Efeito da suplementação com antioxidantes no cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais de fêmeas Bos taurus indicus
Data
2021-02-19
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Universidade Estadual de Londrina
Resumo
Resumo: A adição de antioxidantes no meio de cultivo in vitro de folículos ovarianos préantrais bovinos contribui para o adequado desenvolvimento dos folículos, para a manutenção da integridade folicular e do estresse oxidativo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação com antioxidantes no desenvolvimento e na manutenção da integridade folicular e do estresse oxidativo no cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais de fêmeas Bos taurus indicus. Para a realização do experimento A (Ácido Ascórbico) e do experimento B (Ácido Alfa Lipóico), ovários (n=20 e n=24, respectivamente) obtidos em abatedouro foram fragmentados e um fragmento, escolhido aleatoriamente de cada par de ovário, foi fixado em Bouin (controle não cultivado; D0). Esses fragmentos foram destinados para análise da morfologia e do crescimento folicular (histologia clássica). Um fragmento, escolhido aleatoriamente de cada par de ovário, foi congelado a -80º C (controle não cultivado; D0), para análise do estresse oxidativo (TBARS, NBT e FRAP). Os demais fragmentos foram cultivados in vitro por 6 (D6) ou 12 (D12) dias, em Meio Essencial Mínimo (MEM+) ou MEM+ suplementado com Ácido Ascórbico (50 ou 100 ng/mL) ou Ácido Alfa Lipóico (50, 100 ou 250 ng/mL), com uma matriz extracelular de gel de agarose, em estufa a 38,5º C, com ar e umidade saturada. A cada dois dias, realizou-se a troca total do meio de cultivo por meio fresco. Diferenças entre as proporções de folículos primordiais e em desenvolvimento (primário e secundário), para cada tratamento (controle não cultivado, controle cultivado e diferentes concentrações de antioxidantes testadas nos diferentes tempos), foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado e/ou teste Exato de Fisher. Na ocorrência de um efeito significativo, as proporções foram comparadas por um teste de proporção 2x2 para se estabelecer o ranking entre os tratamentos. Os dados das análises de estresse oxidativo foram submetidos à ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores foram considerados significativos quando p ≤ 0,05. No experimento A, a suplementação com 100 ng/mL (33,56%; 49/146; p < 0,0001) de Ácido Ascórbico no meio de cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais, após 6 dias de cultivo, foi a mais eficiente em promover o desenvolvimento, manter a integridade folicular e os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) estáveis. No experimento B, a suplementação com 100 ng/mL (36,88%; 52/141; p < 0,0001) de Ácido Alfa Lipóico, aos 6 dias de cultivo in vitro foi a mais eficiente em promover o desenvolvimento, manter a integridade folicular e os níveis de EROs estáveis. Conclui-se que os folículos ovarianos pré-antrais inclusos em fragmentos ovarianos bovinos, provenientes de abatedouro, podem ser cultivados in vitro ao longo de 6 dias, com meio suplementado com antioxidantes, o que permite o desenvolvimento e a manutenção da integridade folicular e níveis de espécies reativas de oxigênio estáveis.
Abstract: The addition of antioxidants in the in vitro culture medium of bovine preantral ovarian follicles contributes to the adequate development of the follicles, maintenance of follicular integrity and oxidative stress. Thus, our objective was to evaluate the effect of supplementation with antioxidants on the development and maintenance of follicular integrity and oxidative stress in the in vitro culture of preantral ovarian follicles from Bos taurus indicus females. For the experiment A (Ascorbic Acid) and experiment B (Alpha Lipoic Acid), ovaries (n=20 and n=24, respectively) obtained from a slaughterhouse were fragmented and a randomly obtained fragment from each pair of ovaries, was fixed in Bouin (non-cultivated control; D0). These fragments were submitted to the analysis of morphology and folicular growth (classical histology). A randomly obtained fragment from each pair of ovaries was frozen at - 80º C (non-cultivated control; D0) for analysis of oxidative stress (TBARS, NBT and FRAP). The other fragments were in vitro cultured for 6 (D6) or 12 (D12) days, in Minimum Essential Medium (MEM+) or MEM+ supplemented with Ascorbic Acid (50 or 100 ng/mL) or Alpha Lipoic Acid (50, 100 or 250 ng/mL), with an extracelular matrix of agarose gel, in an oven at 38.5º C, with air and saturated humidity. Every two days, 100% of the culture medium was replaced. Differences between the proportions of primordial and developing follicles (primary and secondary), for each treatment (uncultivated control, cultured control and different concentrations of antioxidants tested at different times), were analyzed using the Chi-square test and/or Exact Fisher test. In the event of a significant effect, the proportions were compared using a 2x2 proportion test to establish the ranking between treatments. The oxidative stress analysis data were submitted to ANOVA followed by the Bonferroni test. Values were considered significant when P ≤ 0.05. In experiment A, supplementation with 100 ng/mL (33.56%; 49/146; P < 0.0001) of Ascorbic Acid in the in vitro culture medium of preantral ovarian follicles, after 6 days of culture, was the most efficient in promoting development, maintaining integrity follicular and reactive oxygen species (ROS) levels stability. In experiment B, supplementation with 100 ng/mL (36.88%; 52/141; P < 0.0001) of Alpha Lipoic Acid, at 6 days of in vitro culture, was the most efficient in promoting development, maintaining folicular integrity and ROS levels stability. It is concluded that the preantral ovarian follicles included in bovine ovarian fragments, from slaughterhouse, can be grown in vitro over 6 days, with medium supplemented with antioxidants, which allows the development and maintenance of follicular integrity and levels of stable reactive oxygen species.
Descrição
Palavras-chave
Ácido alfa lipóico, Ácido ascórbico, Estresse oxidativo, Foliculogênese