Bioferramenta analítica : produção e desenvolvimento empregando anticorpo monoclonal antiaflatoxina (hibridoma AF2 e AF4)

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dataload.collectionmapped02 - Mestrado - Ciência de Alimentospt_BR
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dc.contributor.advisorHirooka, Elisa Yoko [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorYamashita, Cássia Reika Takabayashipt_BR
dc.contributor.bancaMackinski Junior, Miguelpt_BR
dc.contributor.bancaItano, Eiko Nakagawapt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T13:19:09Z
dc.date.available2024-05-01T13:19:09Z
dc.date.created2009.00pt_BR
dc.date.defesa27.02.2009pt_BR
dc.description.abstractResumo: Aflatoxinas (AFs) constituem grupo de metabólitos secundários fúngicos de importância relevante na segurança de alimentos, com ênfase ao controle de aflatoxina B1 em commodities da cadeia produtiva agropecuária O monitoramento de micotoxinas em alimentos requer método analítico sensível, específico, exato, preciso e robusto A análise quantitativa pode ser procedida por métodos químicos (CLAE, CCD, CG) e imunoquímicos (ELISA) A coluna de imunoafinidade (CIA) emprega anticorpo específico e, constitui método de escolha para a limpeza e concentração do analito O estudo propôs cultivo de hibridoma linhagem AF2 e AF4 para produção de anticorpo monoclonal (AcM) in vitro em meio RPMI + 15 % de soro fetal bovino (SFB), assim como o mesmo meio com adição gradual de H-SFM (25, 5, 75 e 1 % H-SFM) A concentração proteica foi avaliada a 28 nm nas etapas de pós-cultivo, pós-precipitação com (NH4)2SO4 e pós-diálise A produção de AcM por hibridoma AF2 correspondeu à concentração média proteica de 2,94 mg/mL, enquanto que o hibridoma AF4 produziu 2,7 mg/mL Embora AcM produzido pelo hibridoma AF4 apresente maior especificidade para AFB1, para ensaios posteriores optou-se pelo hibridoma AF2, devido a facilidade no cultivo Maior produção de AcM por AF2 ocorreu em cultivo contendo 5, 75 e 1 % H-SFM (eletroforese e i-ELISA em dialisado pós-precipitado com (NH4)2SO4) Entre estes, o AcM produzido em 1 % de H-SFM (isento de SFB) e precipitado com saturação de 5 % de (NH4)2SO4 apresentou menor teor de interferentes, sendo portanto, o procedimento indicado para obter Ac de qualidade destinado ao desenvolvimento de bioferramentas O AcM produzido foi destinado ao desenvolvimento de ic-ELISA, que apresentou limite de detecção de 4,95 ng/g Empregando este ic-ELISA, analisou-se AFB1 em páprica (3), paçoca (2), pé de moleque (1) e milho (3), considerando que estas amostras sejam positivas em análise prévia realizada em Instituto Adolfo Lutz-SP (IAL), Kagawa University-JP (KUJ) e milho positivo pertencente ao monitoramento realizado no Norte do Paraná-BR O resultado preliminar em amostra de milho A5 indicou nível de AFB1 detectado por ic-ELISA desenvolvido (12,8 ng/g) semelhante ao valor obtido no IAL (19,2 ng/g) O mesmo pode ser inferido perante análise de milho B, uma amostra altamente contaminado perante ic-ELISA (31,66 ng/g), em relação ao valor detectado no KUJ empregando CIA-CLAE (333,4 ng/g) e coluna multifuncional-CLAE (296,45 ng/g) Contudo, principalmente nas amostras de páprica ocorreu reação falso-positivo com superestimação dos valores devido à intensa interferência de matriz, inviabilizando o uso do ic-ELISA desenvolvido para este grupo alimentar Outrossim, para viabilizar a aplicação deste ic-ELISA ainda deve-se aperfeiçoar a etapa de extração e limpeza de extrato, assim como aumentar a sensibilidade Paralelamente, introduziu-se a confecção de CIA empregando AcM produzido, sendo isso também o primeiro passo para o desafio visando montagem de imunobioferramentas da categoria de biosensores A eficiência de acoplamento do AcM antiAFB1 ao suporte Affi-Gel 1 variou de -8,3 a 8,61 %, indicando ser altamente promissor para prosseguir introduzindo a montagem de imunobiosensores Ainda assim, deve-se prosseguir para a validação de CIA desenvolvida, assim como reutilização, capeamento e estabilidade visando suporte com alta especificidade, capaz de assegurar a qualidade de produto desenvolvido A produção de AcM reduziria a dependência da importação de kits para análise de micotoxina e consequentemente, o custo da análise no controle de