Fusarium verticillioides : identificação de antígeno espécie-específico e desenvolvimento de PCR-ELISA para detecção do fungo

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dc.contributor.advisorOno, Mário Augusto [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorOmori, Aline Myukipt_BR
dc.contributor.bancaSantos, Joice Sifuentes dospt_BR
dc.contributor.bancaSartori, Danielept_BR
dc.contributor.bancaItano, Eiko Nakagawapt_BR
dc.contributor.bancaWatanabe, Maria Angelica Eharapt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T15:03:01Z
dc.date.available2024-05-01T15:03:01Z
dc.date.created2017.00pt_BR
dc.date.defesa27.04.2017pt_BR
dc.description.abstractResumo: Fusarium verticillioides é o principal patógeno de milho e pode causar desde uma infecção assintomática até o apodrecimento de todas as partes da planta Além disso, esse fungo é o principal produtor de fumonisinas, que estão relacionadas a doenças em humanos e animais Os métodos tradicionais utilizados para detectar fungos baseado em suas características morfológicas são demorados e apresentam baixa especificidade e sensibilidade A identificação e a caracterização de possíveis antígenos espécie-específicos com potencial para serem utilizados em métodos imunológicos bem como o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos para detecção desse fungo são importantes para o controle de qualidade do milho destinado à alimentação humana e animal Portanto, os objetivos deste trabalho foram identificar e caracterizar um antígeno de 67 kDa possivelmente espécie-específico de F verticillioides e desenvolver uma PCR-ELISA baseada no gene FUM21 A proteína de 67 kDa (p67) foi analisada por espectrometria de massa e sua atividade enzimática foi determinada em gel de poliacrilamida copolimerizado com amido, gelatina e soro albumina bovina A PCR-ELISA foi desenvolvida utilizando primers e sonda específicos para o gene FUM21 A especificidade da PCR-ELISA e da PCR convencional foi determinada analisando DNA de isolados de F verticillioides, F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, Aspergillus niger, A ochraceus, A carbonarius e Penicillium variabile e a sensibilidade dos métodos foi avaliada utilizando concentrações de 25 fg a 25 ng de DNA de F verticillioides 13G O efeito de matriz e a sensibilidade da PCR-ELISA e da PCR convencional em milho também foram analisados inoculando de 1 a 17 conídeos de F verticillioides 13G em milho triturado Duas possíveis proteínas resultaram da análise da p67 por espectrometria de massa: a proteína relacionada ao precursor da aminopeptidase Y de F fujikuroi e a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A análise da atividade enzimática da p67 revelou que a proteína apresenta atividade de amilase, sugerindo, portanto, que a p67 é a provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides A PCR-ELISA não apresentou positividade com DNA de F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, A niger, A ochraceus, A carbonarius e P variabile, e foi capaz de detectar cinco isolados de F verticillioides apresentando sensibilidade de 2,5 pg e 14 conídeos/g para DNA de cultura pura e para DNA de milho inoculado com suspensão de conídeos de F verticillioides, respectivamente, sendo 1 vezes mais sensível do que a PCR convencional Portanto, a p67 foi identificada como provável glicoamilase GMY2 de F verticillioides o que permitirá a produção dessa proteína em sua forma recombinante em larga escala visando o desenvolvimento de método imunológico espécie-específico A PCR-ELISA foi específica para F verticillioides, foi mais sensível que a PCR convencional e apresentou potencial para ser utilizada na detecção de F verticillioides em amostras de milhopt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Fusarium verticillioides is the main pathogen of maize and could cause since an asymptomatic infection until rotting of all parts of the plant Besides that, this fungus is the main producer of fumonisins, which are related to diseases in humans and animals The traditional methods used to detect fungi based on their morphological characteristics are time-consuming and present low sensitivity and specificity The identification and characterization of specie-specific antigens with potential to be used in immunological methods as well as the development of rapid, sensitive and specific methods for detection of this fungus are important for the quality control of the maize intended for human and animal consumption Therefore, the objectives of this study were to identify and to characterize a possible specie-specific antigen of F verticillioides and to develop a PCR-ELISA based on FUM21 gene of this fungus The 67 kDa protein (p67) was analyzed by mass spectrometry and its enzymatic activity was determined in polyacrylamide gel copolymerized with starch, gelatine and bovine serum albumine PCR-ELISA was developed using specific primers and probe for the FUM21 gene The specificity of PCR-ELISA and conventional PCR was determined by analyzing DNA from F verticillioides, F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, Aspergillus niger, A ochraceus, A carbonarius and Penicillium variabile isolates and the sensitivity of the methods was evaluated using amounts from 25 fg to 25 ng of F verticillioides 13G DNA The matrix effect and the sensitivity of PCR-ELISA and conventional PCR in maize were analyzed by inoculating from 1 to 17 conidia of F verticillioides 13G in ground corn Two possible proteins resulted from the p67 analysis by mass spectrometry: protein related to aminopeptidase Y precursor of F fujikuroi and putative glucoamylase GMY2 of F verticillioides The analysis of p67 enzymatic activity showed that the protein presents amylase activity, suggesting, therefore, that the p67 is the putative glucoamylase GMY2 of F verticillioides PCR-ELISA showed no positivity with DNA of F graminearum, F proliferatum, F subglutinans, A niger, A ochraceus, A carbonarius, P variabile and was able to detect five isolates of F verticillioides and presented detection limits of 25 pg and 14 conidia/g for DNA of pure culture and for DNA of maize inoculated with conidia suspension of F verticillioides, respectively, and was 1 folds more sensitive than conventional PCR Therefore, the p67 was identified as putative glucoamylase GMY2 of F verticillioides which will allow the production of this protein in its recombinant form on a large scale aiming the development of specie-specific immunological method Moreover, the developed PCR-ELISA was specific, more sensitive when compared to the conventional PCR and showed potential to be used in the detection of F verticillioides isolates in maize samplespt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Patologia Experimental) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Bioloógicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimentalpt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/16187
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenamePatologia Experimentalpt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Biológicaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Patologia Experimentalpt_BR
dc.subjectFusariopt_BR
dc.subjectFungos toxigênicospt_BR
dc.subjectAntígenos de fungospt_BR
dc.subjectEnzimaspt_BR
dc.subjectFusariumpt_BR
dc.subjectToxigenic fungipt_BR
dc.subjectFungal antigenspt_BR
dc.titleFusarium verticillioides : identificação de antígeno espécie-específico e desenvolvimento de PCR-ELISA para detecção do fungopt_BR
dc.typeTesept_BR

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