Anaplasma marginale : análise da variabilidade do gene msp1 a e avaliação imunogênica da vacina de DNA contendo genes para MSP1a, MSP1b e MSP5 em camundongos BALB/c

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dc.contributor.advisorVidotto, Marilda Carlos [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorKano, Flora Satikopt_BR
dc.contributor.bancaAlfieri, Amauri Alcindopt_BR
dc.contributor.bancaGarcia, João Luispt_BR
dc.contributor.coadvisorVidotto, Odilon [Coorientador]pt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T12:51:41Z
dc.date.available2024-05-01T12:51:41Z
dc.date.created2007.00pt_BR
dc.date.defesa27.04.2007pt_BR
dc.description.abstractResumo: O Anaplasma marginale é um importante patógeno riquetsial de bovinos transmitido por carrapato que invade e se multiplica dentro de eritrócitos, causando anemia hemolítica durante a infecção aguda A imunização com proteínas de membrana externa (OMP) purificadas induz proteção contra doença aguda Das 21 OMPs descritas, seis MSPs (1a, 1b, 2-5) já foram bem caracterizadas O complexo MSP1 (MSP1a e 1b) é adesinas de eritrócitos de bovinos A MSP1a varia em tamanho pelo número de repetições in tandem de 28-29 aminoácidos Vacina de DNA contra a anaplasmose tem sido investigada usando os genes msp1a e msp1ß, e os resultados evidenciaram resposta celular e humoral em camundongos e bovinos A imunização com DNA plasmidial que codifica genes de interesse é uma tecnologia nova e promissora no desenvolvimento de vacinas Vacinas de DNA que visam múltiplos epitopos têm se mostrado mais eficientes aumentando a imunogenicidade e a proteção de animais vacinados quando comparadas com as de epitopo único Os objetivos deste trabalho foram analisar a variabilidade do gene msp1a de amostras paranaenses de A marginale, testar a capacidade dos plasmídios recombinantes expressarem MSP1a, MSP1b e MSP5 em células eucarióticas e avaliar a imunogenicidade destas vacinas administradas individualmente ou em associação, em camundongos BALB/c A análise da região repetitiva do gene msp1a identificou a presença de seis, cinco e três repetições nas amostras PR1, PR2 e PR3, respectivamente, e seis padrões de repetições inéditas Contudo, a região da MSP1a responsável pela imunogenicidade foi conservada Os plasmídios pcDNA/ msp1a, pcDNA/ msp1 ß e pcDNA/ msp5, os quais codificam os genes das MSPs sob o controle do promotor do citomegalovirus e intron A, foram construídos, multiplicados em E coli TOPO1 e purificados A expressão das proteínas MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro foi realizada em células Vero usando lipofectamina 2 e Imunofluorescência Indireta (IFA), utilizando anticorpos monoclonais Sete grupos de camundongos foram imunizados para avaliar a produção de IgG total e determinar os isotipos IgG1 e IgG2a: G1-1 mL PBS; G2-1 mg de vetor; G3- 1 mg de corpúsculos iniciais de A marginale + adjuvante de Freund; G4- 1 mg pcDNA-msp1a; G5-1 mg pcDNA-msp1b; G6-1 mg of pcDNA-msp5 e G7- pool de plasmídios (33 mg de cada plasmídio) Três semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados para avaliar a proliferação dos esplenócitos As células Vero transfectadas com plasmídios recombinantes reagiram com anticorpos monoclonais específicos, demonstrando a expressão dos genes msp IgG específica para a MSP1a e MSP5 foram detectadas tanto por ELISA quanto por Western blot Os grupos que receberam pcDNA-msp1a and pcDNA-msp5 mostraram predomínio do isotipo IgG2a, e proliferação de esplenócitos, sugerindo que estes plasmídios são bons candidatos para estimular reposta imune Th1 A associação dos três plasmídios recombinantes (pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1b and pcDNA-msp5) empregados na imunização de camundongos induziram altos títulos de anticorpos por ELISA e reagiram com todas proteínas recombinantes (rMSP1a, rMSP1b e rMSP5) de A marginale por Western blot Adicionalmente, a combinação dos plasmídios levou a uma forte proliferação de linfócitos (SI = 12, 2), enquanto o gene msp1a determinou significante proliferação significativa (SI = 2,6) e os genes msp1b e msp5 não promoveram proliferação (SI<2) Os resultados demonstraram que a associação dos plasmídios induziu a expressão das MSPs e estimulou significante produção de linfócitos T, podendo ser uma estratégia eficiente para a imunoprofilaxia da anaplasmosept_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Anaplasma marginale is an important