Avaliação de métodos de detecção, quantificação e identificação de Campylobacter spp. em carcaças de frango resfriadas
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Resumo
Resumo: A ocorrência de infecções associadas à Campylobacter notificadas tem aumentado em muitos países desenvolvidos nos últimos 2 anos Embora existam diversas fontes, a campilobacteriose está geralmente associada ao consumo de carne de frango mal processada, e a contaminação cruzada envolvendo este produto A eficácia dos métodos convencionais de isolamento de Campylobacter em alimentos tem sido questionada e as dificuldades encontradas relacionadas à incapacidade dos antibióticos adicionados ao meio de enriquecimento de inibir os micro-organismos contaminantes e a baixa competitividade do Campylobacter frente a esses micro-organismos Os métodos moleculares, como a reação em cadeia polimerase (PCR), têm sido descritos como uma adequada estratégia para a detecção, identificação e quantificação de Campylobacter spp em alimentos Os objetivos deste estudo foram avaliar diferentes métodos de extração de DNA visando a padronização de ensaio PCR em Tempo Real para detecção e quantificação de Campylobacter em carcaças de frango; propor alternativas para melhorar a detecção e a quantificação pela técnica de cultura preconizada pela ISO 1272: 26, e a avaliar de métodos fenotípicos e genotípicos para a identificação de espécies de Campylobacter A avaliação comparativa entre o método direto (ISO 1272-2) e o de enriquecimento (ISO 1272-1) mostrou a superioridade do método direto, pela maior frequência de isolamento de Campylobacter spp e superior taxa de sensibilidade O volume da enxaguadura de 1 mL, que atualmente é recomendado pelo protocolo ISO 1272-1 para o enriquecimento, não deve ser utilizado porque volumes de 2,5 e 5, mL possibilitaram melhor isolamento de Campylobacter spp A estratégia de utilização de volumes menores que 1 µL de enxaguadura no método direto buscando minimizar a interferência da microbiota contaminante no isolamento e contagem de Campylobacter spp, não melhorou o isolamento e a contagem de colônias Os resultados confirmam que o volume de enxaguadura mais adequado para o método direto é o de 1 µL, como o preconizado na metodologia ISO 1272-2 Os resultados encontrados sugerem o cultivo adicional de 4 µL de enxaguadura porque muitas amostras de carne de frango apresentam contaminação baixa de Campylobacter, que só podem ser quantificadas e detectadas se volumes maiores forem utilizados Os métodos de identificação de espécie avaliados no presente trabalho foram provas fenotípicas convencionais, API Campy® e sistema Diversilab® As provas fenotípicas convencionais mostraram ser adequadas para a identificação dos isolados hipurato-positivos Quando os isolados não hidrolisaram o hipurato, não foi possível identificar a espécie, mesmo após sequenciamento O limite de detecção da PCR em Tempo Real padronizada foi 1,5 x 13 UFC/g e a faixa linear de amplificação de 1,5 x 13 a 2, x 17 UFC/g Dentre os métodos de extração de DNA avaliados, o de Hong et al (27) e o kit Simbios apresentaram resultados mais satisfatórios quando comparado aos métodos de Ronner e Lindmark (27) e EasyMag®, porque foram os únicos métodos que detectaram Campylobacter no limite de detecção da PCR A avaliação direta da enxaguadura da carcaça de frango pelo método de PCR em Tempo Real otimizada não foi adequada para quantificação de Campylobacter spp tendo em vista, o alto limite de detecção Desta forma, o presente trabalho recomenda o enriquecimento da enxaguadura em Caldo Bolton seguido pela PCR em Tempo Real como método mais apropriado para detectar Campylobacter spp em amostras de carne de frango
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Palavras-chave
Carne de ave, Reação em cadeia de polimerase, Infecções por campylobacter, Campylobacter, Carne de ave, Poultry as food, Polymerase chain reaction, Campylobacter infections, Bacterial diseases, Poultry as food