pereira, Rito Santo; Pinge Filho, Phileno [Orientador]; Kwasniewski, Fábio Henrique; Bidóia, Danielle Lazarin; Andrade, Fábio Goulart de; Ceravolo, Graziela Scalianti; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Coorientadora]
Resumo: A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma das principais causas de morte por cardiomiopatia e insuficiência cardíaca nos países da América Latina O tratamento da doença de Chagas tem como objetivo eliminar o parasito, diminuir a probabilidade de cardiomiopatia e interromper o ciclo de transmissão da doença O benznidazol (BZ) e o nifurtimox (Nfx) são reconhecidos como medicamentos efetivos para o tratamento da doença de Chagas pela Organização Mundial da Saúde, mas ambos apresentam alta toxicidade e eficácia limitada, especialmente na fase crônica da doença Em doses baixas, foi relatado que a aspirina (ASA) protege contra a infecção por T cruzi Administramos BZ em combinação com ASA em doses baixas durante a fase aguda da doença e avaliamos aspectos cardiovasculares e lesões cardíacas na fase crônica O tratamento com ASA evitou a disfunção cardiovascular (hipertensão e taquicardia) e lesões cardíacas típicas Além disso, os camundongos tratados com BZ+ASA apresentaram área fibrótica cardíaca menor do que a dos camundongos tratados com BZ Estes resultados foram associados ao aumento no número de eosinófilos, reticulócitos e no nível de óxido nítrico no plasma e tecido cardíaco de camundongos tratados com ASA em relação aos respectivos controles Esses efeitos da ASA e BZ+ASA em camundongos infectados cronicamente foram inibidos pelo pré-tratamento com o antagonista do receptor LXA4, Boc-2, indicando que os efeitos protetores da ASA são mediados pela lipoxina desencadeada por ASA Esses resultados enfatizam a importância de explorar novas combinações de medicamentos para tratamento da fase aguda da doença de Chagas que são benéficas para pacientes crônicos

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