tick-transmitted rickettsial pathogen of cattle that invades and multiplies within erythrocytes, causing severe hemolytic anemia during acute infection Immunization with purified outer membrane proteins (OMP) induces protection against acute A marginale disease Of 21 OMP described six major surface proteins (MSPs 1a, 1b, 2-5) have been well-characterized The complex MSP1 (MSP1a and 1b) is an adhesin for bovine erythrocyte, and MSP1a vary in size and sequence due to the number of tandem 28-29-amino acid repeats DNA vaccine against anaplasmosis has been investigated using the msp1a and msp1ß genes, and the results related cellular and humoral response in mice and cattle Immunization with DNA plasmids encoding antigens of interest represents a novel and promising method in vaccine research and development Multiepitope DNA vaccine is a new experience to increase immunogenicity and protection for vaccinated animal as compared in single epitope The objectives of this study were to analyze the variability of the msp1a gene of A marginale strains from Parana State, evaluate the capacity of the recombinant plasmids to express MSP1a, MSP1b, and MSP5 in eukaryotic cells, and evaluate the immunogenicity of BALB/c mice immunized with these DNA vaccines encoding MSPs of A marginale PR1 strain individually or in association The analysis of the msp1a gene identified the presence of six, five and three tandem repeats in PR1, PR2 PR3, respectively; however, the region of MSP1a responsible for immunogenicity was conserved The plasmids pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1ß and pcDNA-msp5, which encode the MSPs genes under the control of cytomegalovirus enhancer/promoter and intron A, were constructed, multiplied in TOP1 E coli and purified Expression of MSP1a, MSP1b, and MSP5 in vitro was performed into Vero cells using lipofectamine 2, following Indirect Immunofluorescen Assay (IFA) using monoclonal antibodies Seven experimental groups of mice were immunized to evaluate the production of whole IgG and to determinate IgG1 and IgG2a isotype: G1-1 ml PBS; G2-1 mg empty vector; G3-1 mg A marginale initial bodies + Freund´s adjuvant; G4-1 mg pcDNA-msp1a; G5-1 mg pcDNA-msp1b; G6-1 mg pcDNA-msp5; and G7-pool of recombinant plasmids (33 mg for each) Three weeks after the last immunization, mice were sacrified to evaluate spleen cells proliferation Vero cells transfected with recombinants plasmids reacted with specific monoclonal antibodies, demonstrating the expression of msp genes Specific IgG against MSP1a and MSP5 were detected in either by ELISA and Western blot The groups that received pcDNA-msp1a and pcDNA-msp5 exhibited predominance for IgG2a production and splenocytes proliferation, suggesting that these recombinant plasmids are good candidates for elicited T helper 1 immune response The association of three recombinant plasmids (pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1b and pcDNA-msp5) used in the immunization of mice induced high antibodies response by ELISA and reacted with all recombinant proteins (rMSP1a, rMSP1b, and rMSP5) of A marginale by Western blot Also, the combination of plasmids provide strong lymphoproliferation (SI = 12,2), whereas the genes to MSP1a provide significant splenocytes (SI = 2,6) and the genes to MSP1b and MSP5 did not provide significant proliferation (SI<2) The results showed no suppression when the recombinant plasmids were taken in association, and demonstrated that they can generate significant T-cell lymphocyte Thus, the immunization in association of recombinant plasmids encoding MSPs can be an effective strategy for immunoprofilaxy of anaplasmosispt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Ciência Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animalpt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10882
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência Animalpt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-graduação em Ciência Animalpt_BR
dc.subjectAnaplasmosept_BR
dc.subjectProteínas de membranapt_BR
dc.subjectBovinopt_BR
dc.subjectDoençaspt_BR
dc.subjectImunologia veterináriapt_BR
dc.subjectVeterinary immunologypt_BR
dc.subjectCattle - Diseasespt_BR
dc.titleAnaplasma marginale : análise da variabilidade do gene msp1 a e avaliação imunogênica da vacina de DNA contendo genes para MSP1a, MSP1b e MSP5 em camundongos BALB/cpt_BR
dc.typeTesept_BR

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