Estratégias inovadoras no controle de toxinas naturais: levedura recombinante para biodegradação de microcistinas e método para monitoramento de aflatoxinas em queijo minas frescal

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dc.contributor.advisorHirooka, Elisa Yoko
dc.contributor.authorSilva, Fernando de Godoi
dc.contributor.bancaMagnani, Marciane
dc.contributor.bancaNóbrega, Gisele Maria de Andrade de
dc.contributor.bancaKuroda, Emília Kiyomi
dc.contributor.bancaOliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de
dc.contributor.coadvisorLopes, Daiane Dias
dc.coverage.extent132 p.
dc.coverage.spatialLondrina
dc.date.accessioned2026-08-28T15:18:15Z
dc.date.available2026-08-28T15:18:15Z
dc.date.issued2024-09-06
dc.description.abstractToxinas naturais, contaminantes inevitáveis em alimentos e água, constituem perigo crescente ao mundo globalizado com impacto direto à saúde humana, prejuízos econômicos e, restrição na disponibilidade de alimentação segura à população. Medidas de controle visam constante monitoramento e procedimentos de descontaminação para assegurar o abastecimento, seja de água ou de matéria-prima agropecuária comsegurança ratificada a níveis oficialmente recomendados. Cianotoxinas e micotoxinas, metabólitos secundários microbianos, se destacam pela prevalência de contaminação e toxicidade. Microcistinas (MCs), cianotoxinas hepatotóxicas de ocorrência principal em água são produzidas por cianobactérias. Por outro lado, as aflatoxinas (AFs), micotoxinas de Aspergillusspp., com ênfase na AFB1, são cancerígenos comprovados do grupo 1 (IARC) alvos de regulamentação pelo agronegócio internacional. Visando contribuição ao controle de MCs e AFs, este trabalho apresenta três tópicos: (i) Avanço na tecnologia de DNA recombinante e desenvolvimento de alternativa para biodegradação de MCs por cepa GRAS de Saccharomyces cerevisiaebaseada na expressão de gene mlrAcódon-otimizado para levedura. (ii) Caracterização da microcistinase A recombinante perante biodegradação de MCs. (iii) Disponibilização de ferramentas de controle de toxinas naturais, com foco no monitoramento de AFs e análise em amostras de queijo Minas frescal. No primeiro tópico, o gene mlrA,codificador da enzima microcistinase A que lineariza e reduz a toxicidade de MCs, foi confeccionado com base no genoma de Sphingosinicella microcystinivoranscepa B9 para recombinação gênica e expressão em S. cerevisiae. Um primeiro plasmídeo contendo promotor e terminador de S. cerevisiaee sítio múltiplo de clonagem foi utilizado para expressão. O segundo plasmídeo contendo regiões de homologia para o locus URA3foi usado para integração cromossomal de mlrA. O sucesso nas técnicas de expressão plasmidial e integração cromossomal do gene foram confirmadas por PCR. A levedura recombinante PE-2 com expressão plasmidial de mlrA biodegradou 69,6% (205ng/mL) de MCs em 72 horas e 83% (267ng/mL) em 120 horas de cultivo, comprovando a eficácia desta alternativa biotecnológica. No experimento seguinte (tópico ii) avaliou-se a atividade da microcistinase A gerada a partir do primeiro experimento. De início foram testados diferentes métodos de lise da parede celular, obtendo extrato concentrado em enzima. Na avaliação da cinética enzimática foi obtida taxa máxima de degradação de MC de 3,09mg/L/h e constante de Michaelis-Menten de 2,81µM. Alta atividade da enzima foi observada em pH neutro e em temperatura na faixa 35-57,5ºC. Em pH alcalino e temperaturas >65ºC a enzima foi inativada. Condições ótimas de atividade foram definidas em pH 6,3 e 42,2ºC. Em suma, a levedura recombinante gerada demonstrou alto potencial de expressão da microcistinase A, cujos dados fornecem base científica-tecnológica a avanços na biodegradação de MCs. No último experimento (tópico iii) foi desenvolvido e validado um método de UPLC-FLR para detecção simultânea de AFM1e AFB1em queijo minas frescal. Os resultados da validação foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados: linearidade (R²>0,99), exatidão (recuperação média: 81-105% para AFM1; 80-109% para AFB1), precisão (RSD<18%), e baixo limite de quantificação (0,03µg/kg para AFM1e 0,31µg/kg para AFB1). Ainda que nenhuma das 20 amostras analisadas de queijo minas frescal tenha apresentado contaminação detectável, salienta-se que o método validado, implementado como ferramenta de monitoramento, contribui para garantir a segurança e agregar valor a este produto essencialmente nacional. Assim, o trabalho executado atingiu os objetivos, propondo novas opções ao controle de toxinas naturais de ocorrência universal em dois recursos interdependentes – água e alimentos, essenciais ao desenvolvimento e saúde humana. Os dados aqui apresentados poderão fundamentar avanços em estudos, promover aplicações práticas e aprimorar os métodos de controle de toxinas naturais, visando reduzir impactos destes contaminantes na saúde pública