qualidade, constituindo em técnica alternativa indispensável na triagem de aflatoxinas em matriz alimentarpt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Aflatoxins (AFs) are a group of secondary fungal metabolites of relevant importance in food safety, with emphasis on aflatoxin B1 control in agricultural commodities in the productiveness chain The monitoring of mycotoxin in food has to be performed using sensitive, specific, reliable, precise and robust analytical methods The quantitative analysis can be carried out using chemical (HPLC, TLC, GC) and immunochemical methods (ELISA) The immunoaffinity column (CIA) prepared with specific antibody is the most suitable procedure to clean-up and concentrate the analyte Purposed were the cultivation of hybridoma strain AF2 and AF4 aiming in vitro production of monoclonal antibody (mAb) in RPMI medium + 15 % fetal calf serum (SFB), as well as the same culture medium gradually added with increasing concentration of H-SFM (25, 5, 75 and 1 % H-SFM) The protein concentration in post-cultivation, post-precipitation with (NH4)2SO4 and post-dialysis steps was monitored at 28 nm The mAb produced by hybridoma AF2, which corresponded to the average of protein level was 294 mg/mL, whereas the hybridoma AF4 produced 27 mg/mL Although the hybridoma AF4 provided highy specific anti-AFB1 mAb, further assays were performed using hybridoma AF2, due to easier cultivation Higher production of mAb by AF2 occurred in culture with 5, 75 and 1 % of H-SFM (demonstrated by i-ELISA and electrophoresis carried out in (NH4)2SO4 post-precipitated dialysate) Among these, the mAb produced in 1 % of H-SFM (SFB-free), followed by precipitation with 5 % saturated (NH4)2SO4 showed lower interferent bands Therefore, this procedure should be recommended for antibody production aiming development of biotools The ic-ELISA with detection limit of 495 ng/g was developed using this mAb, and it was applied to analyse AFB1 in paprika (3), peanut derived product paçoca (2), pé-de-moleque (1) and corn (3) They were positive samples previously analysed in Instituto Adolfo Lutz, Sao Paulo (IAL), Kagawa University, JP (KUJ); the aflatoxin positive corn belonged to the local monitoring sample in northern Paraná state-BR The preliminary data of the corn sample A5 by ic-ELISA (128 ng/g) detected AFB1 at similar level obtained in IAL (192 ng/g) The same inference could be deduced from highly contamined maize B analysed by ic-ELISA (3166 ng/g), when compared with CIA- HPLC (3334 ng/g) and multicolumn-HPLC data (29645 ng/g) performed in KUJ However, mainly the paprika samples showed false-positive reaction with overestimation due to intense matrix interference, desabling this ic-ELISA concerning analysis of such food group Nevertheless, the application of ic-ELISA in development can be feasible if extraction and clean-up step, as well as the sensitivity were improved Additionally, the manufacture of CIA prepared with mAb was challenged, which would be the first device in assembling immunobiotools of biosensor category The coupling efficiency of anti-AFB1 mAb in Affi-Gel 1 support ranged from -83 to 861 %, which point out a promising continuity of research through insertion of CIA as a device of immunobiosensor Additional improvement, as well as the validation of prepared CIA, reuse, end-capping and stability aiming highly specific support, which can assure the quality of developed product is also topic in concern The production of mAb enables the reduction of current dependence on importation of kits for mycotoxins analysis, and then the cost of analysis in food quality control, appointing as an essential alternative technique in aflatoxin screening in food matrixpt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/11674
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência de Alimentospt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.subjectAlimentospt_BR
dc.subjectMicrobiologiapt_BR
dc.subjectAflatoxinapt_BR
dc.subjectMicotoxinaspt_BR
dc.subjectMicrobiologypt_BR
dc.subjectFoodpt_BR
dc.titleBioferramenta analítica : produção e desenvolvimento empregando anticorpo monoclonal antiaflatoxina (hibridoma AF2 e AF4)pt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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