Avaliação de métodos de detecção, quantificação e identificação de Campylobacter spp. em carcaças de frango resfriadas

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dataload.collectionmapped01 - Doutorado - Ciência de Alimentospt_BR
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dc.contributor.advisorOliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorBenetti, Thalyta Marinapt_BR
dc.contributor.bancaAbrahão, Wanda Moscalewskipt_BR
dc.contributor.bancaKottwitz, Luciana Bill Mikitopt_BR
dc.contributor.bancaOgatta, Sueli Fumie Yamadapt_BR
dc.contributor.bancaBeloti, Vanerlipt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T14:38:19Z
dc.date.available2024-05-01T14:38:19Z
dc.date.created2014.00pt_BR
dc.date.defesa26.05.2014pt_BR
dc.description.abstractResumo: A ocorrência de infecções associadas à Campylobacter notificadas tem aumentado em muitos países desenvolvidos nos últimos 2 anos Embora existam diversas fontes, a campilobacteriose está geralmente associada ao consumo de carne de frango mal processada, e a contaminação cruzada envolvendo este produto A eficácia dos métodos convencionais de isolamento de Campylobacter em alimentos tem sido questionada e as dificuldades encontradas relacionadas à incapacidade dos antibióticos adicionados ao meio de enriquecimento de inibir os micro-organismos contaminantes e a baixa competitividade do Campylobacter frente a esses micro-organismos Os métodos moleculares, como a reação em cadeia polimerase (PCR), têm sido descritos como uma adequada estratégia para a detecção, identificação e quantificação de Campylobacter spp em alimentos Os objetivos deste estudo foram avaliar diferentes métodos de extração de DNA visando a padronização de ensaio PCR em Tempo Real para detecção e quantificação de Campylobacter em carcaças de frango; propor alternativas para melhorar a detecção e a quantificação pela técnica de cultura preconizada pela ISO 1272: 26, e a avaliar de métodos fenotípicos e genotípicos para a identificação de espécies de Campylobacter A avaliação comparativa entre o método direto (ISO 1272-2) e o de enriquecimento (ISO 1272-1) mostrou a superioridade do método direto, pela maior frequência de isolamento de Campylobacter spp e superior taxa de sensibilidade O volume da enxaguadura de 1 mL, que atualmente é recomendado pelo protocolo ISO 1272-1 para o enriquecimento, não deve ser utilizado porque volumes de 2,5 e 5, mL possibilitaram melhor isolamento de Campylobacter spp A estratégia de utilização de volumes menores que 1 µL de enxaguadura no método direto buscando minimizar a interferência da microbiota contaminante no isolamento e contagem de Campylobacter spp, não melhorou o isolamento e a contagem de colônias Os resultados confirmam que o volume de enxaguadura mais adequado para o método direto é o de 1 µL, como o preconizado na metodologia ISO 1272-2 Os resultados encontrados sugerem o cultivo adicional de 4 µL de enxaguadura porque muitas amostras de carne de frango apresentam contaminação baixa de Campylobacter, que só podem ser quantificadas e detectadas se volumes maiores forem utilizados Os métodos de identificação de espécie avaliados no presente trabalho foram provas fenotípicas convencionais, API Campy® e sistema Diversilab® As provas fenotípicas convencionais mostraram ser adequadas para a identificação dos isolados hipurato-positivos Quando os isolados não hidrolisaram o hipurato, não foi possível identificar a espécie, mesmo após sequenciamento O limite de detecção da PCR em Tempo Real padronizada foi 1,5 x 13 UFC/g e a faixa linear de amplificação de 1,5 x 13 a 2, x 17 UFC/g Dentre os métodos de extração de DNA avaliados, o de Hong et al (27) e o kit Simbios apresentaram resultados mais satisfatórios quando comparado aos métodos de Ronner e Lindmark (27) e EasyMag®, porque foram os únicos métodos que detectaram Campylobacter no limite de detecção da PCR A avaliação direta da enxaguadura da carcaça de frango pelo método de PCR em Tempo Real otimizada não foi adequada para quantificação de Campylobacter spp tendo em vista, o alto limite de detecção Desta forma, o presente trabalho recomenda o enriquecimento da enxaguadura em Caldo Bolton seguido pela PCR em Tempo Real como método mais apropriado para detectar Campylobacter spp em amostras de carne de frangopt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: The incidence of reported infections associated with Campylobacter has increased in many developed countries the last 2 years Although there are several sources, the campylobacteriosis is usually associated with the consumption of chicken meat improperly processed, and cross-contamination involving this product The effectiveness of conventional methods for isolating Campylobacter in foods has been questioned and the difficulties related to the inability of antibiotics added to the enrichment medium to inhibit contaminating microorganisms and the low competitiveness of Campylobacter against these microorganisms Molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR), have been described as an appropriate strategy for the detection, identification and quantification of Campylobacter spp in foods The objectives of this study were to evaluate different methods of DNA extraction aiming to standardize real-time PCR assay for detection and quantification of Campylobacter on chicken carcasses, propose alternatives to improve the detection and quantification by culture technique recommended by ISO 1272: 26 and to assess the phenotypic and genotypic methods for identification of Campylobacter species A comparative evaluation of the direct method (ISO 1272-2) and enrichment (ISO 1272-1) showed the superiority of the direct method, the higher frequency of isolation of Campylobacter spp and higher sensitivity rate The rinse volume of 1 mL, which currently is recommended by ISO 1272-1 protocol for enrichment, should not be used because volumes of 25 and 5 mL allow better isolation of Campylobacter spp The strategy of using less than 1 µL of rinse direct method in order to minimize the interference of microbial contaminants in isolation and enumeration of Campylobacter spp volumes, did not improve the isolation and enumeration of colonies The results confirm that the volume of rinse most suitable for the direct method is to 1 µL, as recommended in ISO 1272-2 methodology The results suggest the additional cultivation of 4 µL rinse because many samples of chicken meat have low contamination of Campylobacter, which can only be quantified if larger volumes are used The methods of identifying species evaluated in this study were conventional biochemical tests, API Campy® and DiversiLab® system Conventional biochemical tests proved to be suitable for the identification of hippurate-positive isolates When the isolates hydrolyzed hippurate, we could not identify the species, even after sequencing The detection limit of the standard real-time PCR was 15 x 13 CFU/g linear amplification range of 15 x 13 than 2x 17 CFU/g Among the methods of DNA extraction, the reviews of Hong et al (27) and the kit Simbios presented better results when compared methods Ronner and Lindmark (27) and EasyMag®, because they were the only methods that detected in Campylobacter detection limit of PCR The direct evaluation of the chicken carcass rinse method by real-time PCR was optimized not suitable for quantification of Campylobacter spp in view, the high detection limit Thus, this study recommends that the enrichment rinse in Bolton broth followed by real-time PCR is the most appropriate method to detect Campylobacter spp in samples of chicken meatpt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/14863
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência de Alimentospt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.subjectCarne de avept_BR
dc.subjectReação em cadeia de polimerasept_BR
dc.subjectInfecções por campylobacterpt_BR
dc.subjectCampylobacterpt_BR
dc.subjectCarne de avept_BR
dc.subjectPoultry as foodpt_BR
dc.subjectPolymerase chain reactionpt_BR
dc.subjectCampylobacter infectionspt_BR
dc.subjectBacterial diseasespt_BR
dc.subjectPoultry as foodpt_BR
dc.titleAvaliação de métodos de detecção, quantificação e identificação de Campylobacter spp. em carcaças de frango resfriadaspt_BR
dc.typeTesept_BR

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