dc.description.abstractother1Natural toxins of food and water pose an emerging threat to the globalized world with direct impacts on human health, economic losses, and reduced availability of safe food for the population. Control measures aim to implement constant monitoring and decontamination procedures to ensure the supply of both water and agricultural products, within safety levels recommended by official standards. Cyanotoxins and mycotoxins, microbial secondary metabolites, stand out due to their prevalence of contamination and toxicity. Microcystins (MCs), hepatotoxic cyanotoxins primarily found in water, are produced by cianobacteria. On the other hand, aflatoxins (AFs), mycotoxins from Aspergillusspp., particularly AFB1, are Group 1 carcinogens (IARC) and regulated by the international agribusiness sector. Aiming to contribute to the control of MCs and AFs, this work presents three topics: (i) Advances in recombinant DNA technology and the development of an alternative for the biodegradation of MCs by a GRAS strain of Saccharomyces cerevisiaebased on the expression of the mlrA gene codon-optimized for yeast. (ii) Characterization of the recombinant microcystinase A for MCs biodegradation. (iii) Provision of tools for controlling natural toxins, focusing on the monitoring of AFs and analysis in samples of Minas frescal cheese. In the first topic, the mlrAgene, encoding the enzyme microcystinase A, which linearizes and reduces the toxicity of MCs, was synthesized based on the genome of Sphingosinicella microcystinivoransB9 for genetic recombination and expression in S. cerevisiae. A first plasmid, containing promoter and terminator from S. cerevisiaeand a multiple cloning site, was used for expression. The second plasmid, containing homologous regions for the URA3 locus, was used for chromosomal integration of mlrA. Successful plasmid expression and chromosomal integration of the gene were confirmed by PCR. The recombinant yeast with plasmidial expression of mlrAbiodegraded 69.6% (205 ng/mL) of MCs in 72 hours and 83% (267 ng/mL) in 120 hours of cultivation, proving this biotechnological alternative was effective. In the following experiment (topic ii), the activity of microcystinase A generated from the first experiment was evaluated. Initially, different methods for cell wall lysis were tested to obtain an enzyme-concentrated extract. Enzyme kinetics evaluation demonstrated maximum MC degradation rate of 3.09 mg/L/h and Michaelis-Menten constant of 2.81 µM. High enzymatic activity was observed at neutral pH and temperatures ranging from 35-57.5°C. Alkaline pH and temperatures >65°C inactivated the enzyme. Optimal activity conditions were pH 6.3 and 42.2°C. In summary, the generated recombinant yeast demonstrated high potential for expressing microcystinase A, providing a scientific and technological basis for advancing the biodegradation of MCs. In the last experiment (topic iii), a UPLC-FLR method was developed and validated for the simultaneous detection of AFM1and AFB1in Minas frescal cheese. The validation results were satisfactory for all parameters evaluated: linearity (R²>0.99), accuracy (mean recoveries: 81-105% for AFM1; 80-109% for AFB1), precision (RSD<18%), and low limit of quantification (0.03 µg/kg for AFM1;0.31 µg/kg for AFB1). Although none of the 20 samples of Minas Frescal cheese analyzed showed detectable levels of contamination, it is noteworthy the validated method, implemented as a surveillance tool, contributes to ensure the safety and add value to this essentially national product. Thus, this work achieved its objectives by proposing new options for controlling naturally occurring toxins in two interdependent resources—water and food—essential for human development and health. The results presented here may support advanced studies, promote practical applications, and enhance methods for controlling natural toxins, aiming to reduce the impact of these contaminants on public health
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/19736
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCA - Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
dc.subjectMicrocistinase A
dc.subjectRecombinação gênica
dc.subjectBiodegradação de microcistinas
dc.subjectAflatoxinas
dc.subjectCromatografia líquida
dc.subjectMicrocistinas
dc.subjectBiodegradação
dc.subjectDNA recombinante
dc.subjectEngenharia genética
dc.subjectSaccharomyces cerevisiae
dc.subjectSegurança alimentar
dc.subjectQueijo minas frescal
dc.subject.capesCiências Agrárias - Ciência e Tecnologia de Alimentos
dc.subject.cnpqCiências Agrárias - Ciência e Tecnologia de Alimentos
dc.subject.keywordsMicrocystinase A
dc.subject.keywordsGene recombination
dc.subject.keywordsBiodegradation of microcystins
dc.subject.keywordsAflatoxins
dc.subject.keywordsLiquid chromatography
dc.subject.keywordsMicrocystins
dc.subject.keywordsBiodegradation
dc.subject.keywordsRecombinant DNA
dc.subject.keywordsGenetic engineering
dc.subject.keywordsSaccharomyces cerevisiae
dc.subject.keywordsFood safety
dc.subject.keywordsFresh Minas cheese
dc.titleEstratégias inovadoras no controle de toxinas naturais: levedura recombinante para biodegradação de microcistinas e método para monitoramento de aflatoxinas em queijo minas frescal
dc.title.alternativeInnovative strategies on the control of natural toxins: recombinant yeast for microcystins biodegradation and method for aflatoxins monitoring in minas frescal cheese
dc.typeTese
dcterms.educationLevelDoutorado
dcterms.provenanceCentro de Ciências Agrárias

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